Summary
Stable workflows marquage isotopique qui emploient
Abstract
Les isotopes stables sont des outils essentiels pour la spectrométrie de masse biologique. Historiquement, 18 O-isotopes stables ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes catalytiques des enzymes protéolytiques 1-3. Avec l'avènement de la spectrométrie de masse à base de protéomique, l'incorporation enzymatique catalysée de 18 atomes d'oxygène de l'eau isotopiquement enrichi stable est devenue une méthode populaire de comparer quantitativement les niveaux d'expression de protéines (revue par Fenselau et Yao 4, Miyagi et Rao 5 et Ye et al. 6). 18 O-étiquetage constitue une alternative simple et peu coûteuse aux produits chimiques (par exemple iTRAQ, ICAT) et métaboliques (par exemple les techniques de marquage SILAC) 7. En fonction de la protéase utilisée, 18 O-étiquetage peut conduire à la prise en compte d'un maximum de deux atomes d'oxygène 18 dans le groupe carboxyle C-terminal du produit de clivage 3 8. Dans notre Paléo (p-rotease un e ssisted l Abeling mploying 18 O de l'eau enrichie) l'adaptation des enzymatique 18 O-étiquetage, nous avons utilisé 50% 18 O de l'eau enrichie pour produire des signatures isotopiques distinctes. En combinaison avec haute résolution assistée par matrice ionisation par désorption laser à temps de vol tandem spectrométrie de masse (MALDI-TOF/TOF MS / MS), les enveloppes des isotopes caractéristiques peuvent être utilisées pour identifier des produits de clivage avec un degré élevé de spécificité. Nous avons précédemment ont utilisé le paléo-méthodologie pour détecter et caractériser les protéases endogènes 9 et surveiller les réactions protéolytiques 10-11. Depuis Paléo code l'essence même de la réaction de clivage protéolytique, le dispositif expérimental est enri simple et biochimiqueétapes chment de produits de clivage peut être contournée. Le paléo-méthode peut facilement être étendue à (i) des expériences suivies dans le temps qui surveillent la dynamique des réactions de clivage protéolytique et (ii) l'analyse de la protéolyse dans des échantillons biologiques complexes qui représentent des conditions physiologiques. Paléo-TimeCourse expériences permettent d'identifier les étapes de traitement de limitation de vitesse et les intermédiaires de réaction à complexes réactions protéolytiques voie. En outre, la paléo-réaction nous permet d'identifier des enzymes protéolytiques telles que la trypsine sérine-protéase qui est capable de relier ses produits de clivage et de catalyser l'incorporation d'un 18 second joint atome. Ces «double étiquetage" enzymes peuvent être utilisées pour postdigestion 18 O-étiquetage, dans laquelle les peptides sont exclusivement marqués par la réaction d'échange d'oxygène carboxyle. Notre troisième stratégie s'étend étiquetage employant 18 O de l'eau enrichie au-delà des enzymes et utilise conditions de pH acide à introduire 18 Signe isotope O-stablepératures en peptides.
Protocol
Les présentées Léo-workflows permettent l'étiquetage des isotopes stables de protéines et de peptides synthétiques digère. Ces expériences suivies dans le temps (figure 1) sont applicables aux études comparatives et quantitatives protéomique ainsi que la recherche de protéase. Chaque flux de travail se compose de deux étapes expérimentales (figure 2): A) Le temps d'échantillonnage résolu de l'respectif 18 O-isotope stable codé réaction (protéase catalysée par clivage du peptide; protéase réaction catalysée par l'échange d'oxygène carboxyle; catalyse acide échange d'oxygène carboxyle réaction) et B) l'analyse par spectrométrie de masse et la représentation graphique de 18 O à la constitution cinétique.
Les expériences TimeCourse A.
I. paléo-TimeCourse: Protéase catalysée par l'étiquetage des clivages protéolytiques
- (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM)dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C.
- (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Selon la protéase d'intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l'agent d'alkylation. Utilisez PepClean colonnes C-18 spin (Thermo) pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges (Sartorius) pour échanger les tampons pour les échantillons de protéines.
- Redissoudre / peptides / protéines change dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
- Prélever un échantillon au temps zéro point avant l'ajout de la protéase: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul alpha cyano-4-hydroxycinnamiqueacide matrice (10 mg / ml dans l'acétonitrile 50%, TFA 0,1%). Place sur un échantillon Opti-TOF plaque 384 cible MALDI (AB SCIEX) et de laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu'à sec (environ 5 min).
- Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote va être mis à incuber avec la protéase d'intérêt (ECE-1: 75 nM; trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l'enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira d'échantillon témoin. La première aliquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-étiquetage et peut être utilisé pour l'identification des peptides et des protéines, la détection des activités protéolytique et le suivi des réactions de clivage protéolytique. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est induite par la protéase, par conséquent, ni étiquetage ni clivage est prévu pour cet échantillon.
- Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de les repérer comme described à l'étape 5 à intervalles de temps qui lui semble approprie. Les conditions de réaction décrites ci-dessus sont utilisés pour surveiller une réaction protéolytique pour un maximum de quatre jours (environ 24 places). Commencer l'échantillonnage toutes les 5 min jusqu'à 30 min, puis repérer toutes les 30 minutes jusqu'à 2 heures, puis toutes les heures jusqu'à 8 heures et 8 heures, jusqu'à ce que tous les 4 jours. Produits de clivage doit apparaître dans les premières 12 heures et le substrat doit être complètement hydrolysé après 24 heures. De longues périodes d'incubation de réaction permettent de définir les produits de réaction stables qui sont discrets à partir d'intermédiaires de réaction, qui sont ensuite transformés. Selon question de recherche et de données enzyme-substrat paires, les temps de repérage et de la température d'incubation doivent être modulée pour assurer l'échantillonnage de réaction optimale.
- Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage, la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B).
II. Paléo-TimeCourse: Postdigétiquetage estion des terminaisons protéolytiques
- (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C.
- (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
- En fonction de la protéase d'intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l'agent d'alkylation. Utilisez les colonnes PepClean C-18 de spin pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges pour l'échange de tampon protéique.
- Redissoudre / échanger les produits nettoyé jusqu'à peptides / protéines dans 20 ul de tampon de réaction de protéase (par exemple la trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) et digérer avec une protéase d'intérêt à terme (par exemple la trypsine: 0,04 nM, 37 ° C, 12 h).
- Produits de clivage de nettoyage avec des colonnes PepClean C-18 spin. Cette étape mettra fin aux activités de protéases résiduelles.
- Redissoudre / échanger les produits peptidiques nettoyé dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O.
- Prélever un échantillon au temps zéro point avant l'addition d'enzyme: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul matrice de l'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans 50% d'acétonitrile, TFA à 0,1%). Tache d'échantillon sur une plaque cible MALDI et laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu'à sec (environ 5 min).
- Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote seront incubées avec la protéase d'intérêt (par exemple la trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l'enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira de contrôle. La premièrealiquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-postdigestion étiquetage et peuvent être utilisées pour la quantification de protéines et peptides. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est catalysée par la protéase, par conséquent, aucun étiquetage n'est prévu pour cet échantillon.
- Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de repérer les comme décrit dans l'étape 7.) À des intervalles de temps qui lui semble approprie. Par exemple, nous avons repéré un premier temps toutes les 5 min jusqu'à 30 min toutes les 15 min et ensuite pour surveiller la réaction de l'oxygène carboxyle échange catalysée par la trypsine.
- Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage de la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B).
III. Aleo-TimeCourse: acide catalysée par l'étiquetage des groupes carboxyle
- Incuber peptides individuels (50 nm) avec 1:1 (v / v) 18 O-eau enrichie en til présence ou l'absence (témoin) de 0,1% (v / v) d'acide trifluoroacétique finale (volume total 30 pi).
- Les produits de réaction d'échantillon par jour pendant 48 jours par co-spotting une aliquote de 0,5 ul du mélange avec 0.5μl de matrice d'acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans l'acétonitrile 50%, TFA 0,1%) directement sur une cible MALDI plaque.
- Entre les intervalles de repérage et après avoir repéré le point de temps de réaction finale soumettre plaque cible MALDI pour MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous à la section B.
B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Acquisition et analyse des données
- Les spectres de masse sont acquis sur une 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
- Avant l'analyse, l'instrument est étalonné avec un mélange de normes peptidiques (Mass Kit normes pour l'étalonnage d'AB SCIEX TOF / TOF instruments) avec une tolérance d'erreur maximale de mesure de masse de ± 50 ppm et un nombre minimal de six sommets de match.
- Spectres SM (gamme de masse400 - 4.000 m / z) sont acquises en triple en utilisant le mode ions positifs, avec une intensité laser réglable (3.400 - 3.800; taille de pas de 50) avec une plage d'intensité de crête de base acceptable de 2.000 - 45.000. Plans simples sont acquis pour les sous-spectres, avec 400 coups total / spectre, arrêtez conditions entreront en vigueur après 800 sous-spectres sont acquis (réussite ou échec) ou 400 sous-spectres critères d'acceptation de passe. Dans le cas d'échantillons à faible abondance ou en présence de complexes de milieux biologiques de l'extrémité inférieure de la plage de détection MS doit être porté à 800 m / z. En outre, il peut être nécessaire d'enlever le sel et d'autres composés qui interfèrent avec une étape de nettoyage échantillon comme décrit plus haut ou par séparation LC.
- MS fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir du logiciel 4000 Series Explorateur d'acquisition de données et importés dans notre propre système d'information de laboratoire, qui utilise le logiciel Distiller MASCOT (Matrix Science) pour le traitement spectrale et la détection de pointe. Enveloppes isotopiquessont déconvolué et 18 O à la constitution des ratios déterminés automatiquement par un algorithme similaire à celle décrite par Mason et al. 12 et adapté par notre groupe 9. Alternativement, des outils logiciels tels que ZoomQuant 13 et Viper 14, ainsi que logiciels commerciaux tels comme BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) et Mascot Distiller quantification Boîte à outils (Matrix Science) peut déconvoluer 18 O des données de type 15,16. 18 O à la constitution ratios sont exprimés en des contributions relatives des différentes espèces isotopiques peptidiques (par exemple, des peptides, contenant 16 O, 18 O 18 O ou 1 2) à l'ensemble de l'enveloppe isotopique.
- Pour chaque expérience TimeCourse, les masses moléculaires ([M + H] +) pour toutes les espèces de peptides détectés sont extraites à partir des fichiers de données associés MS et les valeurs mis en cellule à une largeur de 100 ppm en masse.
- Au moins trois [M + H] + sont configurés pour être tenus de remplir un bac. Dans le cas de substrats connus, la liste bin filtré est comparé à une liste de produits de clivage protéolytique prédite à partir de la séquence du peptide substrat en utilisant l'outil ExPASy FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) et un 200 ppm en masse acceptation tolérance aux erreurs.
- Spectres MS / MS sont acquis pour toutes les valeurs de masse de produits de coupure par l'outil prédites et des valeurs FindPept bin qui ont 18 O-incorporations qui leur sont associés. MS / MS sont acquises sur le 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer dans le réflecteur d'ions 1kV mode positif, avec une intensité laser fixe de 4200 et CID-gaz en mode hors tension. 50 tirs sont acquis selon un schéma randomisé par sous-spectres pour un total de 40 sous-spectres par endroit (ce qui donne un total de 2.000 coups / place).
- MS / MS des fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir de l'Explo 4000 Seriesrer le logiciel d'acquisition de données et importés dans notre propre système d'information de laboratoire, les pics sont détectés et MS / MS listes de pics sont associés avec les données correspondantes MS regroupées par casiers.
- Pour l'identification des peptides, MS / MS listes de pointe lancer une recherche dans la base de données SwissProt en utilisant le moteur de recherche MASCOT avec les paramètres de recherche suivants: pas de spécificité de l'enzyme, 150 ppm ion précurseur et 0,2 Da tolérances de fragments d'ions de masse.
- Identifications peptidiques peuvent en outre être validée à l'aide du logiciel Data Explorer (AB SCIEX) en confirmant les 18 caractéristiques O-incorporation tendances entre ions fragments série Y telle que décrite par Shevchenko et al. 18.
C. Préparation du Temps spectrale et 18 O à la constitution Parcelles
Parcelles de temps spectrales: MS fichiers de données (. T2D fichiers) pour chaque point de temps de réaction sont exportés à partir du logiciel Data Explorer en mode ASCII des fichiers en utilisant unmacro importés dans une analyse de données et un logiciel graphique (par exemple, en OriginLab origine) et affichés sous forme de tracés cascade (figure 3).
18 O à la constitution des parcelles: Pour chaque produit clivage du peptide mis en cellule, les contributions relatives des différentes espèces isotopiques (16 O peptidiques, 18 ou 18 O 1 O 2) sont extraits dans tous les points dans le temps de réaction et en fonction du temps (figure 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons utilisé le flux de travail paléo-TimeCourse de surveiller dynamiquement l'incorporation de 18 S-isotopes stables dans les produits de clivage de peptides générés par des enzymes protéolytiques. L'approche présentée est un outil polyvalent pour étudier les voies relativement traitement protéolytique de substrat différent et les combinaisons de protéase. En échantillonnant les réactions protéolytiques à plusieurs reprises au cours de la réaction, l'expérience paléo-TimeCourse fournit des instantanés résolues en temps de substrat et de l'abondance des produits et des détails de traitement. Co-taches avec des échantillons solution acide matrice sur une plaque cible arrête la réaction enzymatique et de la cristallisation de matrice conserve en outre la composition de l'échantillon. Par conséquent, les points de temps peuvent rétrospectivement être analysés par MALDI-TOF/TOF MS / MS après la conclusion de la réaction enzymatique. Pour s'adapter à la nature riche en données de ces flux expérimentaux, nous avons mis en place un système semi-automatique bio-informatique qui calcule 18 O-Incorporatrapports ioniques pour chaque figure peptide. 3 montre un tracé spectral représentant évolution dans le temps du traitement de peptide C Endokinin par la CEE-1. Paléo-TimeCourse données est multidimensionnelle: La vision élargie des données MS à travers la gamme entière de masse montre simultanément l'abondance du substrat peptidique ainsi que les abondances des produits peptidiques. L'arrangement temporel permet déchiffrer la séquence des événements de clivage et de déterminer quels fragments peptidiques sont produits de clivage stables. L'avez-tenu de la MS des données isotopiques révèle les enveloppes de chaque peptide et de clivage induit par 18 O-étiquetage est facilement identifiable par sa répartition isotopique caractéristique. 18 O-étiquetage permet la sélection positive des produits de clivage pour une identification ultérieure par MS / MS. Au total, l'analyse paléo-TimeCourse capture la dynamique du processus protéolytique et permet d'évaluer les sites de clivage de protéases préférées. Pourtant, un autre niveau de l'informationtion peuvent être obtenus selon le mécanisme enzymatique de la protéase utilisés. Certaines protéases telles que la trypsine sérine protéase sont capables de manière covalente reconsolidation leurs produits de clivage de peptides. . L'hydrolyse des résultats acyl-enzyme intermédiaires dans la constitution d'une seconde 18 O-atome dans le groupe carboxyle C-terminal La figure 4 montre les changements qui en résultent dans la contribution relative des différentes isotopomères au fil du temps: La réaction de clivage peptide initial obligataire résultats en une fraction de 1:1 entre le joint 16 et 18 fractions peptidiques O 1. Les résultats carboxyle d'oxygène change de réaction dans l'augmentation de la fraction 18 O 2 à 25% du taux à l'équilibre avec une diminution concomitante de la fraction 16 S. Les protéases capables de catalyser la réaction de l'oxygène carboxyle échange peut donc être utilisé pour un autre 18 O-étiquetage flux de travail, l'étiquetage des postdigestion protéolytique termini. Dans ces types d'expériences, les substrats sont d'abord digérés en l'absence de H 2 18 O, produits peptidiques nettoyé et incubées avec un nouveau lot de protéase, mais cette fois en présence de 50% de H 2 O. 18 Figure 4 montre la différences dans l'incorporation des isotopes qui peuvent être observés dans ces deux flux de production expérimentales et les différences de vitesse entre l'incorporation des substrats peptidiques individuels. Dans le workflow étiquetage postdigestion, le taux pour les 18 O-incorporations est déterminée par la réaction d'échange d'oxygène carboxyle. La vitesse de réaction dépend de la facilité de la protéase interagit avec ses produits de clivage. L'affinité pour le produit de réaction peut indirectement être utilisées pour déduire l'affinité de la protéase sur le substrat peptide d'origine. Ces informations pourraient être utiles pour déterminer les séquences peptidiques sont des substrats idéaux par exemple pour digestion trypsique dans les études de protéomique quantitative. Peptides qui sont facilement clivés et double-labellisé par la trypsine sont susceptibles d'être des peptides protéotypiques qui sont formés de manière reproductible et quantitativement, et donc parfaitement adapté pour les études de protéomique comparative.
À un pH faible, oxygènes des groupes acide carboxylique échange avec le solvant aqueux 19-20. Cette réaction peut être utilisée comme une approche alternative à la protéase catalysée par l'étiquetage des stratégies pour introduire des isotopes stables dans les peptides. Dans le Aleo-TimeCourse (catalyse acide étiquetage employant 18 O de l'eau enrichie) flux de travail, nous avons suivi l'incorporation lente de 18 atomes d'oxygène dans les peptides synthétiques. L'échange d'oxygène catalysée par un acide arrêté après la co-cristallisation avec la solution de matrice sur la plaque cible MALDI, effectivement «geler» l'état de distribution des isotopes. Nous avons utilisé l'angiotensine 1 en tant que peptide modèle et examiné son enveloppe isotopique au cours du temps (figure 5). Un apport de deux 18 atomes d'oxygène pour chaque voitureboxyl groupe a été observée. Dans les conditions expérimentales actuelles, l'acide carboxyle réaction catalysée par l'échange d'oxygène a été beaucoup plus lent que l'échange protéase catalysée 9 et atteint l'équilibre après 48 jours seulement. Cependant, l'approche Aleo offre l'avantage d'étiquetage des peptides qui ne sont pas reconnus par les protéases. En outre, les peptides incorporer multiples 18 atomes d'oxygène en fonction du nombre de chaînes latérales acides, ce qui peut entraîner une séparation complète des enveloppes isotopiques des espèces non marquées et étiquetées. Le changement de masse global fournit des informations sur le nombre de résidus acides dans un peptide donné et leur emplacement peuvent être obtenus par l'analyse des changements de fragments MS / MS de masse d'ions. 18 O-peptides marqués afficher près de comportement chromatographique identique à celui de leurs homologues non marqués, qui permet leur analyse comparative au temps d'élution identiques. En résumé, catalysée par un acide 18 O-étiquetage peut servir d'alternative aux produits chimiques, enzymatic étiquetage et métaboliques approche couramment utilisée dans la protéomique quantitative. Une application particulière de cette technique prometteuse est l'utilisation de 18 peptides O-étiquetés en tant que normes isotopes stables.
Figure 1. 18 O étiquetage basé offre une variété de flux de travail suivies dans le temps. (I) La protéase catalysée par Paléo-TimeCourse workflow permet le suivi de la dynamique des réactions de clivage protéolytique. Selon la protéase, ces réactions se traduisent par (a) seul (par exemple dans le cas de certaines métalloprotéases) ou (b) double 18 O-intégration (par exemple dans le cas de certaines sérines protéases). (II) Double 18 S-étiqueteuse tels que la trypsine peut également être utilisée dans l'étiquetage des flux de travail postdigestion, dans lequel 18-O incorporation est uniquement médiée par la protéase, catalyséecarboxyle réaction d'échange d'oxygène. (III) En revanche, le flux de travail Aleo-TimeCourse s'appuie sur les catalyse acide carboxyle réactions d'échange d'oxygène du côté peptidique acide et des groupes terminaux. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Workflows expérimentales des paléo-et-Aleo TimeCourse stratégies. A) (I) Dans une protéase catalysée paléo-TimeCourse expérience, les substrats sont mis en incubation avec une protéase en présence de H 2 18 O résultant de l'incorporation de jusqu'à 18 deux atomes d'oxygène en fonction de la protéase. (II) Dans une expérience Paléo étiquetage postdigestion, produits de clivage d'une digestion préalable sont ré-incubées avec une protéase d'intérêt à la présence de H 2 18 O. Protéases capables de double marquage (dans le workflow I) va catalyser l'incorporation de deux 18 atomes d'oxygène. (III) Dans une expérience catalysée par un acide Aleo, tous les groupes fonctionnels acides incorporer 18 O-atomes Analyse TimeCourse B):.. A intervalles réguliers, des aliquotes des mélanges réactionnels sont co-tachée de matrice sur MALDI-cibles plaques Sur MS- d'acquisition de données, des parcelles de temps spectrales des réactions de clivage de peptides ainsi que 18 O-incorporation des parcelles d'espèces peptidiques individuels sont générés et produits de clivage sont sélectionnés pour identification de la séquence MS / MS. Cliquez ici pour agrandir la figure .
pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
Figure 3. Parcelles de temps spectrales afficher la dynamique des réactions de clivage protéolytique. En traçant des spectres MS paléo-TimeCourse expériences dans un arrangement cascade, il est possible de surveiller simultanément la dégradation du substrat et l'apparition de produits de dégradation intermédiaires et finaux. Ici, le clivage du peptide bioactif C Endokinin par enzyme de conversion de l'endothéline-1 (ECE-1) est montré. Produits de clivage ont été identifiés par MS / MS et de leurs enveloppes isotopes affiché des 18 caractéristiques O-incorporation signatures (en rouge).
Figure 4. Sérine protéases telles que la trypsine médiation de l'incorporation d'un maximum de deux 18 atomes d'oxygène dans les produits de clivage des peptides. (I) > trong Dans le flux de travail basé sur l'étiquetage protéase, les résultats liaison peptidique clivage de réaction dans une seule 50% 18 O-incorporation ratio de frais générés produits de clivage de peptides (points noirs indiquent sans étiquette, rouges unique étiquetés fractions peptidiques). Protéases qui redéfinissez les accès de leurs produits de réaction (par exemple sérine protéases telles que la trypsine) catalyser l'incorporation en outre d'un deuxième atome O 18 par l'intermédiaire de la réaction d'échange oxygène carboxyle (pastilles vertes, double-fraction peptidique marqué). A l'équilibre, un label de distribution de 0.25:0.5:0.25. (Non, unique, double-libellées) est atteint (II), dans l'étiquetage de flux de travail postdigestion terminaisons protéolytique, pas de clivages liaison peptidique se produire. Au lieu de cela, l'incorporation d'un maximum de deux 18 atomes d'oxygène est exclusivement basée sur la réaction d'échange d'oxygène carboxyle. Par conséquent, 18 O-incorporation se produit uniquement avec des protéases qui redéfinissez les accès de leurs produits de clivage des peptides.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 5. Catalysée par un acide 18 O-étiquetage conduit à l'incorporation de deux 18 atomes d'oxygène par groupe carboxyle. Au cours de l'expérience, l'enveloppe isotopique de l'angiotensine-1 a subi de multiples changements de masse 2 Da (lignes en pointillés) correspondant à l'absorption de 18 atomes d'oxygène. Les sites de 18 O-intégration sont mis en évidence dans la séquence d'acides aminés (bleu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En combinant l'étiquetage des isotopes stables et la spectrométrie de masse à haute résolution dans un temps résolu manière, la méthode paléo-TimeCourse permet une analyse dynamique de la production de produits peptidiques. Le test peut être utilisé pour générer des peptides marqués par des isotopes stables pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives pour évaluer la cinétique de peptides qui protéotypiques sont générés. En outre, le Paléo-TimeCourse est conçu pour évaluer voies protéolytiques dans des conditions spécifiques, ex vivo physiologiquement pertinente conditions. Protéines, des peptides endogènes et des protéases ainsi que des peptides synthétiques et recombinants protéases peuvent être utilisés dans le workflow. En fonction de la réaction protéolytique notamment à étudier, et des conditions de dosage fois repérage peut être réglé de procéder par échantillonnage optimal du processus réactionnel. Dans notre expérience, il est utile pour ralentir les réactions protéolytiques vers le bas (par exemple en utilisant de faibles concentrations d'enzymes, salletempérature) pour permettre pratiques intervalles d'échantillonnage manuel Comme avec les autres méthodes d'étiquetage des isotopes stables, les écarts expérimentaux pour les 18 mesures du rapport O à la constitution sont petites -. typiquement moins de 5% pour les pics d'ions avec des statistiques suffisantes. Le protocole global peut être facilement adapté à d'autres formats de dosage, par exemple la projection d'un grand ensemble de substrats synthétiques ou la caractérisation de la maturation protéolytique des peptides endogènes à partir d'échantillons biologiques complexes (par exemple, les milieux de culture de cellules, liquides organiques). Nous avons déjà montré comment l'approche paléo-peut être coupé avec une étape LC-séparation, et permet de définir la composition dynamique de l'être humain peptidome salivaire 9. Signatures protéolytiques identifiés par le paléo-TimeCourse fournir des faits importants concernant la spécificité de substrat de la protéase d'intérêt. En outre, les données résolues en temps donne également des informations cinétiques. Une telle connaissance est particulièrement utile dans l'évaluation des peptides protéotypiques pour les études de protéomique quantitative, où le choix des peptides cibles reproductibles et très abondante est essentielle 21. De même, l'identification des facteurs limitatifs dans les voies protéolytiques est d'un grand intérêt pour le développement de nouveaux médicaments à base de protéase. Les protéases sont des facteurs clés dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques (par exemple, les troubles cardiovasculaires, les maladies neurodégénératives, cancers) et ces observations peuvent ouvrir de nouvelles opportunités pour des interventions thérapeutiques. Le aleo stratégie - catalysée par un acide étiquetage des groupes carboxyle - est facilement appliqué à des peptides synthétiques et endogènes pour produire des isotopes stables des normes codées. La cinétique de la réaction catalysée par un acide est beaucoup plus lente que la réaction catalysée par l'enzyme. Par conséquent, les expériences doivent être soigneusement planifié à l'avance. Aleo-TimeCourse est une alternative peu coûteuse aux produits chimiques, marquage métabolique et synthétiques méthodes actuellement utilisée dans les études de protéomique. Le processus de labellisation peuvent être surveillés afin de valider que 18 O-incorporation atteint l'équilibre, qui peut être un avantage par rapport à d'autres méthodes de marquage isotopique stable. En conclusion, les flux de travail LeO-TimeCourse décrites ici sont des outils polyvalents qui peuvent être utilisés de manière créative en termes qualitatifs et quantitatifs de nombreuses études protéomiques ainsi que la recherche de protéase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
