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Biology

Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear Published: February 20, 2013 doi: 10.3791/3891
Automatic Translation
1, 1
1Boston Biomedical Research Institute

Summary

Estables flujos de trabajo que emplean isótopos de etiquetado

Abstract

Los isótopos estables son herramientas esenciales en la espectrometría de masa biológica. Históricamente, 18 O-isótopos estables se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos catalíticos de enzimas proteolíticas 1-3. Con el advenimiento de la espectrometría de masas basado proteómica, la incorporación catalizada enzimáticamente de 18 átomos de O de agua estable enriquecido isotópicamente se ha convertido en un método popular para comparar cuantitativamente los niveles de expresión de proteína (revisado por Fenselau y Yao 4, Miyagi y Rao 5 y Ye et al. 6). 18 O-etiquetado constituye una alternativa simple y de bajo costo a los productos químicos (por ejemplo, iTRAQ, ICAT) y metabólicos (por ejemplo SILAC) técnicas de marcado 7. Dependiendo de la proteasa utilizada, 18 O-etiquetado puede dar lugar a la incorporación de hasta dos 18 átomos de O en el grupo carboxilo C-terminal del producto de escisión 3 8. En nuestro Paleo (p rotease-a e l Abeling ssisted mploying 18 O agua enriquecida) la adaptación enzimática de 18 O-etiquetado, se utilizó 50% 18 O enriquecida con agua para producir firmas isotópicas distintivas. En combinación con la alta resolución de láser asistida por matriz de ionización de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masas tándem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), los sobres de isótopos característicos se puede utilizar para identificar los productos de escisión con un alto nivel de especificidad. Anteriormente ha utilizado el paleo-metodología para detectar y caracterizar proteasas endógenas 9 y controlar las reacciones proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica la esencia misma de la reacción de escisión proteolítica, el montaje experimental es enri sencillo y bioquímicospasos chment de productos de escisión se puede evitar. El paleo-método se puede extender fácilmente a (i) experimentos de tiempo de los cursos que controlan la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica y (ii) el análisis de la proteólisis en muestras biológicas complejas que representan las condiciones fisiológicas. Paleo-timecourse experimentos ayudan a identificar limitación de la velocidad de procesamiento y pasos intermedios de reacción en situaciones complejas de reacciones proteolíticas vía. Además, el paleo-reacción nos permite identificar las enzimas proteolíticas tales como la tripsina proteasa de serina que es capaz de volver a enlazar sus productos de escisión y catalizar la incorporación de un segundo átomo de O 18. Tales "doble etiquetado" enzimas se pueden utilizar para postdigestion 18 O-etiquetado, en la que los péptidos están etiquetados exclusivamente por la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo. Nuestra tercera estrategia se extiende etiquetado empleando 18 O agua enriquecida más allá de las enzimas y utiliza las condiciones ácidas de pH para introducir 18 O-isótopo estable signoturas en péptidos.

Protocol

Los flujos de trabajo presentados Leo-permitir el etiquetado de isótopos estables de proteínas digiere y péptidos sintéticos. Estos experimentos de tiempo (Figura 1) son aplicables a los estudios de proteómica comparativa y cuantitativa así como la investigación de proteasa. Cada flujo de trabajo consta de dos pasos experimentales (Figura 2): A) El tiempo de muestreo resuelto de la respectiva 18 O-isótopos estables codificada reacción (proteasa de escisión catalizada por péptido; proteasa catalizada carboxilo reacción de intercambio de oxígeno; catalizada por ácido intercambio de oxígeno carboxilo reacción) y análisis B) por espectrometría de masas y la representación gráfica de 18-O incorporación cinética.

A. Experimentos timecourse

I. paleo-timecourse: Proteasa catalizada etiquetado de escisiones proteolíticas

  1. (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM)en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparada) por incubación durante 30 min a 50 ° C.
  2. (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Use PepClean columnas C-18 spin (Thermo) para la limpieza de péptido y Vivaspin concentradores centrífugos (Sartorius) para el intercambio de tampones para muestras de proteínas.
  4. Volver a disolver / péptidos / proteínas de cambio en 20 l tampón de reacción de la proteasa (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
  5. Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de la proteasa: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámicomatriz de ácido (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Extender la muestra en un Opti-TOF 384 placa de MALDI objetivo (AB SCIEX) y dejar que las gotas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 minutos).
  6. Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con la proteasa de interés (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como muestra de control. La primera alícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por O-18 etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y la identificación de proteínas, detección de las actividades proteolíticas y seguimiento de las reacciones de escisión proteolítica. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es inducida por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado ni escisión se espera para esta muestra.
  7. Siga la reacción mediante la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como described del paso 5 a intervalos de tiempo como parece conveniente. Las condiciones de reacción descritas anteriormente se utilizan para controlar una reacción proteolítica para hasta cuatro días (aproximadamente 24 puntos). Iniciar el muestreo cada 5 min hasta 30 min, luego detectar cada 30 min hasta 2 h, después cada hora hasta 8 horas y cada 8 h hasta 4 días. Productos de escisión debe aparecer dentro de las primeras 12 horas y el sustrato debe estar completamente hidrolizada después de 24 horas. Tiempos de incubación prolongados de reacción permiten definir los productos de reacción que son estables discreta a partir de intermedios de reacción, que son objeto de transformación. Dependiendo de la pregunta de investigación y dados pares enzima-sustrato, los tiempos y temperaturas de incubación manchado tiene que ser modulada para asegurar el muestreo reacción óptima.
  8. Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas, la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B).

II. Paleo-timecourse: Postdigestion etiquetado de termini proteolíticas

  1. (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparado) por incubación durante 30 min a 50 ° C.
  2. (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Utilice columnas PepClean C-18 para la limpieza de spin péptido y Vivaspin concentradores centrífugos para el intercambio de proteína buffer.
  4. Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos / proteínas en 20 l tampón de reacción de la proteasa (por ejemplo tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) y se digiere con proteasa de interés para la terminación (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM; 37 ° C; 12 hr).
  5. Productos de limpieza de escisión con columnas PepClean C-18 espín. Este paso eliminará las actividades residuales de proteasa.
  6. Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos en tampón de 20 l reacción de la proteasa (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O.
  7. Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de enzima: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Punto de la muestra en una placa diana MALDI y dejar las gotitas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 min).
  8. Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con proteasa de interés (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como un control. La primeraalícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por 18 O-postdigestion etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y cuantificación de proteínas. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es catalizada por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado se esperaba para esta muestra.
  9. Seguir la reacción por la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como se describe en el paso 7.) A intervalos de tiempo como parece conveniente. Por ejemplo, hemos descubierto inicialmente cada 5 minutos durante hasta 30 min y cada 15 min después de que para controlar la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo catalizada por tripsina.
  10. Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas de la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B).

III. Aleo-timecourse: catalizada por ácido etiquetado de grupos carboxilo

  1. Incubar péptidos individuales (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-agua enriquecida en tél presencia o ausencia (control) de 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético definitiva (volumen total de 30 l).
  2. Muestra los productos de reacción al día durante 48 días por co-spotting una alícuota de 0,5 l de la mezcla con 0.5μl matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) directamente en una diana MALDI plato.
  3. Entre los intervalos de aplicación, y después de ver el punto de reacción por última vez presentar placa MALDI objetivo para MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe a continuación en la Sección B.

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS de adquisición de datos y análisis

  1. Los espectros de masas se adquieren en un 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
  2. Antes del análisis, el instrumento se calibra con una mezcla de péptidos estándares (Kit de estándares de masa para la calibración de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos) con una tolerancia de error de masa máxima de medición de ± 50 ppm y un número mínimo de seis picos para que coincida.
  3. MS espectros (rango de masas400 - 4.000 m / z) son adquiridos por triplicado utilizando el modo de ion positivo con una intensidad de láser ajustable (3.400 - 3.800; tamaño de paso 50) con un rango de intensidad de base aceptable pico de 2.000 - 45.000. TOMA DE hayan sido adquiridos con sub-espectros, con 400 golpes totales / espectro, deje de condiciones entrarán en vigor después de 800 sub-espectros se adquieren (aprobado o suspenso) o 400 espectros sub-criterios de aceptación de pase. En caso de poco abundantes muestras o en presencia de complejos orígenes biológicos el extremo inferior del rango de detección MS debería elevarse a 800 m / z. Además, puede ser necesario para eliminar la sal y otros compuestos que interfieren con un paso de limpieza de la muestra como se ha descrito anteriormente o mediante la separación LC.
  4. MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde el 4000 Series software de adquisición de datos y el Explorador de importación en nuestro propio sistema de información de laboratorio, que utiliza software MASCOTA Distiller (Matrix Science) para el procesamiento espectral y detección de picos. Sobres isotópicosson desconvolucionado y 18 O-incorporación coeficientes determinados automáticamente usando un algoritmo similar a la descrita por Mason et al. 12 y adaptada por nuestro grupo 9. Alternativamente, las herramientas de software, tales como ZoomQuant 13 y Viper 14, así como paquetes de software comerciales tales como BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) y cuantificación Mascot Distiller Toolbox (Matrix Science) puede deconvolute 18 O-tipo de datos 15,16. 18 O-incorporación relaciones se expresan como las contribuciones relativas de las distintas especies de isótopos de péptidos (es decir, los péptidos que contienen 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) a la envolvente isotópica entero.
  5. Para cada experimento timecourse, las masas moleculares ([M + H] +) para todas las especies de péptidos detectados son extraídos de los archivos asociados de datos de MS y los valores agrupada en una anchura de 100 ppm en masa.
  6. Lal menos tres [M + H] + se fijan para ser requerido para llenar un contenedor. En caso de sustratos conocidos, la lista bin filtrada se compara con una lista de los productos de escisión proteolítica predecir a partir de la secuencia del péptido sustrato utilizando la herramienta ExPASy FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) y un 200 ppm en masa error de tolerancia de aceptación.
  7. MS / MS espectros se adquieren para todos los valores de masa de los productos de escisión predichos por la herramienta FindPept y para valores en intervalos que tienen 18 O-incorporaciones asociados con ellos. MS / MS datos se adquieren en el 4800 MALDI TOF / TOF Analizador 1kV en modo reflector de iones positivos, con una intensidad del láser fijo de 4200 y CID-gas en el modo de apagado. 50 disparos se adquieren en un patrón aleatorio por sub-espectro, hasta un total de 40 sub-espectros por punto (lo que da un total de 2.000 disparos / in situ).
  8. MS / MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde la Explo 4000 Seriesrer software de adquisición de datos e importados en nuestro propio sistema de información de laboratorio, se detectan los picos y MS / MS de las listas de pico están asociados con los correspondientes datos de MS agrupadas.
  9. Para la identificación de péptidos, MS / MS listas de los picos se registraron en contra de la base de datos SwissProt utilizando el motor de búsqueda MASCOT con los siguientes parámetros de búsqueda: ninguna especificidad enzimática, 150 ppm de ion precursor y 0,2 Da tolerancias de iones de fragmentos de masa.
  10. Péptido identificaciones, además, puede ser validada usando el software Data Explorer (AB SCIEX) confirmando las características 18 O-incorporación patrones a través de los fragmentos de iones y de la serie según lo descrito por Shevchenko et al. 18.

C. Preparación del Tiempo espectral y 18 parcelas incorporación O-

Diagramas espectrales de tiempo: MS archivos de datos (. DT2 archivos) para cada punto de tiempo de reacción se exportan desde el software del explorador de datos como ASCII-archivos usando unamacro e importados a un análisis de datos y el programa de software gráfico (por ejemplo, por OriginLab origen) y se muestran como gráficos de cascada (figura 3).

18 O-incorporación parcelas: Para cada producto de división del péptido binned, las contribuciones relativas de las distintas especies de péptidos de isótopos (16 O, 18 O 18 O 1 o 2) se extraen a través de todos los puntos de tiempo de reacción y en función del tiempo (Figura 4).

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Representative Results

Se utilizó el flujo de trabajo de paleo-timecourse para controlar dinámicamente la incorporación de 18 O-isótopos estables en productos de división de péptidos generados por las enzimas proteolíticas. El enfoque que se presenta es una herramienta versátil para estudiar comparativamente las vías proteolíticas procesamiento de sustrato diferente y combinaciones de la proteasa. Mediante el muestreo de reacciones proteolíticas repetidamente en el transcurso de la reacción, el experimento paleo-timecourse ofrece instantáneas resueltos de tiempo de sustrato y abundancias de producto y detalles de procesamiento. Co-manchar las muestras con una solución de matriz ácido sobre una placa de objetivo se detiene la reacción enzimática y la cristalización matriz además conserva composición de la muestra. Por lo tanto, los puntos de tiempo retrospectivamente puede ser analizada por MALDI-TOF/TOF MS / MS después de la conclusión de la reacción enzimática. Para dar cabida a la naturaleza rica en datos experimentales de estos flujos de trabajo, hemos implementado un sistema semi-automático de la bioinformática que calcula 18 O-incorporandoratios de iones para cada figura péptido. 3 muestra un diagrama espectral representante curso de tiempo del procesamiento del péptido C Endokinin por ECE-1. Paleo-timecourse datos es multidimensional: La visión ampliada de los datos de EM en todo el rango de masa muestra simultáneamente la abundancia del sustrato peptídico, así como la abundancia de los productos peptídicos. La disposición temporal permite descifrar la secuencia de sucesos de escisión y la determinación de fragmentos de péptidos que son productos estables de escisión. La vista ampliada de los datos de MS revela los sobres de isótopos de cada péptido y la escisión inducida por 18 O-etiquetado es fácilmente identificado por su característica distribución de isótopos. 18 O-etiquetado permite la selección positiva de los productos de escisión para la posterior identificación mediante MS / MS. En total, el ensayo paleo-timecourse captura la dinámica del proceso proteolítico y permite la evaluación de los sitios preferidos de escisión de proteasas. Sin embargo, otro nivel de informaciónción se puede conseguir dependiendo del mecanismo enzimático de la proteasa utilizada. Ciertas proteasas tales como la tripsina proteasa de serina son capaces de covalentemente reconsolidación sus productos de escisión del péptido. . La hidrólisis de los resultados intermedios de acil-enzima en la incorporación de un segundo 18 O-átomo en el grupo carboxilo C-terminal Figura 4 muestra los cambios resultantes en la contribución relativa de las diferentes isotopomers lo largo del tiempo: La unión inicial de división del péptido reacción da lugar a una división de 1:1 entre el 16 y el 18 O O 1 fracciones peptídicas. Los resultados de cambio de oxígeno carboxilo de reacción en el aumento de la fracción 18 O 2 a 25% la proporción en equilibrio con una disminución concomitante de la fracción 16 O. Las proteasas capaces de catalizar la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo por lo tanto se puede utilizar para un adicional de 18 O-etiquetado de flujo de trabajo, el etiquetado postdigestion de proteolítica termini. En este tipo de experimentos, los sustratos son inicialmente digeridos en ausencia de H 2 18 O, productos peptídicos limpiado y se incubaron con un nuevo lote de proteasa, pero esta vez en presencia de 50% de H 2 18 La Figura 4 muestra la O. las diferencias en la incorporación de isótopos que se pueden observar en estos dos flujos de trabajo experimentales y las diferencias en la velocidad de incorporación entre los sustratos peptídicos individuales. En el flujo de trabajo de etiquetado postdigestion, la tasa para ambos 18 O-incorporaciones se determina por la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo. La velocidad de reacción depende de la facilidad con la proteasa interactúa con sus productos de escisión. La afinidad por el producto de reacción indirectamente puede utilizarse para inferir la afinidad de la proteasa al sustrato peptídico original. Tal información podría ser útil para determinar qué secuencias de péptidos son sustratos ideales por ejemplo para tríptico digiere en estudios de proteómica cuantitativos. Peptides que se escinde fácilmente y doble etiquetado-por la tripsina es probable que sean péptidos proteotípicos que están formados de forma reproducible y cuantitativa y por lo tanto ideal para los estudios de proteómica comparativa.

A pH bajo, los oxígenos de los grupos de ácido carboxílico intercambio con el disolvente acuoso 19-20. Esta reacción se puede utilizar como un enfoque alternativo para la proteasa catalizada etiquetado estrategias para introducir isótopos estables en péptidos. En el aleo-timecourse (catalizada por ácido etiquetado empleando 18 O agua enriquecida) de flujo de trabajo, que supervisó la lenta incorporación de 18 átomos de O en péptidos sintéticos. El intercambio de oxígeno catalizada por ácido se detuvo después de co-cristalización con la disolución de matriz en la placa diana MALDI, de manera efectiva "congelación" del estado de distribución de isótopos. Se utilizó la angiotensina 1 como un péptido modelo y se examinó su envoltura isótopo con el tiempo (Figura 5). La incorporación de dos de 18 átomos de O de cada vehículogrupo boxyl se observó. En las condiciones experimentales actuales, la reacción catalizada por ácido carboxilo intercambio de oxígeno fue mucho más lento que el intercambio catalizado por proteasa 9 y alcanzó el equilibrio después de sólo 48 días. Sin embargo, el enfoque aleo ofrece la ventaja de marcar péptidos que no son reconocidos por las proteasas. Además, los péptidos incorporar múltiples 18 átomos de O en función del número de cadenas laterales ácidas, que pueden resultar en la separación completa de los sobres de isótopos de especies no marcado y marcado. El desplazamiento de masa en general proporciona información sobre el número de residuos ácidos en un péptido dado y su ubicación pueden ser obtenidos por el análisis de EM / EM de los cambios de masas de fragmentos de iones. 18 O-péptidos marcados con pantalla cerca de un comportamiento idéntico cromatográfica como sus homólogos no marcados, que permite su análisis comparativo en el tiempo de elución idéntico. En resumen, catalizada por ácido 18 O-etiquetado puede servir como una alternativa a la química, enetiquetado zymatic y metabólicas acerca de uso común en proteómica cuantitativa. Una aplicación particular prometedor de esta técnica es el uso de péptidos O-18 etiquetado como estándares de isótopos estables.

Figura 1
Figura 1. 18 O etiquetado basado ofrece una variedad de flujos de trabajo de campo de tiempo. (I) La proteasa catalizada paleo-timecourse flujo de trabajo permite el control de la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica. Dependiendo de la proteasa, estas reacciones resultado en (a) solo (por ejemplo, en el caso de ciertas metaloproteasas) o (b) doble 18 O-incorporación (por ejemplo, en el caso de proteasas de serina ciertas). (II) 18 Doble O-etiquetadora tal como tripsina también se puede utilizar en los flujos de trabajo de etiquetado postdigestion, en el que 18 O-incorporación está mediada exclusivamente por la proteasa catalizadareacción carboxilo intercambio de oxígeno. (III) Por el contrario, el flujo de trabajo Aleo-timecourse se basa en las reacciones catalizadas por ácido carboxilo oxígeno cambio de lado péptido ácido y grupos terminales. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2
Figura 2. Flujos de trabajo experimentales de los paleo-y timecourse Aleo-estrategias. A) (I) En una proteasa catalizada paleo-timecourse experimento, los sustratos se incubaron con una proteasa en presencia de H 2 18 O resultantes en la incorporación de hasta dos 18 átomos de O en función de la proteasa. (II) En un experimento de etiquetado Paleo postdigestion, productos de escisión de una digestión previa se volvieron a incubar con una proteasa de interés en presencia de H 2 18 O. Las proteasas capaces de doble etiquetado (en flujo de trabajo I) catalizará la incorporación de dos átomos de O 18. (III) En un experimento catalizada por ácido Aleo, todos los grupos funcionales ácidos incorporar 18 átomos de O B) Análisis timecourse:.. A intervalos de tiempo, alícuotas de las mezclas de reacción se co-manchado con matriz en placas MALDI-MS-diana A adquisición de datos, gráficos espectrales de tiempo de las reacciones de escisión de péptidos, así como 18 O-incorporación parcelas de especies de péptidos individuales se generan y productos de escisión se seleccionan para la identificación de secuencia MS / MS basada. Haga clic aquí para ampliar la figura .

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Figura 3. Gráficas espectrales tiempo de visualización de la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica. Representando gráficamente espectros de MS de experimentos paleo-timecourse en una disposición cascada, es posible controlar simultáneamente la degradación del sustrato y la aparición de productos de escisión intermedios y finales. Aquí, la escisión del péptido bioactivo C Endokinin por la enzima convertidora de endotelina-1 (ECE-1) se muestra. Productos de escisión fueron identificadas por MS / MS y los sobres de isótopos muestran los característicos 18 O-incorporación firmas (resaltado en rojo).

Figura 4
Figura 4. Las serina proteasas tales como tripsina mediar la incorporación de hasta dos átomos de O 18 en productos de escisión del péptido. (I) trong> En el flujo de trabajo basado en el etiquetado de proteasa, el péptido bonos resultados de la reacción de escisión en un 50% solo 18 O-incorporación razón para recién generados productos de escisión del péptido (puntos negros indican sin etiquetas, color rojo de una sola etiqueta fracciones peptídicas). Las proteasas que vuelva a vincularlos sus productos de reacción (por ejemplo, serina proteasas tales como tripsina) además catalizar la incorporación de un segundo átomo de O 18 a través de la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo (puntos verdes, de doble etiquetado fracción de péptido). En el equilibrio, una etiqueta de distribución de 0.25:0.5:0.25. (Un-; solo; doble etiquetado) se alcanza (II) En el etiquetado postdigestion de flujo de trabajo termini proteolítica, sin divisiones enlace peptídico se produce. En su lugar, la incorporación de hasta dos átomos de O 18 se basa exclusivamente en la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo. Por lo tanto, 18 O-incorporación sólo se produce con proteasas que vuelva a vincularlos sus productos de escisión del péptido.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.

Figura 5
Figura 5. Catalizada por ácido O-18 etiquetado conduce a la incorporación de dos 18 átomos de O por grupo carboxilo. Durante el curso del experimento, el sobre isotópica de angiotensina-1 se sometió a múltiples cambios de masa 2 Da (líneas discontinuas) correspondientes a la absorción de 18 átomos de O. Los sitios de O-18 incorporación se destacan en la secuencia de aminoácidos (azul).

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Discussion

Mediante la combinación de etiquetado de isótopos estables y de alta resolución de la espectrometría de masas en una manera resuelta en el tiempo, el método de paleo-timecourse permite un análisis dinámico de la generación de productos peptídicos. El ensayo se puede utilizar para generar péptidos marcados con isótopos estables para estudios de proteómica cuantitativos y cualitativos, y para evaluar la cinética por el que los péptidos proteotípicos se generan. Además, paleo-timecourse está diseñado para evaluar las vías proteolíticas in vivo bajo específico, ex condiciones fisiológicamente relevantes. Proteínas endógenas, péptidos y proteasas así como péptidos sintéticos y proteasas recombinantes se pueden utilizar en el flujo de trabajo. Dependiendo de la reacción particular proteolítica a ser investigado, condiciones de ensayo y los tiempos de manchas puede ser ajustado para proporcionar para el muestreo óptimo del proceso de reacción. En nuestra experiencia, es útil para retardar las reacciones proteolíticas hacia abajo (por ejemplo, mediante el uso de bajas concentraciones de enzimas, habitacióntemperatura) para permitir intervalos convenientes manuales de muestreo igual que con otros métodos de etiquetado de isótopos estables, desviaciones para las mediciones experimentales 18 relación O-incorporación son pequeñas -. típicamente menos de 5% para los picos con estadísticas suficientes de iones. El protocolo general se puede adaptar fácilmente a otros formatos de ensayo, por ejemplo, el cribado de un gran conjunto de sustratos sintéticos o la caracterización del procesamiento proteolítico de péptidos endógenos de muestras biológicas complejas (por ejemplo, medios de cultivo de células, fluidos corporales). Hemos demostrado cómo la paleo-enfoque puede ser un guión con un paso LC-separación, y se utiliza para definir la composición dinámica de lo humano peptidoma salival 9. Proteolíticas firmas identificadas por el paleo-timecourse proporcionar datos importantes con respecto a la especificidad de sustrato de la proteasa de interés. Además, los datos se resolvieron tiempo también proporciona información cinética. Tal conocimiento es particularmente útil en la evaluación de péptidos proteotípicos para los estudios de proteómica cuantitativa, donde la elección de los péptidos diana reproducibles y altamente abundante es esencial 21. Del mismo modo, la identificación de limitación de la velocidad pasos en vías proteolíticas es de gran interés para el desarrollo de nuevos fármacos basados ​​en la proteasa. Las proteasas son factores clave en muchos procesos fisiológicos y patológicos (por ejemplo, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, cáncer) y las observaciones que pueden abrir nuevas oportunidades para intervenciones terapéuticas. El aleo-estrategia - catalizada por ácido etiquetado de grupos carboxilo - se aplica fácilmente a péptidos sintéticos y endógeno para producir estables estándares isotópicamente codificados. La cinética de la reacción catalizada por ácido es mucho más lenta que la reacción catalizada por la enzima. Por lo tanto, los experimentos tienen que ser cuidadosamente planeado con anticipación. Aleo-timecourse es una alternativa de bajo costo a los productos químicos, etiquetado metabólico y sintéticos métodos utilizados actualmente en estudios de proteómica. El proceso de etiquetado se puede supervisar para validar que 18 O-incorporación alcanzado el equilibrio, que puede ser una ventaja sobre otros métodos de isótopos estables de etiquetado. En conclusión, los flujos de trabajo de Leo-timecourse descritos aquí son herramientas versátiles que se pueden emplear de forma creativa en muchos cualitativa y estudios de proteómica cuantitativa, así como la investigación de proteasa.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR subvención 1R01DE019796.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PepClean C-18 Spin Columns Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI target plate AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF/TOF AB SCIEX
Table 1. Materials
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich 70990-1G-F
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) R&D Systems 1784-ZN
Trypsin Gold Promega V5280
Water-18O, 97 atom % 18O Sigma Aldrich 329878-1G
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo 28904
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments AB SCIEX 4333604
Table 2. Reagents

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References

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Bioquímica Número 72 Biología Molecular proteínas proteómica química física MALDI-TOF espectrometría de masas la proteómica la proteolisis la cuantificación el etiquetado de isótopos estables el etiquetado el catalizador péptidos 18-O agua enriquecida
Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear<sup&gt; 18</sup&gt; O-agua enriquecida
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Klingler, D., Hardt, M. Protease-… More

Klingler, D., Hardt, M. Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water. J. Vis. Exp. (72), e3891, doi:10.3791/3891 (2013).

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