On-чип изотахофореза для разделения ионов и очистки нуклеиновых кислот

Summary

Изотахофореза (ИТП) является надежным электрокинетического разделения и концентрирования техники с приложениями от токсинов обнаружения пробоподготовки. Мы рассматриваем физические принципы ИТП и методологию применения этого метода на два конкретных приложений например: разделения и обнаружения малых молекул и очистки нуклеиновых кислот из Клеточный лизат культуры.

Protocol

1. Физика ИТП

ITP является резкое подвижной границе между ионами, как заряд. Этот метод может быть выполнена с анионными или катионными образцы, но мы портной это введение в анионной ИТП и обратите внимание на те же принципы применимы к катионным ИТП. Мы выбираем LE и TE буфера, что LE ионы имеют более высокую величину эффективной электрофоретической подвижности. Эффективная электрофоретической подвижности, μ = U / E, является коэффициент пропорциональности между приложенным электрическим полем, Е и скорости дрейфа ионов, U ^13. Мы устанавливаем диффузного взаимодействия между LE и TE и применять электрическое поле, направленное от высокого проводимости LE зоны с низкой проводимостью TE зоне. Система быстро устанавливается сильный градиент электрического поля на границе ИТП, в связи с неоднородной проводимостью профиля. По его название (от греческого "ISOS" означает "равно", "takhos" означает "скорость"), Т. Л. и ионов путешествия в то же самое, равномерное верости, в результате неоднородном электрическом поле и сохранение текущего (это так называемые "ITP состояние", см. рисунок 1).

Интерфейс ИТП в самозатачивающиеся: LE ионы диффундируют в опыте TE зоны сильного восстановления потока и вернуться к ведущей зоной (и наоборот для ионов ТЕ в зону LE). Пример ионов сосредоточиться на этой границе, если их эффективная подвижность в ТЕ зоне выше, чем у Т. совместно ионов, и если их эффективная подвижность в LE зоне меньше, чем у LE со-ионов (см. рисунок 1). Самозатачивающиеся и фокусирующих свойств ИТП вклад в надежность этой техники и сделать ITP относительно нечувствительны к нарушениям интерфейс (например, из-за давления управляемых потоков или изменений в геометрии, такие как сокращение, расширение, и повороты).

В пиковом режиме ИТП (см. рис 2а и видео 1-2), концентрация образца ионав любое время значительно ниже, чем LE и TE концентрации ионов и, следовательно, способствовать пренебрежимо местных проводимости. Распределение образцов ионов определяется самозатачивающиеся интерфейс между соседними зонами (здесь TE и LE) и значение образца эффективная подвижность относительно этих зон ^14. Несколько образцов ионов сосредоточена в пределах одной узкой области, интерфейс ITP как в значительной степени перекрывающихся пиков. Интерфейс и ширины пиков, а также связанных с ними факторов концентрирования, масштаб обратно с приложенным тока (см. эксперименты на рисунке 2б) ^14.

При достаточно высокой начальной концентрации образца и достаточно времени накопления, образец ионов достигает порогового значения концентрации. Для полностью ионизованной видов, эта величина определяется функцией Кольрауша регулирования (КРФ) ^15. Для слабых электролитов, она определяется Alberty и Jovin функций. ^16,17 в платорежиме, как показано на рисунке 3, Видео 3, образец ионов разделения и очистки в зонах локально равномерная и постоянная концентрация в порядке, определяемом их эффективной мобильности. Очень разбавленным ионы могут по-прежнему сосредоточены в пиковом режиме между плато зоны. В ИТП, образцы ионы могут быть введены в конечном инъекции между TE и LE (см. Рисунок 3) или поочередно смешиваются с ТЕ-и / или LE (см. Рисунок 2). Речь идет о смешивании в ТЕ зону "полубесконечной" инъекции, которые могут быть использованы для накопления ионов анализируемого непрерывно. Непрерывное накопление образцов повышает чувствительность и в пике и анализы плато режиме. Тем не менее, конечный инъекции чаще в режиме плато. Это, вероятно, из-за высокой начальной концентрации аналита в полубесконечной инъекции могут существенно увеличить проводимость TE и нижней фокусировки ставки. Кроме того, полное очищение невозможно в полубесконечной инъекции (так как Ремамодули конечной концентрации TE).

2. Устройства очистки и подготовка

Для анализов, представленных в этом протоколе мы используем изотропно мокрого травления (примерно D-образного сечения) стекло микрожидкостных чипов с многоканальной конструкции (см. рисунок 1). Следующие очистки и подготовки протокола оптимизирован для боросиликатного и плавленый кварц каналов, но также может быть использован со стеклом / PDMS чипов. Выполнить эту процедуру очистки до экспериментов для обеспечения запуска к запуску повторяемости и успешного применения динамического покрытия необходимо, чтобы подавить электроосмотического потока (EOF). Пропуск этого протокола может привести к сильной дисперсии интерфейс ITP ^14.

1. Для обеззараживания канала, заполните Север, Восток, Юг и резервуаров с 10-20 мкл 10% гипохлоритом натрия и применение вакуума на Западе водохранилище в течение 2 мин. Если вы используете стандартный суппорт чип кэдди, вакуум может эффективно применяться просто attachinг широком конце 200 мкл (нефильтрованное) пипетки с чипом резервуар и соединяющие вакуумную линию на 2 мм внутреннего диаметра трубы.
2. Очистка водоемов и промыть канал (как в шаге 1) с 1 М гидроксида натрия в течение 2 мин. Это мягко вытравливает стенок канала, что дает чистый боросиликатного поверхность, чтобы помочь установить единые свойства поверхности.
3. Пустые водоемов и чистой деионизированной воды (DI), затем смойте канала LE для ~ 2 мин. В течение этого периода свойств поверхности и динамическое равновесие покрытий внутри канала.

3. Флуорофора фокусировки в пиковом режиме ИТП

1. Подготовить 1 мл LE, состоящий из 100 мМ HCl, 200 мМ трис, и 1% PVP.
2. Подготовить 1 мл TE, состоящий из 100 HEPES мм и 200 мм трис. Комбинат 90 мкл ТЕ с 10 мкл 1 мкМ Alexa Fluor 488 (AF488).
3. После промывки LE, как описано в Части 2, пустой резервуар Запада и чистить несколько раз в DI илидер разбавить любой LE остается в резервуаре. Заполните резервуар с 20 мкл ТЕ содержащие AF488.
4. Поместите положительного электрода в резервуаре Востока и земли (отрицательный) электрод на Западе водохранилища и нанести 2 мкА (постоянный ток). Образец пик будут мигрировать с постоянной скоростью с запада водохранилище на восток водохранилища (см. Рисунок 1), а напряжение между этими резервуарами будет увеличиваться по мере меньшей проводимостью TE заполняет канал.

4. Добыча и очистка нуклеиновых кислот из культурных E. палочки

Возможность выборочного сосредоточиться ионных делает ИТП идеальная техника для биологической подготовки образца. Мы очищаем нуклеиновых кислот из необработанных лизат ячейки, выбрав задней аниона с эффективной величиной подвижности ниже целевой нуклеиновой кислоты, но выше, чем со-ионных ингибиторов ПЦР (например, анионных моющих средств, белки, органические растворители, даже если они присутствуют в приветGH концентрации). Катионный ПЦР ингибиторов (например, щелочных металлов и катионных белков и моющих средств) мигрировать в противоположном направлении, и поэтому они также остались позади. ИТП извлекает и фокусируется целевой нуклеиновой кислоты из образца резервуар, оставляя медленнее ПЦР ингибиторов вид сзади (рис. 4).

1. Получить образец или культуры E. кишечной клетки, а плотность превышает 10 ⁸ КОЕ / мл.
2. Передача 1 мл клеточной культуры в безопасной блокировки трубки микроцентрифужных и гранул путем центрифугирования при 4000g в течение 6 мин.
3. Повторно приостановить гранул в 80 мкл РНКазы без воды и добавить 10 мкл лизирующего агента, состоящего из 10 мМ tricine, 10 мМ бис-трис, 2 мМ ЭДТА, 0,1% Triton-X и 5 мг / мл лизоцима. Тщательно перемешать и выдержать в течение 5 минут. при комнатной температуре (лизировать протокол адаптирован из Берковичи соавт. ^11).
4. Добавить 10 мкл 1 М раствора гидроксида натрия, чтобы поднять лизат рН до ~ 12.5. Осторожно привод пипеткой вверх и внизРешение становится ясно, в какой момент лизиса завершена.
5. Комбинат 10 мкл лизата с 90 мкл 50 мМ tricine и 100 мМ бис-трис. Это решение теперь может быть использован в качестве TE.
6. Подготовить 1 мл LE, состоящий из 500 мМ бис-трис, 250 мМ HCl, 1% PVP, и 1X SYBR Green II. Заполните микрофлюидных чип LE, как указано в ч. 3 ст.
7. Для того чтобы извлечь очищенных нуклеиновых кислот для офф-чипа после анализа ИТП, заменить содержимое Востока резервуар с ПЦР-совместимый LE содержащей 50 мМ бис-трис, 25 мМ HCl и 0,1% PVP. Применить 1000 В между Востоком и Западом скважин, чтобы начать эксперимент. В настоящее время между этими резервуарами будет уменьшаться.
8. В конце эксперимента образец элюируется в резервуар LE. Одновременно с этим элюирования, текущее время против этой системы, как правило выходит на плато значение (так как сопротивление в настоящее время преобладают ионы TE равномерно распределены в канале). Аккуратно перемешайте водохранилищеСодержание повторным пипетирования и извлечь 5 мкл объема для анализа количественного RT-PCR.

5. Разделение аминокислот с катионными режиме плато ИТП и без фокусировки трассирующие (NFT) для визуализации

ИТП может быть использовано для разделения и сосредоточиться малых ионов в прилегающих плато и обнаружить между TE и LE. Это позволяет обнаружения и идентификации на основе физико-химических свойств, таких как местные проводимости, УФ-поглощения, измерения температуры или показателя преломления. Здесь мы показываем, без фокусировки трассирующие (NFT), где анализ люминесцентные, со-ионных добавляется в LE. Это люминесцентные вид не фокус, но его концентрация адаптируется к местным электрическим полем, и тем самым дает возможность визуализации очищенных зон плато (см. Рисунок 5).

1. Подготовить 1 мл LE, состоящий из 100 мМ этаноламина, 200 мм tricine и 1% PVP, и 100 мкМ катионных 6G родамина флуорофора.
<LI> Подготовка 1 мл TE, состоящий из 20 мМ трис, 40 мМ tricine. Подготовка образцов путем смешивания 90 мкл ТЕ с 10 мкл каждого из 50 мМ аргинина и 50 мМ лизина.
2. Внесите 20 мкл LE на Западе и Северо водоемов и образцы на востоке водохранилище. Применение вакуума при водохранилища Южно течение 1 мин.
3. Промойте Востока и с DI и заменить TE (TE без образца).
4. Применение 500 В между Востоком и Западом водоемов.

6. Представитель Результаты

Мы покажем, isotachopherograms пик экспериментов в режиме Рисунок 2б и нуклеиновых кислот экспериментов добычи на рисунке 4. В пик экспериментов режима с флуоресцентным репортер (например, AF488, SYBR Green II), общая интенсивность флуоресценции может быть интегрирована и по сравнению с калибровочной кривой для получения количественной информации, концентрация ^12. Кроме того, в экспериментах нуклеиновых кислот добычи, проба позволила элюировать в тОн LE водохранилища и извлеченные с помощью пипетки для анализа количественного RT-PCR. ^10,12 Покажем isotachopherograms плато режиме разделения аминокислот кислоты на рисунке 5. Интенсивность флуоресценции (по отношению к LE и TE зоны интенсивности) может быть использована для идентификации зон, а зона шириной позволяют количественный.

Рисунок 1. Изотахофореза (ИТП) является электрокинетический метод, используемый в микрофлюидных приложений для чувствительного обнаружения и разделения ионов. ITP предлагает разделения, селективной фокусировка, и концентрирование возможности. Кроме того, он очень прочен и нечувствительным к физической нарушения из-за его самозатачивающиеся природы. Пример ионы выборочно сосредоточены между ведущим (LE) и конечные электролита (TE) и проходят через микроканальных при постоянной скорости определяется скоростью из ведущих ионов в зоне LE. Пример ионовфокус, если их эффективного электрофоретической подвижности, заключенные в эффективной подвижности LE и TE ионов. Схема эксперимента изображена модель ИТП, где образец непрерывно фокусируется между LE и TE зон.

Рисунок 2. Разбавить внимание образца ионами в "пиковый режим" ITP. а) два различных разбавленных (в _{образце} с << _LE) видов фокус в пиковом режиме на границе образуется между LE и TE зон. Исключительно LE и TE определения электрического поля, как образец вида не внести значительный вклад в ток. Пример ионов смешиваются с TE (в полубесконечной инъекций) и сосредоточиться вместе примерно гауссовское пика на границе ИТП. Фокусировка критерий (как показано неравенство) относится к сильно ионизированной видов. б) Эксперименты показывает Alexa Fluor 488 (AF488) сосредоточены в пиковом режиме для ряда течений прикладной (см. также Vидеологических 1). Ширина образца пика обратно пропорциональна току (для незначительной адвективного дисперсии за счет электроосмотического потока) ^14. Самозатачивающиеся интерфейс устойчив к дисперсии из-за давления управляемых потоков (см. видео 2).

Рисунок 3. Пример ионов при достаточно высокой концентрации внимания на "плато режим" и управлять локальной проводимости. Как правило, мы представить образцы ионов в конечном инъекции между TE и LE. В этой модальности, выборка отдельных ионов и порядка в соответствии с их эффективным электрофоретической подвижности (см. видео 3). Для сильно ионизированный видов, TE и плато зоны концентрации определяется функцией Кольрауша регулирования (КРФ, инвариантное множество первоначально LE зоны). Разбавленных ионов-прежнему сосредоточена в пиковом режиме между плато зоны брекетинг их эффективной мобильности. Фокусировка сriterion (показано, как неравенство) относится к сильно ионизированной видов.

Рисунок 4. Лизата подготовки и нуклеиновых кислот с пиком ИТП режиме. Нуклеиновые кислоты, извлеченные из E. палочки использованием культуры клеток лизоцимом-щелочного лизиса помощь и очищали с помощью селективного электрофоретической фокусировка через ИТП. TE смешивается с лизат (коричневый) содержит целевой нуклеиновой кислоты (зеленые), белки, и потенциальных ингибиторов ПЦР химии. Правильный выбор и заднего ведущих ионов позволяет селективного фокусировки целевой нуклеиновой кислоты, оставляя позади ПЦР ингибиторов. Всего нуклеиновой кислоты ИТП пик часто берет на себя неидеальной формы, как показано здесь на вставке изображений. В качестве демонстрации этого анализа, мы извлекли общего нуклеиновой кислоты из грам-отрицательных бактерий, кишечная палочка (лизируются с раствором гидроксида натрия в одиночку), очищенный НС лизат использования ИТП, собранныеизвлеченный генетический материал, и проводится QRT-PCR анализа для проверки успешной очистки 16S рРНК (красный) и 16S рДНК (зеленый) от бактериальной культуры. Отрицательный контроль порога циклов 16S рРНК (синий) и 16S рДНК (желтый) были каждый более 30 циклов. Мы провели QRT-ПЦР, используя мощности SYBR Green РНК-на-C _T 1-Step Kit от Applied Biosystems 150 нМ вперед (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) и обратный (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) праймеров, при рекомендуемой теплового режима езды на велосипеде.

Рисунок 5. Без фокусировки трассирующие (NFT) анализ для разделения и обнаружения немеченого аминокислот. а) Схема NFT анализа. Конечный введения образца ионов вводится в канал Востоке. Мы смешиваем LE с трассирующей катионных флуорофора эффективной мобильности ниже, чем ионы TE (μ _{трассирующими} <μ _TE). ФлуорофораГоворят, выступать в качестве "underspeeding трассирующими". Как флуорофора electromigrates от LE на зоны в настоящее время занимают плато образца и TE, он испытывает более высокую электрического поля и, следовательно, увеличения его концентрации. Это изменение в концентрации создает шаги в isotachopherogram. б) Разделение двух аминокислот, аргинин и лизин, используя NFT анализа с родамина 6G, как underspeeding флуоресцентных индикаторов. Небольшой пик между TE и аргинин является общим в ITP, не очень хорошо понимают, и здесь не мешает обнаружения или количественного плато.

Справочная Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительных кино .

Справочная Фильм 2. Щелкните здесь для просмотра дополнительных кино .

Справочная Фильм 3. Щелкните здесь для просмотра дополнительных кино .

Discussion

ИТП методы, представленные здесь, позволяют быстро, чувствительный и надежный обнаружения и обработки ионных молекул. Основной проблемой при использовании ИТП является правильный выбор LE и TE буфера. В ИТП анионные, мы обычно выбирают хлорида в качестве ведущей анионов, потому что это сильная кислота с высокой абсолютной мобильности и, следовательно, имеет очень прогнозируемыми свойствами. Таким образом, выбор буфера в анионной ИТП, как правило, сводится к выбору надлежащего TE и противоионов. Для селективного фокусировки экспериментов, Т. выбор имеет решающее значение для исключения загрязнения ионами. В случаях, когда загрязнения нет, ниже TE эффективной мобильности приводит к ускорению скорости фокусировки. Мы рекомендуем использовать следующие, относительно хорошо себя анионный TE ионов: МЧС, MOPS, HEPES, tricine. Выбор противоиона влияет как на рН системы и TE эффективной мобильности. Общие противоионов являются трис (рКа 8,1) и бис-трис (рКа 6,4). Для анализов требуется выше или ниже рН, мы рекомендуем пиридина (рКа 5,25) иэтаноламина (рКа 9,5), соответственно. В таблицах 1 и 2, для анионных и катионных ИТП, соответственно, мы суммируем несколько полезных примеров буфера. Мы HCl как анионные ION LE и натрия в качестве катионного LE ионов, и мы предполагаем, 100 мМ ионной силы буфера LE.

Читатель заметит, что сила ионного буфера в наших протоколов (и в таблицах 1-2) всегда больше или равно 10 мм. Хотя в теории физики ИТФ применяется в ионной силы ниже, чем 10 мм, природные загрязнители (например, углекислоты от реакции между водой и углекислого газа в атмосфере) около 1 мм уровне часто ограничивают практическое использование низкой ионной силы.

Отметим, что механизм передачи сигнала не ограничивается анализы, представленные в этом протоколе. Как уже говорилось вкратце в части 5, в режиме плато очищенной зоны могут быть обнаружены с помощью изменений в локальной проводимости, УФ absorbance, температуры или показателя преломления. В нашей группе, мы разработали метод, который использует флуоресцентные амфолитов носитель для чувствительного обнаружения и идентификации неизвестных аналитов. ⁵ В пик экспериментов режиме зондами могут быть использованы для обозначения сосредоточены аналитов. В одном примере, мы используем молекулярную маяки - олигонуклеотидных зондов, которые светятся при гибридизации их последовательности-мишени - для выявления ДНК мишени или молекулы РНК с высокой специфичностью ^11,18.

Хотя ITP является относительно устойчивым к дисперсии в результате давления управляемых потоков и EOF, чрезмерное EOF может привести к стагнации интерфейс ITP, где средняя скорость EOF становится равной скорости ИТП ^14. Такие сильные обрыв особенно в условиях высоких значениях рН и низкой ионной силы. По этой причине, мы рекомендуем использовать буфер с рН 8 или ниже, и с ионной силой порядка 100 мм, если удобно. По нашему опыту, ПВПНаиболее эффективным покрытием для подавления EOF в боросиликатного чипов. Однако, поскольку его просеивание свойства, ПВП, может не подходить для некоторых приложений, таких как фокусировка геномной ДНК. В экспериментах, заметим, что добавление ПВП может значительно снизить геномной ДНК абсолютной мобильности (до точки, где это не фокус). В этих случаях силанольных покрытия, такие как Sigmacote в связке с поверхностно-активных веществ (например, тритон X-100) также могут быть эффективными в снижении EOF ^10.

	TE анион (рКа 1)
Буферизация противоиона (рКа +1)	MES (6.10)	MOPS (7.20)	HEPES (7.50)	tricine (8.15)
этаноламина (9.50)	21,41	20,40	17,38	22,85
трис (8,08)	21,00	19,23 </ TD>	15,84	17,56
бис-трис (6.40)	18,22	10,41	7,30	5,23
пиридина (5.18)	1,01	3,72	2,42	1,48

Таблица 1. Эффективная величина подвижности (× 10 ^-9 м ² / В / с), скорректированной чистой зоне аналита в анионной ИТП, где LE составляет 100 мм HCl и 200 мм буферизации противоионов.

	TE катионов (рКа +1)
Буферизация противоиона (рКа 1)	этаноламина (9.50)	трис (8,08)	бис-трис (6.40)	пиридина (5.18)
MES (6.10)	35,57	21,96	16,39	10,45
МиссуриPS (7.20)	35,47	20,92	9,76	3,93
HEPES (7.50)	35,35	19,97	7,77	2,88
Tricine (8.15)	34,77	16,72	4,50	1,44

Таблица 2. Эффективная величина подвижности (× 10 ^-9 м ² / В / с), скорректированной чистой зоне аналита в катионной ИТП, где LE 100 натрия мм и 200 мм буферизации противоионов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Distilled water	GIBCO, by Life Technologies	10977	RNase/DNase free
Clorox Ultra	Clorox	02489CT
sodium hydroxide (NaOH)	Mallinckrodt Baker Inc.	7708
hydrochloric acid (HCl)	EMD Millipore	HX0603-4
Trizma base (tris)	Sigma-Aldrich	T6066
polyvinylpyrrolidone (PVP)	Polysciences, Inc.	06067	MW 1,000,000
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
Alexa Fluor 488 carboxylic acid	Invitrogen	A20000
tricine	Sigma-Aldrich	T-9784
bis-tris	Sigma-Aldrich	B4429
EDTA	GIBCO, by Life Technologies	AM9260G
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	X100
lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
SYBR Green II	Invitrogen	S7564
ethanolamine	Sigma-Aldrich	411000
Rhodamine 6G	Acros Organics	CAS 989-38-8
L-Amino Acids	Sigma-Aldrich	LAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4389986
PCR primers	Integrated DNA Technologies
Borosilicate microfluidic chip	Caliper Life Sciences	NS12A	Supplied with or without plastic caddy
Vacuum pump	Gast Manufacturing, Inc.	DOA-P104-AA
Sourcemeter	Keithley	2410	Constant current and constant voltage operation modes
Inverted epifluorescent microscope	Olympus Corporation	IX70	Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination
Filter cube	Omega Engineering, Inc.	XF115-2	Excitation/emission: blue/green
Safe-lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	022363204	1.5mL capacity
Centrifuge	Eppendorf	5417C
Table 3. Specific reagents and equipment.