Summary
Стабильный изотоп маркировки рабочих процессов использования
Protocol
Представленные Лео-процессов позволяют стабильный изотоп маркировки белков дайджесты и синтетических пептидов. Эти временные Конечно экспериментов (рис. 1) применяются к сравнительной протеомики и количественные исследования, а также протеазы исследований. Каждый рабочий процесс состоит из двух экспериментальных этапов (рис. 2): а) время решен выборки соответствующих 18 O-стабильных изотопов в кодировке реакции (протеазы катализируемой расщепления пептида; протеазы-катализируемой реакции карбоксильных обмен кислорода, кислотно-катализируемых карбоксильной обмен кислорода реакции) и B) анализ методом масс-спектрометрии и графическое представление 18 O-включение кинетики.
Эксперименты А. TimeCourse
I. Палео-TimeCourse: протеазы катализируемой маркировки протеолитических раскол
- (Необязательно) дисульфидные связи белков (10 мкМ) и пептидов (250 мкм) уменьшается с DTT (конечная концентрация 2,5 мм)в 25 мМ NH 4 HCO 3 (как свежеприготовленный) путем инкубации в течение 30 мин при 50 ° С.
- (Необязательно) бесплатно цистеина алкилируют с иодацетамида (конечная концентрация 10 мМ) в 25 мМ NH 4 HCO 3 путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
- В зависимости от протеазы интерес, белка / пептида решения должны быть очищены, до удаления остатков буфера и алкилирования агента. Используйте PepClean C-18 спин столбцов (Thermo) для очистки пептидов и Vivaspin центробежные концентраторы (Sartorius) для обмена буферов для образцов белка.
- Растворяться / обмена пептидов / белков в 20 мкл буфера для реакции протеазы (ECE-1: 50 мМ MES-KOH, рН 5,5; трипсин: 25 мм NH 4 HCO 3, рН 8,0), содержащего 1:1 (объем / объем) окончательное H 2 18 O (95%, Sigma ISOTEC).
- Вывод нулевой точки отбора проб время до добавления протеазы: смешайте 0,5 мкл реакционной смеси и 0,5 мкл альфа-циано-4-гидроксикоричнойМатрица кислоты (10 мг / мл в 50% ацетонитрила, 0,1% TFA). Пятно образца на Opti-TOF 384 MALDI мишень (AB SCIEX) и оставить капель растворителя при комнатной температуре до полного высыхания (примерно 5 минут).
- Сплит реакции раствора на две аликвоты. Первый аликвоты будет инкубировали с протеазы интерес (ЕЭК-1: 75 нм; трипсин: 0,04 нм) при комнатной температуре или рекомендуемая температура для данного фермента. Вторая аликвота будет инкубировали без протеазы и будет служить контрольным образцом. Первый аликвоты представляет собой стандартный образец для протеазы катализируемой 18 O маркировки и могут быть использованы для пептидов и белков идентификации, обнаружения протеолитической деятельности и мониторинга протеолитических реакций расщепления. Вторая аликвота используется, чтобы показать, что 18 O-включение индуцированный протеазы, поэтому ни маркировки, ни декольте, как ожидается, для этого образца.
- Следуйте реакции путем удаления реакции аликвоты и кровянистые выделения их в качестве де-описанными в пункте 5 в интервалах времени, как кажется нужным. Условия реакции, описанные выше, используются для мониторинга протеолитических реакций в течение четырех дней (около 24 мест). Начало отбора проб каждые 5 мин до 30 мин, затем определить каждые 30 мин до 2 ч, затем каждый час до 8 час и каждые 8 часов до 4 дней. Расщепление продукты должны появиться в течение первых 12 ч и при нанесении должна быть полностью гидролизованных после 24 часов. Срок инкубации реакцию позволяют определить стабильные продукты реакции, которые являются дискретными от реакции промежуточных продуктов, которые подвергаются дальнейшей обработке. В зависимости от вопроса исследования и приблизительно фермент-субстратных пар, кровянистые выделения времени и температуры инкубации должны быть модулированный для обеспечения оптимального отбора проб реакции.
- После последнего момента времени реакции заметили или между расширенным интервалом кровянистые выделения, пластина MALDI цель представляется MALDI-TOF/TOF MS / MS анализа, как описано ниже (раздел B).
II. Палео-TimeCourse: Postdigestion маркировки протеолитических концах
- (Необязательно) дисульфидные связи белков (10 мкМ) и пептидов (250 мкм) уменьшается с DTT (конечная концентрация 2,5 мМ) в 25 мМ NH 4 HCO 3 (как свежеприготовленный) путем инкубации в течение 30 мин при 50 ° С.
- (Необязательно) бесплатно цистеина алкилируют с иодацетамида (конечная концентрация 10 мМ) в 25 мМ NH 4 HCO 3 путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
- В зависимости от протеазы интерес, белка / пептида решения должны быть очищены, до удаления остатков буфера и алкилирования агента. Используйте PepClean C-18 спин колонки для очистки пептидов и Vivaspin центробежные концентраторы для белка буфер обмена.
- Растворяться / обменять очищенных пептидов товаров / белков в 20 мкл буфера для реакции протеазы (например, трипсин: 25 мм NH 4 HCO 3, рН 8,0) и дайджест протеазы, представляющих интерес для завершения (например, трипсин: 0,04 нм 3;7 ° C; 12 ч).
- Очистка продуктов расщепления с PepClean C-18 спин столбцов. Этот шаг позволит устранить остаточные деятельности протеазы.
- Растворяться / обменять очищенных пептидов продукцию в 20 мкл буфера для реакции протеазы (трипсин: 25 мм NH 4 HCO 3, рН 8,0), содержащего 1:1 (объем / объем) окончательное H 2 18 O.
- Вывод нулевой точки отбора проб время до того фермента: Смешать 0,5 мкл реакционной смеси и 0,5 мкл альфа-циано-4-гидроксикоричной кислоты матрицы (10 мг / мл в 50% ацетонитрила, 0,1% TFA). Пятно образца на мишень MALDI и оставить капель растворителя при комнатной температуре до полного высыхания (примерно 5 минут).
- Сплит реакции раствора на две аликвоты. Первый аликвоты будет инкубировали с протеазы интерес (например, трипсин: 0,04 нм) при комнатной температуре или рекомендуемой температуры для конкретного фермента. Вторая аликвота будет инкубировали без протеазы и будет служить в качестве контроля. ПервыйАликвоту представляет собой стандартный образец для протеазы катализируемой 18 O-postdigestion маркировки и могут быть использованы для пептидов и белков количественной оценке. Вторая аликвота используется, чтобы показать, что 18 O-включение катализируется протеазы, поэтому нет маркировки, как ожидается, для этого образца.
- Следуйте реакции путем удаления реакции аликвоты и определение их, как описано в шаге 7.) На интервалах времени, как кажется нужным. Например, мы определили первоначально каждые 5 мин до 30 мин и каждые 15 мин после этого контролировать карбоксильной реакции обмена кислорода, катализируемой трипсином.
- После последнего момента времени реакции заметили или между расширенным кровянистые выделения интервалов пластины MALDI цель представляется MALDI-TOF/TOF MS / MS анализа, как описано ниже (раздел B).
III. Aleo-TimeCourse: кислотно-катализируемой маркировки карбоксильных групп
- Инкубируйте отдельных пептидов (50 нм) с 1:1 (объем / объем) 18 O-обогащенных вод в тОн наличии или отсутствии (контроль) 0,1% (V / V) окончательный трифторуксусной кислоты (общий объем 30 мкл).
- Примеры продуктов реакции ежедневно в течение 48 дней со-кровянистые выделения на 0,5 мкл смеси с 0.5μl альфа-циано-4-гидроксикоричной кислотой матрицей (10 мг / мл в 50% ацетонитрила, 0,1% TFA) непосредственно на целевую MALDI пластину.
- Между кровянистые выделения интервалов и после кровянистые выделения из конечной точке времени реакции представить MALDI мишень для MALDI-TOF/TOF MS / MS анализа, как описано ниже в разделе В.
B. MALDI-TOF/TOF MS / MS сбора и анализа данных
- Масс-спектры приобретенные на 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
- Перед проведением анализа, прибор откалиброван смесью пептидов стандартов (Mass комплект стандартов для калибровки AB SCIEX TOF / TOF инструменты), максимальная масса которых погрешность измерений допуск ± 50 промилле и минимальное число шесть пиков, чтобы соответствовать.
- MS спектра (диапазон масс400 - 4000 м / г), приобретенных в трех экземплярах использованием режиме положительных ионов с регулируемой интенсивности лазерного (3400 - 3800; шаг 50) с приемлемыми основной пик интенсивности диапазоне 2,000 - 45,000. Одиночные выстрелы приобретены для суб-спектров, с 400 общей кадров / спектра, остановить условия вступают в силу после 800 суб-спектры приобретенных (или не пройти) или 400 суб-спектры критерии принятия проход. В случае низкого обильные образцов или в присутствии сложных биологических фоны нижней части диапазона обнаружения MS должна быть увеличена до 800 м / г. Кроме того, это может быть необходимо для удаления соли и других мешающих соединений с шагом образца очистки, как описано выше, или путем разделения LC.
- MS файлы данных (. Сахарным диабетом 2 типа файлов) вывозимых с 4000 Series Проводник программного обеспечения сбора данных и импортировать в нашей собственной лаборатории информационной системы, которая использует MASCOT Distiller программного обеспечения (Matrix Science) для спектральной обработки и пик обнаружения. Изотопный конвертыявляются деконволюции и 18 O-включение отношений определяется автоматически с помощью алгоритма, похожий на тот, описывается Mason и соавт. 12 и адаптировать нашу группу 9. Кроме того, программные средства, такие как ZoomQuant 13 и Viper 14, а также коммерческие пакеты программного обеспечения, таких как BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) и талисман Distiller количественного Toolbox (Matrix Science) может deconvolute 18 O-тип данных 15,16. 18 O-включение отношения выражаются в относительных вкладов отдельных видов пептидов изотоп (например, пептиды, содержащий 16 O, 18 O 1 или 18 O 2) на всю изотопного конверт.
- Для каждого TimeCourse эксперимент, молекулярной массы ([M + H] +) для всех обнаруженных видов пептидов, взяты из соответствующих файлов MS данных и значения сегментирования на 100 ширина массы промилле.
- По меньшей мере три [M + H] +, которые будут доступны необходимые для заполнения корзины. В случае известных субстратов, фильтруют бен список сравнивается со списком протеолитических продуктов расщепления предсказать, исходя из последовательности пептида подложке с использованием ExPASy инструмент FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) и 200 частей на миллион массы ошибки принятия терпимости.
- MS / MS спектр приобретаемых для всех значений масс продуктов расщепления предсказано FindPept инструментом и для бен значения, которые имеют 18 O-инкорпорации связанных с ними. MS / MS данных, приобретенных на 4800 MALDI TOF / TOF анализатор в 1кВ отражатель режиме положительных ионов с фиксированной интенсивности лазерного 4200 и CID-газа в автономном режиме. 50 выстрелов приобретенные в рандомизированном картины в суб-спектров до в общей сложности 40 суб-спектров в месте (уступая в общей сложности 2000 выстрелов / место).
- MS / MS файлы данных (. Сахарным диабетом 2 типа файлов) экспортируется из серии 4000 ExploRER данных приобретение программного обеспечения и импортировать в нашей собственной информационной системы лаборатории, пики обнаружены и MS / MS пик списки, связанные с соответствующими сегментирования данных MS.
- Для идентификации пептидов, MS / MS пик списки искали против SwissProt базы данных с помощью двигателя MASCOT поиска со следующими параметрами поиска: нет фермента специфику, 150 млн иона предшественника и 0,2 Da фрагмент допуски масса иона.
- Пептиды идентификации может быть дополнительно проверены с использованием программного обеспечения Data Explorer (AB SCIEX), подтвердив, характерный 18 O-включению моделей по Y-серии осколочные ионы, как описано Шевченко и др.. 18.
С. Подготовка спектральной Время и 18 O-включение участков
Спектральных участках времени: MS файлы данных (. Сахарным диабетом 2 типа файлов) для каждой точки времени реакции на экспорт из программы Data Explorer, как ASCII-файлов с помощьюмакро-и импортируется в анализ данных и графической программного обеспечения (например, происхождение от OriginLab) и отображается в виде водопада участков (рис. 3).
18 O-включение участков: Для каждого сегментирования продуктов расщепления пептида, относительный вклад отдельных видов изотопов пептид (16 O, 18 O 1 или 18 O 2) извлекаются во всех точках времени реакции и зависимости от времени (рис. 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали Палео-TimeCourse рабочего процесса для динамического наблюдения за включение 18 O-стабильных изотопов в продуктах расщепления пептида порожденных протеолитических ферментов. Изложенный подход является универсальным инструментом для изучения сравнительно протеолитические пути обработки для различных подложки и протеазы комбинаций. Путем отбора проб протеолитических реакций неоднократно в течение реакции, Палео-TimeCourse эксперимент предоставляет временным разрешением снимков субстрата и продукта содержания и обработки информации. Co-кровянистые выделения образцов с кислым раствором матрицы на мишень останавливает ферментативных реакций и кристаллизации матрицы дальнейшем сохраняет образцы состава. Таким образом, моменты времени может ретроспективно быть проанализированы MALDI-TOF/TOF MS / MS после заключения ферментативной реакции. Для размещения данных богатая природа этих экспериментальных процессов, мы реализовали полуавтоматическая система биоинформатика, которая вычисляет 18 O-должно включать в себяионных коэффициентов для каждого пептида. рисунке 3 показана представитель спектрального участка конечно время обработки пептида Endokinin C ЕЭК-1. Палео-TimeCourse данных многомерных: расширенное представление данных MS во всем диапазоне масс одновременно показывает распространенность пептидного субстрата, а также содержания пептида продукции. Временная схема позволяет расшифровать последовательность расщепления событий и определения того, какие пептидные фрагменты являются стабильные продукты расщепления. Увеличенная в связи с MS данные показывают, изотоп конверты каждого пептида и декольте вызванного 18 O-маркировки легко определить по характерной распределение изотопов. 18 O маркировки позволяет положительные выбор продуктов расщепления для последующей идентификации MS / MS. В целом, Палео-TimeCourse анализ отражает динамику протеолитической обработки и позволяет оценить предпочтительные сайты расщепления протеазами. Еще один уровень информацииния может быть получена в зависимости от ферментативного механизма использовались протеазы. Некоторые протеазы, такие как трипсин протеазы серина способны ковалентно подменой их пептид продукты расщепления. . Гидролиза ацил-фермент промежуточных результатов в деле включения второй 18 O-атомов в C-концевой карбоксильной группой Рисунок 4 показывает результат сдвигов в относительном вкладе различных изотопомеров с течением времени: начальная пептидной связью реакции расщепления Результаты в соотношении 1:1 раскол между 16 O и 18 O 1 фракций пептидов. Карбоксильных кислородного обмена реакция приводит к увеличению на 18 O 2 фракции в соотношении 25% в равновесии с сопутствующим снижением 16-O фракции. Протеазы, способные катализировать реакции карбоксильных обмен кислорода поэтому может быть использован для дополнительных 18 О маркировке рабочий процесс, postdigestion маркировки протеолитических терМини. В этих типов экспериментов, субстраты, первоначально усваивается в отсутствие H 2 18 O, пептидные продукты очищены и инкубировали с новой партией протеазы, но на этот раз в присутствии 50% H 2 18 O. На рисунке 4 показана Различия в изотоп включения, которые можно наблюдать в этих двух экспериментальных процессов и различия в скорости включения между отдельными подложки пептида. В рабочий процесс маркировки postdigestion, ставка для 18 O-инкорпорации определяется карбоксильной реакции обмена кислорода. Скорость реакции зависит от того, насколько легко протеазы взаимодействует с продуктами расщепления. Сродство продукт реакции может косвенно использоваться для вывода близость протеазы к исходной подложки пептида. Такая информация могла бы быть полезной для определения пептидных последовательностей являются идеальным субстратом для примера для триптического дайджесты в количественных исследованиях протеомики. Peptides, которые легко расщепляются и дважды помечены трипсина, вероятно, будут proteotypic пептиды, которые воспроизводимо и количественно формируется и поэтому идеально подходит для сравнительного исследования протеомики.
При низких значениях рН, кислорода карбоксильных групп обмена с водного растворителя 19-20. Эта реакция может быть использована в качестве альтернативного подхода к протеазы катализируемой маркировки стратегии внедрения стабильных изотопов в пептидах. В Aleo-TimeCourse (кислотно-катализируемых маркировки применением 18 O обогащенной воды) рабочий процесс, мы наблюдали медленное включение 18 O-атомов в синтетических пептидов. Кислотно-катализируемых кислородный обмен остановлен после совместной кристаллизации с матрицей решение на мишень MALDI, эффективно «замораживания» состояния изотопа распределения. Мы использовали ангиотензина 1 в качестве модели пептид и исследовали его изотоп конверт с течением времени (рис. 5). Поглощение двух 18 O-атомов для каждого автомобиляboxyl группе не наблюдалось. В соответствии с действующим условиям эксперимента, кислотно-катализируемой реакции карбоксильных обмен кислорода было намного медленнее, чем протеазы катализируемой обмена 9 и достигла равновесия только после 48 дней. Тем не менее, подход Aleo имеет то преимущество, маркировка пептиды, которые не признаются протеаз. Кроме того, пептиды включать несколько 18 O-атомов в зависимости от количества кислых боковые цепи, что может привести к полное разделение изотопов конверты немеченого и маркировку вида. Общий сдвиг массы содержится информация о количестве кислотных остатков в данном пептидов и их расположение могут быть получены путем анализа MS / MS фрагмент сдвиги масса иона. 18 O-меченых пептидов отображать практически идентичные хроматографического поведения как свои немеченого коллег, которые позволяет их сравнительный анализ при одинаковом времени элюирования. Таким образом, кислотно-катализируемых 18 O-маркировки может служить альтернативой химической, анzymatic и метаболических маркировки приближается к широко используются в количественном протеомики. Один конкретный перспективным применение этого метода является использование 18 O-меченых пептидов в качестве стабильного изотопа стандартам.
Рисунок 1. 18 O-маркировки на основе предлагает различные рабочие процессы ход времени. (I) протеазы катализируемой Палео-TimeCourse рабочего процесса позволяет осуществлять мониторинг динамики протеолитических реакций расщепления. В зависимости от протеаз, эти реакции приводят к (а) один (например, в случае некоторых металлопротеаз) или (б) двойные 18 O-включения (например, в случае некоторых сериновых протеаз). (II) Двухместный 18 O-этикетировщик таких как трипсин также может быть использован в рабочих процессах postdigestion маркировку, в которой 18 O-включение исключительно при посредничестве протеазы катализируемойкарбоксильных реакции обмена кислорода. (III) В отличие от Aleo-TimeCourse рабочий процесс основан на кислотно-катализируемых карбоксильной кислородного обмена реакциями кислую сторону пептидных и концевых групп. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Экспериментальные рабочие процессы Палео-и Aleo-TimeCourse стратегии. A) (I) В протеазы катализируемой Палео-TimeCourse эксперимент, субстраты инкубируют с протеазы в присутствии H 2 18 O в результате включения до двух 18 O-атомов в зависимости от протеазы. (II) В маркировке эксперимент postdigestion Палео, продукты расщепления от предыдущих пищеварения повторно инкубировали с протеазы интерес в присутствии H 2 18 O. Протеазы способны двойной маркировки (в рабочий процесс I) будет стимулировать включение два 18-O-атомов. (III) в кислотно-катализируемых эксперимент Aleo, все кислых функциональных групп включают 18 O-атомов B) TimeCourse анализ:.. Через определенные промежутки времени аликвоты реакционной смеси совместно с пятнами матрицы MALDI-целевого листы, на MS- сбора данных, спектральных участках Время реакции расщепления пептида, а также 18 O-включение участков отдельных видов пептидов создаются и продукты расщепления выбраны для MS / MS на основе последовательности идентификации. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. Спектральных участках времени отображения динамики протеолитических реакций расщепления. Построив MS спектров Палео-TimeCourse экспериментов в водопаде договоренности, можно одновременно контролировать деградации субстрата и появления промежуточных и конечных продуктов расщепления. Здесь расщепление биологически активных пептидов Endokinin C по эндотелина-превращающего фермента-1 (ECE-1) показано. Продукты расщепления были определены MS / MS и их конверты изотопа отображаются характерные 18 O-включение подписи (выделены красным цветом).
Рисунок 4. Сериновых протеаз, такие как трипсин посредником включения до двух 18 O-атомов на пептидные продукты расщепления. (I) Чонг> В протеазы маркировки на основе рабочих процессов, пептидной связью реакции расщепления результаты в 50% один 18 O-включение соотношение свежесгенерированным пептида продукты расщепления (черные точки указывают немеченого, красный одно-меченых пептидов фракций). Протеаз, которые привязать их продукты реакции (например, сериновых протеаз, такие как трипсин) дальнейшей активизации включение второго атома 18 O через карбоксильную реакции обмена кислорода (зеленые точки, дважды меченного пептида фракции). В равновесии, этикетки распределения 0.25:0.5:0.25. (ООН-, одно-, двойной маркировкой) достигается (II) В postdigestion маркировки протеолитических рабочих концах, не пептида расколы связи происходит. Вместо этого, включение до двух 18 O-атомов основывается исключительно на карбоксильных реакции обмена кислорода. Таким образом, 18 O-включение происходит только с протеаз, которые привязать их пептид продукты расщепления.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Рисунок 5. Кислотно-катализируемой 18 O маркировки приводит к включению два 18-O-атомов в карбоксильной группе. За ходом эксперимента, изотопный конверт ангиотензина-1 прошли несколько +2 Da массы сдвиги (пунктирные линии), соответствующие поглощению 18-O-атомов. Участки 18 O-включение выделены в аминокислотной последовательности (синий).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Объединив стабильного изотопа и маркировки высокого разрешения масс-спектрометрии в времяразрешенных образом, Палео-TimeCourse метод позволяет динамический анализ поколение пептидов продукции. Анализ может быть использован для создания стабильной меченных изотопами пептидов для количественного и качественного протеомики исследований и оценки кинетики которые proteotypic пептиды образуются. Кроме того, Палео-TimeCourse предназначен для оценки протеолитических путей при определенных, соответствующих физиологически естественных условиях бывшего условиях. Эндогенные белки, пептиды и протеазы, а также синтетических пептидов и рекомбинантных протеазы могут быть использованы в рабочий процесс. В зависимости от конкретной протеолитических реакций необходимо исследовать, анализ условий и определение раз может быть скорректирована для обеспечения оптимального отбора проб процессе реакции. По нашему опыту, это полезно, чтобы замедлить протеолитических реакций вниз (например, с помощью низких концентрациях фермента, номертемпература), чтобы обеспечить удобные интервалы выборки руководства, как с другими стабильным изотопом методологии маркировки, отклонения для экспериментальной 18 O-включение измерения соотношения небольшие -. обычно менее 5% для пиков с достаточной статистики ионов. В целом протокол может быть легко адаптирована в других форматах анализа, например, скрининг большого набора синтетические субстраты или характеристика протеолитического процессинга эндогенные пептиды из сложных биологических образцов (например, клеточной культуре средств массовой информации, теле жидкости). Ранее мы показали, как палео-подход может быть через дефис с LC-стадии разделения и используется для определения динамической состав человеческой слюны peptidome 9. Протеолитические подписи определенных Палео-TimeCourse обеспечивают важные факты, касающиеся субстратной специфичности протеаз интерес. Кроме того, с временным разрешением данных также дает кинетическая информации. Такие знания особенно полезны в оценке proteotypic пептидов для количественных исследований протеомики, где выбор воспроизводимой и очень обильные пептиды целью является существенным 21. Кроме того, определение лимитирующей шаги в протеолитические пути представляет большой интерес для разработки новых протеаз основе наркотиков. Протеазы являются ключевыми факторами во многих физиологических и патологических процессов (например, сердечно-сосудистых заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, рака), и такие наблюдения могут открыть новые возможности для терапевтического вмешательства. Aleo-стратегии - кислотно-катализируемых маркировки карбоксильных групп - легко наносится на синтетические и эндогенные пептиды для получения стабильного изотопного закодированных стандартов. Кинетики кислотно-катализируемой реакции намного медленнее, чем фермент-катализируемых реакций. Таким образом, эксперименты должны быть тщательно спланировано. Aleo-TimeCourse является недорогой альтернативой химическим, метаболических и синтетических маркировка мМЕТОДЫ настоящее время используется в протеомики исследований. Маркировка процесс можно отслеживать, чтобы подтвердить, что 18 O-включение достигла равновесия, которое может быть преимущество перед другими методами маркировки стабильный изотоп. В заключение, Лев-TimeCourse процессы, описанные здесь являются универсальными инструментами, которые могут быть творчески использованы во многих качественных и количественных исследований протеомики, а также протеазы исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH / NIDCR Грант 1R01DE019796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
