Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

In vitro mesothelial Clearance Assay at modeller av de tidlige trinnene på eggstokkreft Metastase

Published: February 17, 2012 doi: 10.3791/3888

Summary

Den mesothelial clearance analysen beskrives her utnytter fluorescensmerkede celler og time-lapse video mikroskopi for å visualisere og kvantitativt måle interaksjoner av eggstokkreft flercellede spheroids og mesothelial celle monolayers. Denne analysen modellerer de tidlige trinnene på eggstokkreft metastasering.

Abstract

Ovarian kreft er den femte største årsaken til kreft dødsfall i USA 1. Til tross for en positiv initiell respons på behandling, 70 til 90 prosent av kvinner med eggstokkreft utvikle nye metastaser, og tilbakefall er ofte dødelig to. Det er derfor nødvendig å forstå hvordan sekundære metastaser oppstår for å utvikle bedre behandlingsmetoder for middels og sent stadium eggstokkreft. Eggstokkreft metastasering oppstår når ondartede celler løsner fra den primære svulsten området og spre hele bukhulen. De spres cellene kan danne flercellede klynger, eller spheroids, som enten vil forbli fristilt, eller implantat på organer innenfor bukhulen 3 (Figur 1, Movie 1).

Alle organene i bukhulen er foret med en enkelt, sammenhengende, lag mesothelial celler 4-6 (figur 2). Men mesothelial celler er fraværende fra undersidenperitoneal tumor masser som åpenbart av elektron micrograph studier av excised menneskelige svulstvev seksjoner 3,5-7 (figur 2). Dette tyder på at mesothelial celler er ekskludert fra under tumormasse av en ukjent prosess.

Forrige in vitro eksperimenter viste at primære eggstokkreft celler feste mer effektivt å ekstracellulær matrix enn å mesothelial celler 8, og nyere studier viser at primær peritoneal mesothelial celler faktisk gir en barriere mot eggstokkreft celle adhesjon og invasjon (i forhold til heft og invasjon på underlag som ikke var dekket med mesothelial celler) 9,10. Dette ville foreslå at mesothelial celler fungere som en barriere mot eggstokkreft metastasering. De cellulære og molekylære mekanismer som eggstokkreft celler bryter denne barrieren, og utelukke mesothelium har inntil nylig, forble ukjent.

Her beskriver vi the metodikk for en in vitro metode som modeller samspillet mellom eggstokkreft celle spheroids og mesothelial celler in vivo (figur 3, Movie 2). Vår protokollen ble tilpasset fra tidligere beskrevet metoder for å analysere ovarian tumorcellelinjer interaksjoner med mesothelial monolayers 8-16, og ble først beskrevet i en rapport som viser at eggstokkene tumorceller utnytte en integrin-avhengig aktivering av myosin og trekkraft for å fremme utelukkelse av mesothelial celler fra under en svulst sfæriske legemet 17. Denne modellen tar fordel av time-lapse fluorescensmikroskopi å overvåke de to celle populasjoner i sanntid, noe som gir romlig og tidsmessig informasjon om interaksjon. De eggstokkreft celler uttrykker rød fluorescerende protein (RFP), mens de mesothelial celler uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP). RFP-uttrykke eggstokkreft celle spheroids feste til GFP-uttrykke mesothelial monolayer. Den spheroids spredning, invadere, ogtvinge mesothelial cellene til side skaper et hull i monolayer. Dette hullet er visualisert som den negative plass (svart) i GFP bildet. Arealet av hullet kan da måles til kvantitativt analysere forskjeller i clearance aktivitet mellom kontroll og eksperimentelle populasjoner av eggstokkreft og / eller mesothelial celler. Denne analysen krever bare et lite antall eggstokkreft celler (100 celler per Spheroid X 20-30 spheroids per tilstand), så det er mulig å utføre denne analysen bruker dyrebare primære tumor celleprøver. Videre kan denne analysen enkelt tilpasses for høy gjennomstrømming screening.

Protocol

1. Ovarian Cancer Cell Spheroid Formation

  1. RFP-uttrykke eggstokkreft celler dyrkes i 10% Base Medium (et egendefinert celle kultur medium med en 50:50 blanding av 199 og MCDB105, 10% inaktivert fosterutvikling bovint serum og 1% penn-strep). For å uttrykke RFP i umerkede eggstokkreft celler, transfektere cellene med et plasmid som inneholder RFP og velg for celler som uttrykker RFP. Alternativt kan virale vektorer brukes til midlertidig uttrykke fluorescerende proteiner, eller cellene kan være pre-inkuber med en rød fluorescerende celle tracker fargestoff (Invitrogen).
  2. Før dannelsen av eggstokkreft spheroids, er det nødvendig å forberede lav adhesjon 96 vel rund bunn kultur retter. Å produsere de lave vedheft kultur plater, 30μl poly-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylate i 1 ml 95% EtOH) løsning er lagt til hver brønn av en 96 brønn Corning cellekultur parabolen. De 96 brønners plater inkuberes i en 37 ° C ikke-fuktet inkubator å fordampe etanol, leaving en film av poly-HEMA på hver brønn. Dette poly-HEMA film hindrer cellene fester seg til bunnen av brønnen, tvinger cellene til å vokse i suspensjon 18. [Alternativt kan Ultra-Low vedlegg kultur plater Corning) benyttes i stedet for poly-Hema belagt retter.]
  3. Etter lav-vedheft kultur plater er forberedt, trypsinize en plate av eggstokkreft celler, pelletskaminer cellene i en tabletop sentrifuge (Heraeus) på 900 RCF i 3 minutter, Aspirer supernatanten og re-suspendere i 10% Base Medium.
  4. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
  5. Juster konsentrasjonen av cellene slik at det er 100 celler per 50μl på 10% Base Medium.
  6. Legg 50μl av jevnt suspendert utvannet cellesuspensjon til hver brønn på 96 godt poly-HEMA belagt kultur parabolen.
  7. Inkuber plate med 96 brønner i en 37 ° C cellekultur inkubator for 16 timer (denne tiden bør økes eller reduseres avhengig av hvor lang tid det tar foren bestemt cellelinje for å danne flercellede spheroids eller ønskede eksperimentelle betingelser) for å tillate eggstokkreft celler til å klynge sammen og danner en enkelt flercellet sfæriske legemet i hver brønn. Noen kreftceller kan gjennomgå apoptose i denne perioden, så det er viktig å velge en tid før induksjon av apoptose.

2. Mesothelial Cell Monolayer Formation

  1. I en celle kultur hette, pre-coat brønnene til en 6 godt glass-bunn Mattek tallerken med fibronectin ved å legge 2ml av en 5μg fibronectin / mL PBS løsning til hver brønn av fatet og ruger ved romtemperatur i 30 minutter. Den optiske kvaliteten på glass-bunner i Mattek retter mulighet for høy oppløsning mikroskopisk bildebehandling.
  2. GFP-uttrykke mesothelial celler dyrkes i 10% Base Medium. Trypsinize en plate av mesothelial celler, spinner ned i en tabletop sentrifuge (Heraeus) ved 900RPM i 3 minutter, aspirer supernatanten, og re-suspendere i 10% Base Medium. Detmesothelial celler er brukt her var allerede uttrykker GFP da de ble innhentet, men umerkede mesothelial celler kan produseres av transfecting med et plasmid som inneholder GFP cDNA, eller preincubating cellene i en grønn fluorescerende celle tracker fargestoff (Invitrogen).
  3. Etter 30 minutters fibronectin inkubering (i trinn 2.1), vaske brønner på Mattek fatet med 2ml PBS.
  4. Aspirer PBS og platen 6 x10 5 mesothelial celle per brønn i hver brønn på 6 brønnen Mattek parabolen. Inkuber Mattek fatet i en 37 ° C cellekultur inkubator natten for å tillate mesothelial cellene til å feste til parabol og danne en monolayer.

3. Mesothelial Cell Clearance Assay

  1. Bruk en pipette til å samle eggstokkreft spheroids fra 96 ​​brønner poly-HEMA belagt plate.
  2. Aspirer medium fra en brønn på 6 brønnen Mattek parabolen inneholder en mesothelial celle monolayer. Vask straks med 2ml PBS. Legg alle spheroids fra 96 ​​brønner psent til en brønn av Mattek fatet (~ 3x antallet spheroids som skal bli fotografert på kontoen for spheroids landing på den delen av fatet som ikke kan avbildes).
  3. Plasser Mattek fatet på scenen av en invertert widefield fluorescens mikroskop stand til å utføre time-lapse imaging for varigheten på minst 8 timer. Bruk en motorisert scene å avbilde flere stillinger i fatet, med flere Spheroid intercalation hendelser, i en enkelt eksperiment. Vi bruker et Nikon Ti-E Inverted Motorisert Widefield Fluorescence time-lapse mikroskop med integrert Perfect Focus System og lav [20x-0,75 numerisk apertur (NA)] forstørrelse / NA differensiallikninger interferens kontrast (DIC) optikk, en Nikon halogen transilluminator med 0,52 NA lang arbeidsavstand (LWD) kondensator, Nikon rask (<100 millisekund switching tid) eksitasjon og emisjon filtre (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter rask overførbare og epifluorescence lysbanen Smart Shutregistre, en Nikon lineær-kodet motorisert scene, en Hamamatsu ORCA-AG avkjølt charge-coupled device (CCD) kamera, en spesialbygd mikroskop inkubasjon kammer med temperatur og CO 2 kontroll, Nikon NIS-Elements AR programvare versjon 3, og en TMC vibrasjonsisolering tabellen.
  4. De eggstokkreft cellen spheroids vil bosette til bunnen av fatet og fester seg til mesothelial cellen monolayer. Samle GFP, RFP og fase bilder av 20 + Spheroid / monolayer samspill, hvert 10. minutt, etter 8 timer.
  5. De RFP-uttrykker eggstokkreft celle spheroids vil invadere til GFP-uttrykke mesothelial celle monolayer skape et hull i monolayer. Etter 8 timer, måle størrelsen på hullene ved å trekke de svarte hullene i GFP bildene ved hjelp Elements programvare (eller en annen egnet programvare, for eksempel bilde J). Normaliser hullet størrelsen til den opprinnelige sfæriske legemet størrelsen ved å dele hullet størrelse på 8 timer av størrelsen det sfæriske legemet i tilsvarende RFP bildet på tidspunktet null. I denne exrikelig, ble hullet størrelse bare målt en gang, men det kan måles flere ganger i løpet av åtte timers forsøket til bedre forstå dynamikken i intercalation.

4. Representative Resultater

I dette eksempelet, sammenlignet vi mesothelial clearance evne OVCA433 eggstokkreft celle spheroids som har svekket uttrykk for talin-1 for å kontrollere OVCA433 spheroids. OVCA433 spheroids fra hver gruppe ble lagt til en Mattek tallerken inneholder ZT mesothelial celle monolayers. Seks spheroids fra hver gruppe ble fotografert hvert 10. minutt for åtte timer (figur 4, Movie 3, Movie 4). Hullene som produseres i monolayer ved sprer spheroids ble målt og seks stillinger fra hver gruppe ble i gjennomsnitt. Figur 4 viser at den gjennomsnittlige avstanden området opprettet av talin 1 knockdown spheroids var betydelig mindre enn gjennomsnittet området skapt av kontroll spheroids, noe som tyder på at talin kreves for mesothelial klarering av OVCA433 eggstokkreft spheroids.

Figur 1
Figur 1. Ovarian kreft metastasering. Primære ovarietumorer utvikle enten fra eggstokkene overflaten epitelet eller egglederne. Kreftceller / klynger løsner fra den primære svulsten og samle seg i bukhulen. Kreftceller kan deretter aggregere å danne flercellede spheroids. Spheroids deretter legge til mesothelial celle monolayers langs bukhulen. Mesothelial cellene er ekskludert fra undersiden av vedlagte eggstokkreft sfæriske legemet, slik at spheroids å få tilgang til den underliggende basalmembranen.

Movie 1. Ovarian kreft metastasering. Klikk her for å vise film .

Figur 2
Figur 2.

Figur 3
Figur 3. Mesothelial Clearance Assay. Eggstokkreft spheroids er dannet ved å inkubere 100 RFP-uttrykke eggstokkreft celler per brønn i en poly-HEMA belagt 96 vel rund bunn kultur tallerken ved 37 ° C i 16 timer. Poly-HEMA hindrer cellene fra fester til kulturen fatet, slik at cellene til å forbli i suspensjon, og holder seg til hverandre for å danne en enkelt klynge per brønn. Mesothelial celle monolayers er utarbeidet av platekledning 6x10 5 mesothelial celler per brønn i en fibronectin belagt seks godt Mattek rett og ruger platen ved 37 ° C i 16 timer. De spheroids blir deretter overført til Mattek fatet med mesothelial monolayer og de to celle populasjoner blir fotografert hver 10 minutter til 8 timer med en Nikon Ti-E jegnverted Motorisert Widefield Fluorescence time-lapse mikroskop og Elements programvare.

Movie 2. Mesothelial Clearance Assay. Klikk her for å vise film .

Figur 4
Figur 4. Dempning av talin en uttrykk i OVCA433 spheroids avtar mesothelial klarering evne. OVCA433 spheroids (rød) med og uten dempes uttrykk for talin en fikk lov til å feste til og invadere inn en ZT mesothelial monolayer (grønn). De to celle populasjoner ble fotografert hvert 10. minutt for 8 timer med en Nikon Ti-E Inverted Motorisert Widefield Fluorescence time-lapse mikroskop og elementer programvare. Grafen viser at talin en dempingbetydelig redusert mesothelial celle clearance (kvantilregresjoner tomt med grønne striper på midler).

Movie 3. Kontroll OVCA433 spheroids (rød) invaderer inn en mesothelial monolayer (grønn). Klikk her for å vise film .

Movie 4. Dempning av talin en uttrykk i OVCA433 spheroids (rød) reduseres mesothelial (grønn) klaring evne. Klikk her for å vise film .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den "mesothelial Clearance Assay" presenteres her bruker time-lapse mikroskop for å overvåke interaksjoner av eggstokkreft flercellede spheroids og mesothelial celle monolayers, i stor romlig og tidsmessig detalj. Tidligere hadde flere grupper 8-14 brukes endepunkt analyser å vise at eggstokkreft celler feste til og invadere inn mesothelial celle monolayers. Denne analysen er unik i at den bruker fluorescensmerkede celler å skille kreftceller fra mesothelial celler, slik at dynamikken i disse to celle populasjoner kan overvåkes hele analysen. Prosessen intercalation kan visualiseres i sanntid og frekvensen av mesothelial klarering kan kvantitativt måles over tid. Bruken av timelapse mikroskopi gjør det mulig å nøye overvåke dynamikken i samspillet mellom de to celle populasjoner under forskjellige eksperimentelle forhold. I tillegg en liten prosentandel av enten mesothelial celler eller eggstokkreft ceLLS kan merkes med en tredje fluoriserende fargestoff overvåke dynamikken i enkelte celler i befolkningen. Ved å spore individuelle celler over tid, kan den retningen og hastigheten av migrasjon beregnes. For å utføre høyere oppløsning analyser av mesothelial klarering, kan total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi brukes. Hvis fokale sammenvoksninger er merket i mesothelial cellene, kan dissosiasjon fra mesothelial sammenvoksninger ved protrusive utvidelser av kreftceller overvåkes, som beskrevet i vår tidligere publikasjon 17.

Denne analysen kan brukes til å sammenligne invasjonen evne eggstokkreft celle spheroids som er genetisk eller farmakologisk modifisert for å belyse de molekylære mekanismer som eggstokkreft celle spheroids tømme mesothelial monolayer eller å identifisere små molekyl hemmere av prosessen. Videre krever analysen et svært lite antall eggstokkreft celler, så primær tumor celler fra væske eksudater kan brukes (se begrensninger nedenfor) hvis merket med preincubating cellene med cytotracker fargestoffer (Invitrogen). Analysen er også mottagelig for høy gjennomstrømming analyse. For å utføre høy gjennomstrømning genetiske eller farmakologiske studier, kan de eggstokkreft celler bli tilført med ulike siRNA vektorer eller behandlet med ulike farmakologiske hemmere i hver brønn på 96-brønnen plate. Mesothelial celle monolayers kan belagt i 96 vel glassbunn kultur retter, og spheroids kan overføres 01:01 fra poly-Hema belagte plater til de monolayer-holdige plater. Alle disse trinnene kan være optimalisert for bruk med screening roboter slik at hundrevis av siRNAs eller hemmere kan screenes på en gang.

En av styrkene til denne analysen er å kunne modellere kraft-avhengig intercalation av eggstokkreft celler i mesothelial monolayer. Laboratoriet brukes trekkraft mikroskopi (TFM) å bestemme om mekanisk FORCE regulerer mesothelial clearance 17. Vi fant at overuttrykte α5 integrin økt kontraktilitet av celler belagt på en fibronectin-belagt substrat, mens RNAi-mediert knockdown av talin, eller myosin II redusert celle kontraktilitet 17. Siden downregulation av α5 integrin, talin, eller myosin II i ovarian kreft celle spheroids også redusert mesothelial clearance, våre TFM målinger støtter ideen om at mesothelial klarering i en hendelse avhengig mobilnettet kontraktile krefter, i hvilke celler med høyere kontraktile krefter forårsaket større mesothelial klaring. Derfor kan mesothelial klarering analysen brukes til å ytterligere forstå intercalation hendelser, knyttet til ovarial sfæriske legemet metastasering, som er avhengige av mekaniske krefter.

Denne analysen har noen begrensninger for å vurdere. Først, for å danne de flercellede spheroids, må cellene dyrkes i suspensjon i minst 6 timer. Dersomcellene ikke klarer å overleve uten matrise kontakte sin klarering evne vil bli kompromittert. For det andre er det en fordel å bruke eggstokkreft celler som danner uniform, kompakte flercellede spheroids. Hvis eggstokkreft celler bare danne løse klynger, kan de bryte fra hverandre i overføringen fra polyHEMA-belagt plate til fatet inneholder mesothelial monolayer, skaper spheroids av forskjellige former og størrelser som vil legge variasjon til dataene. Tredje, hvis cellene som brukes er heterogene, vil dette legge ytterligere variasjon i størrelsene på hull skapt i monolayer. Det er viktig å bruke flere replikatmålinger brønner (10-20/sample) på grunn av variasjon i omfanget av intercalation etter åtte timer. I de analysene som er beskrevet her, var veletablert eggstokkreft (OVCA433) og mesothelial (ZT) cellelinjer som brukes. For å gjøre denne analysen mer klinisk relevant, kan primære eggstokkreft celler, fra ascites væske av pasienter, skal brukes. Det ville være interessant å determIne om in vitro mesothelial celle clearance evne korrelerer med klinisk utfall. Begrensningene ovenfor er spesielt viktig å vurdere når du bruker primære prøver, som antall primærsøkere celler tilgjengelig er en begrensende faktor. I tillegg er det viktig å sjekke integriteten til mesothelial monolayer før du utfører denne analysen. Den mesothelial monolayer kan festes og farges for celle-celle krysset proteiner for å sikre at mesothelial celle veikryss er intakt.

Endelig kan det mesothelial klarering analysen enkelt endres til å svare på konkrete eksperimentelle spørsmål. Her brukte vi fibronectin som ECM-komponenten som gjør at eggstokkene og mesothelial celler til å følge de glassbunn kultur retter, derimot, kan andre ECM komponenter brukes herunder kollagen og laminin. Videre kan andre celletyper som er funnet under basalmembranen, inkludert fibroblaster, legges til denne eksperimentelle systemet, for å vurdere rolleav disse celletypene i mesothelial clearance 9,19,20. Til slutt kan interaksjoner med andre typer kreftceller (f.eks bukspyttkjertelen, bryst, etc) med mesothelial celler også bli modellert ved hjelp av denne analysen. Og det er mulig å studere samspillet mellom kreftceller og en endotelial monolayer, bruker denne analysen, for å etterligne intravasation eller bloduttredelse (Lignende analyser er beskrevet i: 15,16,21-27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Nikon Imaging Center ved Harvard Medical School, spesielt Jennifer Waters, Lara Petrak og Wendy Laks, for opplæring og bruk av deres timelapse mikroskoper. Vi ønsker også å takke Rosa Ng og Achim Besser for verdifulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant 5695837 (til M. Iwanicki) og GM064346 til JSB, av en bevilgning fra Dr. Miriam og Sheldon Adelson G. medisinske forskningsstiftelse (til JSB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OVCA433 Ovarian Cancer Cells Gift from Dr. Dennis Slamon
ZT Mesothelial Cells Gift from Dr. Tan Ince
Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 19950
MCDB105 Cell Applications Inc. 117-500
FBS-heat inactivated GIBCO, by Life Technologies 10082
Pen-Strep GIBCO, by Life Technologies 15070
96 well plates Corning 3799
Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) Sigma-Aldrich 192066-25G For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH
EtOH Pharmco-AAPER 111ACS200 Dilute to 95% in dH20
Cell culture hood Nuaire NU-425-300
Tissue culture incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. 3110
incubator for poly-HEMA plates Labline Instruments Imperial III 305
Tabletop centrifuge Heraeus Instruments 75003429/01
6 well glass-bottom dish MatTek Corp. P06G-1.5-20-F
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141-1MG
PBS Cellgro 21-040-CV
Microscope Nikon Instruments Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System
Lens Nikon Instruments 20X-0.75 numerical apeture
Halogen transilluminator Nikon Instruments 0.52 NA long working distance condenser
Excitation and emission filters Chroma Technology Corp. GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50
Transmitted and Epifluoresce light path Sutter Instrument Co. Smart Shutters
Linear-encoded motorized stage Nikon Instruments
Cooled charged-coupled device camera Hamamatsu Corp. ORCA-AG
Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control Custom Made
Vibration isolation table TMC
NIS-Elements software Nikon Instruments Version 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
  3. Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  4. Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
  5. Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
  6. Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
  7. Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
  8. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
  9. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  10. Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
  11. Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
  12. Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
  13. Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 Forthcoming.
  14. Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
  16. Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
  17. Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
  18. Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
  19. Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
  20. Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
  21. Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
  22. Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
  23. Brandt, B. 3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
  24. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
  25. Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
  26. Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
  27. Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).

Tags

Medisin eggstokkreft Metastase, mesothelial Spheroid
<em>In vitro</em> mesothelial Clearance Assay at modeller av de tidlige trinnene på eggstokkreft Metastase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P.,More

Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (60), e3888, doi:10.3791/3888 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter