Summary
(आईटीपी) isotachophoresis एक मजबूत electrokinetic और विष का पता लगाने से नमूना तैयार करने के लिए आवेदन लेकर साथ preconcentration तकनीक अलग है. जुदाई और छोटे अणुओं और सेल संस्कृति lysate से nucleic एसिड के शुद्धिकरण का पता लगाने: हम आईटीपी की शारीरिक सिद्धांतों और दो विशिष्ट उदाहरण के अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक को लागू करने की कार्यप्रणाली की समीक्षा.
Protocol
1. आईटीपी की भौतिकी
आईटीपी तरह चार्ज आयनों के बीच एक तेज चलती सीमा रूपों. इस तकनीक में ऋणयानी या धनायनित नमूनों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन हम दर्जी ऋणयानी आईटीपी के लिए इस परिचय और ध्यान दें कि एक ही सिद्धांतों धनायनित आईटीपी के लिए लागू होते हैं. हम ले और ते है कि इस तरह ले आयनों अधिक परिमाण प्रभावी electrophoretic गतिशीलता है buffers के लिए चुनते हैं. प्रभावी electrophoretic गतिशीलता μ = यू / ई, बिजली के क्षेत्र लागू, ई, और आयन बहाव वेग, यू के बीच लगातार समानता है 13 हम ले और ते के बीच फैलाना इंटरफ़ेस की स्थापना और उच्च से एक बिजली के क्षेत्र लागू. चालकता ले कम चालकता ते क्षेत्र के लिए क्षेत्र. प्रणाली जल्दी में आईटीपी इंटरफेस में एक बिजली के क्षेत्र में मजबूत ढाल, गैर वर्दी प्रोफ़ाइल चालकता के कारण स्थापित. अपने नाम के अनुसार (ग्रीक से, "ISOs" का अर्थ है "बराबर", "takhos" "गति" का मतलब है). मैं वही, वर्दी में, ते और ले आयनों यात्राlocity, गैर वर्दी बिजली के क्षेत्र और वर्तमान के संरक्षण का एक परिणाम के रूप में (इस तथाकथित "आईटीपी हालत है, चित्रा 1 देखें).
कि ते क्षेत्र अनुभव में एक मजबूत प्रवाह बहाल फैलाना और अग्रणी क्षेत्र (और क्षेत्र में ले ते आयनों के लिए इसके विपरीत) करने के लिए वापस ले आयनों: आईटीपी इंटरफ़ेस आत्म-sharpening. नमूना आयनों इस अंतरफलक पर ध्यान केंद्रित अगर ते क्षेत्र में प्रभावी गतिशीलता ते सह आयनों के उन लोगों की तुलना में अधिक है, और अगर ले क्षेत्र में प्रभावी गतिशीलता ले सह आयनों (चित्रा 1 देखें) से भी कम है. आत्म sharpening और आईटीपी के गुणों का ध्यान केंद्रित कर इस तकनीक की मजबूती के लिए योगदान और आईटीपी अपेक्षाकृत इंटरफ़ेस (उदाहरण के लिए दबाव संचालित प्रवाह या संकुचन, विस्तार और मुड़ता के रूप में ज्यामिति में परिवर्तन के कारण) की गड़बड़ी करने के लिए असंवेदनशील है.
शिखर मोड आईटीपी (चित्रा 2 और 1-2 वीडियो देखें) में, नमूना आयन सांद्रता रहे हैंहर समय ले और ते आयन सांद्रता की तुलना में काफी कम है और इसलिए स्थानीय चालकता negligibly योगदान है. नमूना आयनों के वितरण आत्म-sharpening पड़ोसी क्षेत्रों के बीच इंटरफेस (ते और ले) और नमूना प्रभावी गतिशीलता के इन क्षेत्रों के सापेक्ष मूल्य द्वारा निर्धारित किया जाता है 14 एकाधिक नमूना आयनों ही संकीर्ण आईटीपी इंटरफ़ेस क्षेत्र के भीतर बड़े पैमाने पर ध्यान केंद्रित है. चोटियों अतिव्यापी. इंटरफ़ेस और शिखर चौड़ाई, के रूप में अच्छी तरह से जुड़े preconcentration कारक, के साथ लागू वर्तमान inversely पैमाने (चित्र 2b में प्रयोग देखें) 14.
पर्याप्त उच्च प्रारंभिक नमूना सांद्रता और पर्याप्त संचय समय के लिए, नमूना आयनों एक सीमा एकाग्रता मूल्य तक पहुँचने. पूरी तरह से ionized प्रजातियों के लिए, इस मूल्य Kohlrausch विनियमन समारोह (KRF) द्वारा निर्धारित किया जाता है कमजोर इलेक्ट्रोलाइट्स के लिए 15, Alberty और Jovin कार्यों द्वारा निर्धारित किया जाता है. 16,17 पठार मेंमोड, के रूप में चित्रा 3 और 3 वीडियो, नमूना आयनों को अलग करने और उनके प्रभावी गतिशीलता द्वारा निर्धारित क्रम में स्थानीय रूप से वर्दी और निरंतर एकाग्रता के क्षेत्रों में शुद्ध में दर्शाया गया है. बहुत पतला आयनों को अभी भी पठार क्षेत्र के बीच शिखर मोड में ध्यान केंद्रित कर सकते हैं. आईटीपी में, नमूना आयनों ते और ले (देखें चित्र 3) के बीच एक परिमित इंजेक्शन में पेश किया जा सकता है या एकांतर से ते और / या ले (चित्र 2 देखें) के साथ साथ मिलाया. हम ते क्षेत्र में अर्द्ध - अनंत "इंजेक्शन, जो analyte आयनों लगातार जमा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में मिश्रण करने के लिए देखें. निरंतर नमूना संचय दोनों चोटी और पठार मोड assays में संवेदनशीलता बढ़ जाती है. हालांकि, परिमित इंजेक्शन अधिक पठार मोड में आम हैं. यह संभावना है क्योंकि अर्द्ध अनंत इंजेक्शन में उच्च प्रारंभिक analyte सांद्रता में काफी ते चालकता और कम ध्यान केंद्रित कर दरों में वृद्धि कर सकते हैं. इसके अलावा, पूर्ण शुद्धि अर्द्ध अनंत इंजेक्शन में संभव नहीं है (के बाद से वहाँ remaआईएनएस ते में एक परिमित एकाग्रता).
2. युक्ति सफाई और तैयारी
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत assays के लिए हम एक डिजाइन अंतर - चैनल (चित्रा 1 देखें) के साथ गीला (डी आकार मोटे तौर पार अनुभाग) etched isotropically कांच microfluidic चिप्स का उपयोग करें. निम्नलिखित सफाई और तैयारी प्रोटोकॉल borosilicate और जुड़े सिलिका चैनलों के लिए अनुकूलित है, लेकिन गिलास / PDMS चिप्स के साथ भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रक्रिया सफाई के प्रयोगों के लिए पहले प्रदर्शन करने के लिए रन रन repeatability और गतिशील electroosmotic प्रवाह (उपनाम) को दबाने की जरूरत कोटिंग्स के सफल आवेदन सुनिश्चित करने के लिए. इस प्रोटोकॉल की चूक आईटीपी अंतरफलक के मजबूत फैलाव में 14. हो सकता है
- चैनल संक्रामक रोगाणुओं से मुक्त करना, 10% ब्लीच का 10-20 μL के साथ उत्तर, पूर्व, दक्षिण और जलाशयों को भरने के लिए और 2 मिनट के लिए पश्चिम जलाशय में निर्वात लागू होते हैं. अगर एक मानक कैलिपर चिप चायदान का उपयोग कर, निर्वात प्रभावी ढंग से बस attachin द्वारा लागू किया जा सकता हैजी 200 μL की विस्तृत अंत (अनफ़िल्टर्ड) के विंदुक टिप करने के लिए चिप जलाशय और एक 2 मिमी भीतरी व्यास ट्यूब वैक्यूम लाइन जोड़ने.
- जलाशयों खाली और 2 मिनट के लिए 1 एम सोडियम हीड्राकसीड के साथ चैनल (के रूप में चरण 1 में) कुल्ला. यह धीरे चैनल दीवारों etches, एक स्वच्छ सतह borosilicate उपज वर्दी सतह के गुणों को स्थापित करने में मदद.
- जलाशयों खाली और de-पानी ionized (डी) के साथ स्वच्छ, तो कुल्ला ~ 2 मिनट के लिए ले चैनल के साथ. इस अवधि के दौरान सतह गुण और गतिशील कोटिंग्स चैनल के भीतर संतुलित करना.
3. शिखर मोड आईटीपी fluorophore में ध्यान केंद्रित
- 1 एमएल 100 मिमी एचसीएल, 200 मिमी tris, और 1% PVP से मिलकर ले तैयार.
- 1 एमएल 100 मिमी HEPES के मिलकर ते और 200 मिमी tris तैयार. 1 माइक्रोन एलेक्सा 488 स्त्राव (AF488) के 10 μl साथ ते की 90 μl का मिश्रण.
- भाग 2 में ले के साथ rinsing के बाद के रूप में वर्णित है, खाली पश्चिम जलाशय और में डि साथ कुछ समय के या साफडर किसी भी जलाशय में शेष ले पतला. 20 μL ते युक्त AF488 के साथ इस जलाशय को भरें.
- पूर्व जलाशय में सकारात्मक इलेक्ट्रोड और पश्चिम जलाशय में जमीन इलेक्ट्रोड (नकारात्मक) प्लेस और 2 μA (वर्तमान निरंतर) को लागू करें. नमूना शिखर पश्चिम जलाशय से पूर्व (चित्रा 1 देखें) जलाशय और इन जलाशयों के बीच वोल्टेज में वृद्धि होगी के रूप में कम चालकता ते चैनल भरता है एक निरंतर वेग में विस्थापित होगा.
4. और सुसंस्कृत ई. से निष्कर्षण और न्यूक्लिक एसिड की शुद्धि कोलाई
चुनिंदा ऑयनिक प्रजातियों का ध्यान केंद्रित करने की क्षमता जैविक नमूने तैयार करने के लिए एक आदर्श तकनीक आईटीपी बनाता है. हम एक प्रभावी गतिशीलता परिमाण के लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड से कम लेकिन सह ईओण पीसीआर inhibitors (जैसे ऋणयानी डिटर्जेंट, प्रोटीन, और कार्बनिक सॉल्वैंट्स, भले ही हाय में वर्तमान की तुलना में अधिक के साथ एक अनुगामी आयनों का चयन करके इलाज सेल lysate से में न्यूक्लिक एसिड शुद्धgh एकाग्रता). Cationic पीसीआर inhibitors (जैसे क्षार धातुओं और cationic प्रोटीन और डिटर्जेंट) विपरीत दिशा में विस्थापित और भी पीछे छोड़ दिया जाता है. आईटीपी निकालता है और ध्यान केंद्रित नमूना जलाशय से लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड होता है, जबकि धीमी पीसीआर बाधा के पीछे प्रजातियों (चित्रा 4 देखें) छोड़ने.
- का एक नमूना या संस्कृति ई. प्राप्त करें घनत्व 10 8 से अधिक CFU / एमएल कोलाई कोशिकाओं.
- 6 मिनट के लिए 4000g पर centrifugation द्वारा microcentrifuge सुरक्षित लॉक ट्यूब और गोली में 1 एमएल सेल संस्कृति स्थानांतरण.
- 80 μL RNase मुक्त पानी में गोली फिर से निरस्त करने और एजेंट 10 मिमी tricine के 10 बीआईएस tris मिमी, 2 मिमी EDTA, 0.1% ट्राइटन एक्स, और 5 मिलीग्राम / एमएल lysozyme है से मिलकर lysing की 10 μL जोड़ें. धीरे मिश्रण और 5 मिनट के लिए सेते हैं. कमरे के तापमान पर (lysing Bercovici एट अल से अनुकूलित प्रोटोकॉल 11.).
- 12.5 ~ lysate पीएच बढ़ा एम 1 सोडियम हीड्राकसीड के 10 μL जोड़ें. धीरे विंदुक उकसाना और जब तक नीचेसमाधान स्पष्ट हो जाता है, पर जो बात lysing पूरा हो गया है.
- Lysate की 10 μL 50 मिमी tricine के 90 μL और 100 मिमी बीआईएस - tris के साथ जुडा है. यह समाधान अब ते के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- ले के 1 एमएल 500 मिमी बीआईएस - tris, 250 मिमी एचसीएल, 1% पीवीपी, और 1X SYBR ग्रीन द्वितीय से मिलकर तैयार. ले microfluidic चिप के साथ के रूप में भाग 3 में वर्णित भरें.
- आदेश में बंद चिप विश्लेषण के लिए आईटीपी के बाद शुद्ध न्यूक्लिक एसिड निकालने के लिए, एक पीसीआर संगत ले साथ पूर्व जलाशय की सामग्री की जगह 50mm बीआईएस tris, 25 मिमी एचसीएल, और 0.1% पीवीपी युक्त. पूर्व और पश्चिम के कुओं के बीच 1000 वी लागू करने के लिए प्रयोग शुरू. इन जलाशयों के बीच वर्तमान में कमी होगी.
- प्रयोग के अंत में नमूना ले जलाशय में elutes. इस क्षालन के साथ संयोग, इस प्रणाली के लिए मौजूदा बनाम समय आम तौर पर एक पठार मूल्य (के बाद से प्रतिरोध अब ते समान चैनल के भीतर वितरित आयनों का प्रभुत्व है) तक पहुँचता है. धीरे से जलाशय मिश्रणद्वारा सामग्री pipetting दोहराया और RT-पीसीआर मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक 5 μL मात्रा निकालने.
5. दृश्य के लिए एमिनो एसिड की धनायनित पठार मोड आईटीपी और गैर ध्यान केंद्रित ट्रेसर (NFT) के साथ जुदाई
आईटीपी के लिए अलग और ते और ले के बीच आसपास के और detectable पठारों में छोटे आयनों ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह पता लगाने और स्थानीय चालकता, यूवी absorbance, तापमान संवेदन, या अपवर्तन के सूचकांक के रूप में भौतिक गुणों पर आधारित पहचान की अनुमति देता है. यहाँ हम एक गैर ध्यान केंद्रित ट्रेसर (NFT) परख, जहां एक फ्लोरोसेंट, सह - ईओण प्रजातियों ले करने के लिए जोड़ा जाता है प्रदर्शित करता है. इस फ्लोरोसेंट प्रजातियों के ध्यान केंद्रित नहीं है, लेकिन अपनी एकाग्रता एक स्थानीय बिजली क्षेत्र के लिए adapts और जिससे शुद्ध पठार क्षेत्र के दृश्य को सक्षम बनाता है (चित्रा 5).
- 1 एमएल 100 मिमी ethanolamine मिलकर ले, 200 मिमी tricine, और 1% पीवीपी, और धनायनित की fluorophore rhodamine 6G के 100 माइक्रोन तैयार करते हैं. <li> तैयार 1 एमएल ते है 20 मिमी tris, 40 मिमी tricine के में शामिल है. 10 μL 50 मिमी arginine की प्रत्येक और 50 मिमी lysine के साथ ते का 90 μL मिश्रण के द्वारा नमूना तैयार करते हैं.
- पश्चिम में 20 μL ले और उत्तर पूर्व जलाशय में जलाशयों और नमूना बांटना. दक्षिण जलाशय में 1 मिनट के लिए निर्वात लागू करें.
- पूर्व डि के साथ अच्छी तरह कुल्ला और ते (नमूना बिना ते) के साथ की जगह.
- पूर्व और पश्चिम के जलाशयों के बीच 500 वी लागू करें.
6. प्रतिनिधि परिणाम
हम चित्रा और चित्रा 4 में 2b न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रयोगों में शिखर मोड प्रयोगों के isotachopherograms दिखा. एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (जैसे AF488, SYBR ग्रीन द्वितीय) के साथ शिखर मोड प्रयोगों में, समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता और एकीकृत किया जा सकता है की तुलना में मात्रात्मक एकाग्रता जानकारी प्राप्त करने के लिए एक अंशांकन वक्र के खिलाफ 12 इसके अतिरिक्त., न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रयोगों में, नमूना elute करने के लिए अनुमति दी है टी मेंले जलाशय और वह मात्रात्मक RT-पीसीआर 10,12. द्वारा विश्लेषण के लिए एक विंदुक के साथ निकाली हम चित्रा 5 में एमिनो एसिड जुदाई के लिए पठार मोड isotachopherograms बताते हैं. प्रतिदीप्ति तीव्रता (ले या ते क्षेत्र तीव्रता के लिए) क्षेत्र की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि क्षेत्र चौड़ाई quantitation सक्षम.
चित्रा 1 Isotachophoresis. (आईटीपी) electrokinetic संवेदनशील पता लगाने और आयनों की जुदाई के लिए microfluidic अनुप्रयोगों में तकनीक का इस्तेमाल किया है. आईटीपी जुदाई, चयनात्मक ध्यान केंद्रित, और preconcentration क्षमताओं प्रदान करता है. इसके अलावा, यह अत्यंत मजबूत है और अपनी स्वयं-sharpening प्रकृति की वजह से शारीरिक गड़बड़ी करने के लिए असंवेदनशील है. नमूना आयनों (ले) प्रमुख और अनुगामी (ते) इलेक्ट्रोलाइट और एक निरंतर गति से ले क्षेत्र में अग्रणी आयनों की गति से निर्धारित microchannel के माध्यम से यात्रा के बीच चुनिंदा ध्यान केंद्रित. नमूना आयनोंध्यान केंद्रित अगर उनके प्रभावी electrophoretic गतिशीलता ले और ते आयनों की प्रभावी गतिशीलता द्वारा bracketed है. योजनाबद्ध मॉडल आईटीपी प्रयोग है जहाँ नमूना ले और ते क्षेत्रों के बीच लगातार ध्यान केंद्रित दर्शाया गया है.
चित्रा 2. "शिखर मोड" आईटीपी में नमूना आयनों ध्यान केंद्रित पतला. ) दो अलग जलमिश्रित (नमूना ग << ग ले) गठन ले ते और क्षेत्रों के बीच इंटरफेस में शिखर मोड में ध्यान केंद्रित प्रजातियों. केवल ले और ते बिजली के क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, के रूप में नमूना प्रजातियों में काफी वर्तमान में योगदान नहीं है. नमूना आयनों ते (एक इंजेक्शन अर्द्ध अनंत में) के साथ मिश्रित कर रहे हैं और आईटीपी इंटरफेस में एक लगभग गाऊसी शिखर में एक साथ ध्यान केंद्रित. ध्यान केंद्रित कसौटी (असमानताओं के रूप में दिखाया गया है) दृढ़ता से ionized प्रजातियों के लिए लागू होता है. ख) एलेक्सा Fluor 488 (AF488) दिखा प्रयोग शिखर मोड में लागू धाराओं की एक श्रृंखला के लिए ध्यान केंद्रित (भी वी देखनाएक विचारधारा). नमूना शिखर चौड़ाई inversely आनुपातिक वर्तमान (नगण्य advective electroosmotic प्रवाह की वजह से फैलाव के लिए) है. 14 स्वयं-sharpening इंटरफ़ेस दबाव संचालित प्रवाह (2 वीडियो देखें) के कारण फैलाव के लिए प्रतिरोधी है.
चित्रा 3. एक पर्याप्त उच्च "पठार मोड" में ध्यान केन्द्रित नमूना आयनों और स्थानीय चालकता सरकार. आम तौर पर हम ते और ले के बीच एक परिमित इंजेक्शन में नमूना आयनों परिचय. इस साधन में, नमूना अलग आयनों और उनके प्रभावी electrophoretic गतिशीलता (3 वीडियो देखें) के अनुसार आदेश. दृढ़ता से ionized प्रजातियों के लिए, ते और पठार क्षेत्र सांद्रता Kohlrausch विनियमन समारोह (KRF, ले क्षेत्र से एक अपरिवर्तनीय शुरू में सेट) के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. पतला आयनों पठार क्षेत्र bracketing उनके प्रभावी गतिशीलता के बीच शिखर मोड में ध्यान केंद्रित करने के लिए जारी है. ग ध्यान केंद्रितriterion (असमानताओं के रूप में दिखाया गया) दृढ़ता से ionized प्रजातियों के लिए लागू होता है.
चित्रा 4 शिखर मोड आईटीपी के साथ तैयारी और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण lysate. न्यूक्लिक एसिड ई. से निकाला जाता है कोली सेल संस्कृति lysozyme की सहायता क्षारीय lysing का उपयोग और चयनात्मक electrophoretic द्वारा शुद्ध आईटीपी के माध्यम से ध्यान केंद्रित. ते lysate साथ मिश्रित (भूरे रंग का) लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड (हरा), प्रोटीन, और संभावित पीसीआर बाधा chemistries के शामिल हैं. अनुगामी और प्रमुख आयनों का उचित चयन चयनात्मक सक्षम बनाता है जबकि पीसीआर inhibitors के पीछे छोड़ने के लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड का ध्यान केंद्रित है. कुल न्यूक्लिक एसिड आईटीपी शिखर अक्सर एक गैर आदर्श आकार पर ले जाता है, के रूप में बैठाना छवि में यहाँ दिखाया. इस परख के एक प्रदर्शन के रूप में, हम ग्राम - नकारात्मक जीवाणुओं से कुल न्यूक्लिक एसिड निकाले, Escherichia कोलाई (सोडियम हीड्राकसीड समाधान के साथ अकेले lysed), lysate से शुद्ध एनए आईटीपी का उपयोग करने, एकत्रआनुवंशिक सामग्री को निकाला, और qRT-पीसीआर विश्लेषण प्रदर्शन 16S rRNA (लाल) और बैक्टीरियल संस्कृति से 16S rDNA (हरा) के सफल शुद्धि की पुष्टि. 16S rRNA (नीला) और 16S rDNA (पीला) के लिए नकारात्मक नियंत्रण सीमा चक्र प्रत्येक ऊपर 30 चक्र थे. हम qRT-पीसीआर प्रदर्शन पावर SYBR आरएनए सी टी 1 कदम आगे 150 एनएम (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) के और रिवर्स प्राइमरों (CGCCCTC 5'-CACAAAGTGGTAAG) के साथ एप्लाइड Biosystems से सिफारिश की साइकिल थर्मल की स्थिति में, किट ग्रीन का उपयोग.
5 चित्रा गैर unlabeled एमिनो एसिड की जुदाई और पता लगाने के लिए ट्रेसर परख (NFT) ध्यान केंद्रित. a) NFT परख के योजनाबद्ध. नमूना आयनों की एक परिमित इंजेक्शन पूर्व चैनल में शुरू की है. हम एक ट्रेसर धनायनित की fluorophore साथ प्रभावी गतिशीलता ते (μ दरियाफ्त <μ ते) के आयनों से कम के साथ मिश्रण ले. fluorophoreएक "underspeeding दरियाफ्त" के रूप में कार्य करने के लिए कहा है. के रूप में की fluorophore अब नमूना पठारों और ते द्वारा कब्जा क्षेत्र में ले से electromigrates, यह एक उच्च बिजली के क्षेत्र और इस तरह अपनी एकाग्रता बढ़ जाती है अनुभव. एकाग्रता में यह परिवर्तन isotachopherogram में कदम बनाता है. ख) दो एमिनो एसिड arginine और लाइसिन, पृथक्करण underspeeding फ्लोरोसेंट अनुरेखक के रूप में rhodamine 6G के साथ NFT परख का उपयोग कर. ते और arginine के बीच मामूली शिखर आईटीपी में आम है, अच्छी तरह से समझ नहीं है, और यहाँ का पता लगाने या बढ़ाता पठारों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.
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Discussion
आईटीपी तरीकों प्रस्तुत यहाँ तेजी से, संवेदनशील, और मजबूत और ईओण अणुओं का पता लगाने से निपटने के लिए सक्षम. आईटीपी का उपयोग करने में मुख्य चुनौती ले और ते बफ़र्स का उचित विकल्प है. Anionic आईटीपी में, हम आम तौर पर अग्रणी आयनों के रूप में क्लोराइड चुन क्योंकि यह बहुत उच्च पूर्ण गतिशीलता के साथ एक मजबूत एसिड है और इस प्रकार बहुत उम्मीद के मुताबिक गुण है. इसलिए, ऋणयानी आईटीपी में बफर पसंद आमतौर पर एक उचित ते और counterion के चुनने के लिए कम है. चयनात्मक ध्यान केंद्रित प्रयोगों के लिए, ते पसंद contaminating के आयनों का बहिष्कार करने के लिए महत्वपूर्ण है. अनुप्रयोगों में जहां contaminants के मौजूद नहीं हैं, कम ते प्रभावी गतिशीलता ध्यान केंद्रित की तेज दर की ओर जाता है. हम निम्नलिखित का उपयोग करने की सलाह देते हैं, अपेक्षाकृत ते आयनों ऋणयानी अच्छी तरह से व्यवहार किया: एम ई एस, mops, HEPES, tricine है. Counterion की पसंद दोनों प्रणाली और पीएच ते प्रभावी गतिशीलता को प्रभावित करता है. आम counterions (8.1 PKA) tris और बीआईएस tris (6.4 PKA) हैं. कम या उच्च पीएच की आवश्यकता assays के लिए, हम अनुशंसा करते पिरिडीन (5.25 pKa)(9.5 PKA) क्रमशः ethanolamine. टेबल्स 1 और 2 में, ऋणयानी और cationic आईटीपी के लिए, क्रमशः, हम कई उपयोगी बफर उदाहरण संक्षेप. हम एचसीएल ऋणयानी ले और cationic ले आयन के रूप में आयन और सोडियम के रूप में लेते हैं, और हम ले बफर के 100 मिमी ईओण शक्ति मान.
पाठक ध्यान दें कि हमारे प्रोटोकॉल में बफर ईओण शक्ति (और 1-2 तालिकाओं में) हमेशा से अधिक या 10 मिमी के बराबर है. जबकि सिद्धांत में आईटीपी की भौतिकी ईओण 10 मिमी से कम शक्ति पर लागू होता है, 1 मिमी स्तर (उदाहरण के लिए पानी और वातावरण में कार्बन डाइऑक्साइड के बीच प्रतिक्रिया से कार्बोनिक एसिड) के पास प्राकृतिक contaminants अक्सर कम ईओण ताकत buffers के व्यावहारिक उपयोग की सीमा.
हम ध्यान दें कि संकेत पारगमन तंत्र इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत assays के लिए सीमित नहीं है. 5 पठार क्षेत्र शुद्ध मोड में भाग के रूप में संक्षिप्त चर्चा स्थानीय चालकता में परिवर्तन, यूवी absor के माध्यम से पता लगाया जा सकता हैbance, तापमान, अपवर्तन के सूचकांक या. हमारे अपने समूह में, हम एक विधि है जो पता लगाने और अज्ञात analytes की पहचान संवेदनशील के लिए इस्तेमाल फ्लोरोसेंट वाहक ampholytes विकसित किया है 5 शिखर मोड प्रयोगों में, विशेष जांच करने के लिए ध्यान केंद्रित analytes लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है. Oligonucleotide जांच संकरण पर अपने लक्ष्य अनुक्रम प्रतिदीप्ति - एक उदाहरण में, हम आणविक बीकन के उपयोग उच्च विशिष्टता के साथ लक्ष्य डीएनए या शाही सेना अणु का पता लगाने के 11,18.
आईटीपी दबाव संचालित प्रवाह और उपनाम की वजह से फैलाव के लिए अपेक्षाकृत मजबूत है, अत्यधिक EOF आईटीपी इंटरफेस है, जहां मतलब EOF वेग आईटीपी वेग के बराबर हो जाता है के ठहराव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 14 ऐसे मजबूत EOF. विशेष रूप से उच्च पीएच की शर्तों में होता है और कम ईओण ताकत. इस कारण से, हम अगर सुविधाजनक 100 मिमी के आदेश पर 8 या कम पीएच के साथ और ईओण शक्ति के साथ buffers के उपयोग की सलाह देते हैं. हमारे अनुभव में, PVP, borosilicate चिप्स में EOF दमन के लिए सबसे प्रभावी कोटिंग. हालांकि, उसके sieving गुण की वजह से, PVP जीनोमिक डीएनए ध्यान केंद्रित के रूप में कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है. प्रयोगों में, हम निरीक्षण PVP की कि इसके अलावा बहुत जीनोमिक डीएनए पूर्ण गतिशीलता को कम कर सकते हैं (इस मुद्दे पर जहां यह ध्यान केंद्रित नहीं करता है). इन मामलों में जैसे एक surfactant (जैसे ट्राइटन 100 एक्स) के साथ conjuction में Sigmacote silanol कोटिंग भी EOF को कम करने में प्रभावी हो सकता है 10.
| ते आयनों (-1 PKA) | ||||
| बफरन counterion (1 PKA) | एमईएस (6.10) | MOPS (7.20) | HEPES (7.50) | tricine (8.15) |
| ethanolamine (9.50) | 21.41 | 20.40 | 17.38 | 22.85 |
| Tris (८.०८) | 21.00 | 19.23 </ P> | 15.84 | 17.56 |
| बीआईएस tris (6.40) | 18.22 | 10.41 | 7.30 | 5.23 |
| पिरिडीन (5.18) | 1.01 | 3.72 | 2.42 | 1.48 |
तालिका 1. Anionic आईटीपी में समायोजित शुद्ध analyte क्षेत्र जहाँ ले 100 मिमी एचसीएल और 200 मिमी बफरिंग counterion के प्रभावी गतिशीलता परिमाण (× 10 -9 m 2 / / वी).
| ते कटियन (1 PKA) | ||||
| बफरन counterion (-1 PKA) | ethanolamine (9.50) | Tris (८.०८) | बीआईएस tris (6.40) | पिरिडीन (5.18) |
| एमईएस (6.10) | 35.57 | 21.96 | 16.39 | 10.45 |
| एमओपी एस (7.20) | 35.47 | 20.92 | 9.76 | 3.93 |
| HEPES (7.50) | 35.35 | 19.97 | 7.77 | 2.88 |
| Tricine (8.15) | 34.77 | 16.72 | 4.50 | 1.44 |
तालिका 2 धनायनित आईटीपी में समायोजित शुद्ध analyte क्षेत्र के प्रभावी गतिशीलता (× 10 -9 m 2 / वी /) परिमाण जहां ले 100 मिमी सोडियम और 200 मिमी बफरिंग counterion है.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम कृतज्ञता के DARPA द्वारा प्रायोजित माइक्रो / नैनो Fluidics बुनियादी बातों फोकस (MF3) अनुबंध संख्या N66001-10-1-4003, के तहत केंद्र से धन और DARPA के N660001-09-सी - +२०८२ के अनुदान से स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled water | GIBCO, by Life Technologies | 10977 | RNase/DNase free |
| Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt Baker Inc. | 7708 | |
| hydrochloric acid (HCl) | EMD Millipore | HX0603-4 | |
| Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences, Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
| tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
| bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| EDTA | GIBCO, by Life Technologies | AM9260G | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
| ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
| Rhodamine 6G | Acros Organics | CAS 989-38-8 | |
| L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
| Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
| Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
| Vacuum pump | Gast Manufacturing, Inc. | DOA-P104-AA | |
| Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
| Inverted epifluorescent microscope | Olympus Corporation | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
| Filter cube | Omega Engineering, Inc. | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
| Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5mL capacity |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417C | |
| Table 3. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).
- Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).
- Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. , (1976).
- Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).
- Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).
- Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).
- Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).
- Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).
- Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).
- Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).
- Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).
- Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).
- Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).
- Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).
- Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).
- Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).
- Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).
- Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. , (2011).
