Summary
Istihdam izotop etiketleme iş akışları
Abstract
Kararlı izotoplar biyolojik kütle spektrometresi için temel araçlardır. Tarihsel olarak, 18 Ey-kararlı izotopu yaygın 1-3 proteolitik enzimlerin katalitik mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik gelişiyle birlikte, istikrarlı izotopik zenginleştirilmiş su 18 O-atomların enzimatik katalize eklenmesi kantitatif protein ekspresyon düzeyleri (Fenselau ve Yao 4, Miyagi ve Rao 5 ve Ye tarafından gözden karşılaştırmak için popüler bir yöntem haline gelmiştir ark. 6). 18 O-etiketleme bir kimyasal için basit ve düşük maliyetli bir alternatif (örneğin iTRAQ, ICAT) ve metabolik (örneğin SILAC) etiketleme teknikleri 7 oluşturmaktadır. Kullanılan proteaz bağlı olarak, 18 O-etiketleme bölünme ürün 3, C-terminal karboksil grubunda, iki 18 O-atomuna kadar birleşme sonuçlanabilir 8 ayrılabilir. Bizim paleo (p rotease-bir 18 O-zenginleştirilmiş su mploying ssisted l abeling e) enzimatik 18 O-etiketleme adaptasyonu, biz farklı izotop imzaları verim 50% 18 O-zenginleştirilmiş su kullanılmıştır. Yüksek çözünürlüklü ile kombinasyon halinde matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu zaman-of-flight tandem kütle spektrometresi (MALDI-TOF/TOF MS / MS), karakteristik izotop zarf özgüllük yüksek düzeyde bir bölünme ürünleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz daha önce proteolitik reaksiyonlar 10-11 algılamak ve karakterize endojen proteazlar 9 ve izlemek için paleo-metodolojisi kullanılmıştır. Paleo proteolitik bölünme reaksiyonu özünü kodlar yana, deneysel kurulum basit ve biyokimyasal Enri olduğunuklevaj ürünlerinin chment adımlar atlatılabilir. Paleo-yöntem kolaylıkla proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerini ve fizyolojik koşulları temsil karmaşık biyolojik örneklerde proteoliz (ii) analizi izlemek (i) zaman ders deneyler kadar uzatılabilir. Paleo-timecourse deneyler karmaşık proteolitik yolağı reaksiyonlarda hız sınırlayıcı işlem adımları ve reaksiyon ara tanımlamak için yardım. Buna ek olarak, reaksiyon paleo-bize bu tür kendi parçalanma ürünleri rebind ve bir ikinci 18 O-atomu ile birleşmesiyle katalize etmek için yeteneğine sahip serin proteaz tripsin gibi proteolitik enzimlerin belirlemesini sağlar. Böyle bir "çift etiketleme" enzim postdigestion 18 peptidler özel olarak karboksil oksijen değişim reaksiyonu ile etiketlenmiş olduğu O-etiketleme için de kullanılabilir. Bizim üçüncü strateji enzimler ötesinde 18 O-zenginleştirilmiş su istihdam etiketleme uzatır ve 18 O-izotop işareti tanıtmak asidik pH koşullarında kullanırpeptidler içine atures.
Protocol
Sunulan Leo-iş akışları protein izotop etiketleme sindirir ve sentetik peptidler için izin verir. Bu zaman süreci deneyler (Şekil 1) ve kantitatif proteomikler karşılaştırmalı çalışmalar gibi proteaz araştırma için de geçerlidir. Her iş akışı iki deneysel adımlar (Şekil 2) oluşur: A) ilgili 18 O-izotop kodlanmış reaksiyonu (proteaz-katalizli peptid bölünme karar örnekleme zamanı; proteaz-katalizli karboksil oksijen alışverişi reaksiyonu; asit katalizörlü karboksil oksijen alışverişi kütle spektrometresi ve 18 O-birleşme kinetiği grafiksel gösterimi ile reaksiyonu) ve B) analizi.
A. timecourse Deneyler
I. Paleo-timecourse: proteolitik dilinimleri of Proteaz-katalizli etiketleme
- (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır25 mM NH4 50, 30 dakika süre ile inkübasyonu ile HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) ° C.
- (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla.
- Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein örneklerinin için tamponlar alışverişinde peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri (Sartorius) için PepClean C-18 sıkma sütunlar (Termo) kullanın.
- / Çözülür değiş tokuş peptitler / 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz proteinler (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5.5; tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) ile 1:1 (v / v) nihai H 2 içeren 18 O (% 95, Sigma IsoTec).
- Önceki proteaz ilave olarak bir sıfır zaman noktası numune alımı için: Karışım reaksiyon karışımının 0.5 ul, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamikmatris asit (% 50 asetonitril içinde 10 mg / ml,% 0.1 TFA). Opti bir MALDI-TOF 384 hedef plaka (AB Sciex) üzerinde Noktası numune ve oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakmak kuruyana kadar (yaklaşık 5 dakika).
- Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta:;: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM tripsin 75 nM ECE-1) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve kontrol örneği olarak hizmet verecek. Birinci kısım proteaz-katalize 18 O-etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve proteolitik bölünme reaksiyonları peptid ve protein tespiti, proteolitik etkinlikler tespit edilmesi ve izlenmesi için de kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz neden olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, ne etiket veya dilinim Bu örnek için bekleniyor.
- Reaksiyon çözeltisi kısmı kaldırılması ve des olarak lekelenme ile reaksiyon takipzaman aralıklarında 5. adımı altında açıklanan şekilde değiştirin kadar formda görünüyor. Yukarıda tarif edilen reaksiyon koşulları, en fazla dört günde (yaklaşık 24 noktası) için bir proteolitik reaksiyon izlemek için kullanılır. 30 dk kadar her 5 dk örnekleme başlayın, sonra 4 gün kadar 8 saat ve her 8 saat kadar sonra 2 saat kadar her 30 dakikada, her saat nokta. Parçalanma ürünleri ilk 12 saat içinde gösterilecektir ve alt tabaka 24 saat sonra tamamen hidrolize olması gerekir. Genişletilmiş reaksiyon inkübasyon sürelerinde daha işlenir reaksiyon ara, ayrık olan stabil reaksiyon ürünleri tanımlamak için izin verir. Lekelenme süreleri ve inkübasyon sıcaklığı optimal reaksiyon örnekleme sağlamak için modülasyonlu olması, araştırma sorusu ve verilen enzim-substrat çiftleri üzerinde var olarak.
- Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi uzun lekelenme aralıkları arasında, MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra.
II. Paleo-timecourse: Postdigproteolitik terminallerinin estion etiketleme
- (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla 50 ° C'de 30 dakika inkübasyon ile 25 mM NH 4 HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) içinde DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır
- (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla.
- Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein tampon degişimi peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri için PepClean C-18 sıkma sütunları kullanın.
- Çözülür / temizlenmiş peptid ürünler / proteinler 20 ul proteaz reaksiyon tamponu içinde (örneğin tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) değişimi (örn. tripsin tamamlanması için ilgi proteaz ve özeti: 0.04 nM; 37 ° C, 12 saat).
- PepClean C-18 sıkma sütunlarla Temizleme parçalanma ürünleri. Bu adım, kalan proteaz aktiviteleri ortadan kaldıracaktır.
- Çözülür / (tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz temizlenmiş peptid ürün değişiminde 1:1 (v / v) nihai H 2. 18 O. içeren
- Önceki enzimi eklenmeyen bir sıfır zaman noktası numune alımı için: reaksiyon karışımı, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) Karışımı 0.5 ul. MALDI bir hedef plaka üzerinde Noktası numune ve (yaklaşık 5 dak) kuru kadar oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakın.
- Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM örneğin, tripsin) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve bir kontrol olarak hizmet verecek. Birincialikot proteaz katalize 18 O-postdigestion etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve peptid ve protein ölçümü için kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz tarafından katalize olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, hiçbir etiketleme için bu örnek bekleniyor.
- Reaksiyon alikotları çıkarırken ve bunları adım 7 altında açıklanan tespit ederek tepki uygulayın.) Zaman aralıklarında kadar formda görünüyor. Örneğin, tripsin tarafından katalize karboksil oksijen alışverişi tepkisini izlemek için bundan sonra başlangıçta yukarı 30 dakika ve her 15 dakika için her 5 dk gördü.
- Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi yakalama uzun aralıklar arasında da MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra.
III. Aleo-timecourse: karboksil gruplarının asit katalizörlü etiketleme
- 1:1 (v / v) t olarak 18 O-zenginleştirilmiş su ile tek tek peptidler (50 nM) inkübeo varlığında ya da% 0.1 yokluğunda (kontrol) (v / v) nihai trifluoroasetik asit (toplam hacim 30 ul).
- Numune ile 48 gün süreyle günlük reaksiyon ürünlerinin doğrudan doğruya bir MALDI hedef üzerine alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) ve 0.5μl ile karışım 0.5 ul alikot eş-lekelenme plaka.
- Lekelenme aralığında ve Bölüm B de aşağıda tarif edildiği gibi MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi için MALDI hedef plaka sunmak nihai reaksiyon zaman noktasında tespit sonra
B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Veri Toplama ve Analizi
- Kütle spektrumları 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB Sciex) üzerinde elde edilir.
- Önce analiz, enstrüman ± 50 ppm ve maç için altı tepe asgari sayıda azami kütlesi ölçüm hatası toleransı ile peptid standartları karışımı (AB Sciex TOF / TOF cihazları kalibrasyonu için Kütle Standartları Kiti) ile kalibre edilir.
- MS spektrumları (kütle aralığı2,000 kabul edilebilir bir temel pik yoğunluğu aralığı ile adım büyüklüğü 50) - 45,000; 400 - 3.800 - 4.000 m / z) ayarlanabilir bir lazer yoğunluğu (3,400 pozitif iyon modunda kullanarak üç nüsha halinde elde edilir. Tek çekim 400 toplam çekim / spektrumu, alt-spektrumları amacıyla elde edilen, 800 alt-spektrumları sonra yürürlüğe girer koşulları durdurmak (geçmek veya başarısız) satın alınan veya 400 alt-spektrumları geçiş kabul kriterleri. Düşük miktarda numune halinde ya da kompleks biyolojik kökenli varlığında MS tespiti aralığının alt ucunun 800 m / z için yükseltilmiş olmalıdır. Buna ek olarak, LC ayrımı ile ya da yukarıda anlatıldığı gibi, bir örnek temizleme adımı ile tuz ve diğer müdahale bileşikleri çıkarmak için gerekli olabilir.
- MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explorer veri toplama yazılımı ihraç ve spektral işleme ve pik algılama için MASCOT Distiller yazılımı (Matrix Bilimi) kullanır bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi, içine alınır. İzotopik zarflardeconvoluted ve otomatik olarak Mason et al. 12 tarafından tanımlanan ve grup 9 ile uyumlu bir benzer bir algoritma kullanılarak belirlenmiştir 18 O-birleşme oranını göstermektedir. Alternatif olarak, bu tür ZoomQuant 13 ve 14 engerek gibi yazılım araçları, hem de bu tür ticari yazılım paketleri BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) ve Maskot Distiller kantitasyonu Araç Kutusu gibi (Matrix Bilim) 18 O-tipi verileri 15,16 deconvolute yapabilirsiniz. 18 O-şirketleşme oranları (yani, 16 içeren peptidler bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları olarak ifade edilir O, tüm izotopik zarf ile 18 O ya da 1 18 O 2).
- Her bir timecourse deney için, moleküler kütleleri ([M + H] +) tespit edilen tüm türlerin ilişkili peptid MS verileri ve dosyaları elde değerler 100 ppm kütle genişlikte binned birer.
- Aen t üç [M + H] + bir depo doldurmak için gerekli ayarlanır. Bilinen substratlar olması halinde, kutu listesi filtrelenmiş EXPASY FindPept aracını 17 (kullanarak, substrat peptid sekansı ile tahmin proteolitik bölünme ürünleri bir liste ile karşılaştırılır http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) ve bir 200 ppm kitle hata kabul toleransı.
- MS / MS spektrumları FindPept araç ve onlarla ilgili 18 O-birleştirmeleri var bin değerler için öngörülen parçalanma ürünleri tüm kütle değerleri için elde edilir. MS / MS veri kapalı modunda sabit lazer 4200 yoğunluğu ve CID-gaz ile 1kV reflektör pozitif iyon modunda 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer elde edilir. 50 çekim nokta başına 40 alt-spektrumları (2,000 kare / nokta toplam verimli) toplam alt spektrumları başına randomize desen kadar elde edilir.
- MS / MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explo ihraç edilmektedirrer veri toplama yazılımı ve bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi ithal, zirveleri tespit edilir ve MS / MS tepe listeleri ilgili binned MS verileri ile ilişkilidir.
- Peptid belirlenmesi için, MS / MS tepe listeleri aşağıdaki arama parametreleri ile MASCOT arama motorunu kullanarak SwissProt veritabanı karşı aranır: Hiçbir enzim spesifitesi, 150 ppm öncül iyon ve 0.2 Da fragmanı iyon kütle toleransları.
- Peptit ayrıca kimlik Şevçenko ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi Y-dizi parça üzerinde karakteristik iyonlar 18 O-birleşme paternleri teyit ederek veri Explorer yazılımı (AB Sciex) kullanılarak doğrulanabilir. 18.
Spektral Zaman ve 18 O-şirketleşme Arsalar C. Hazırlanması
Spektral süresi araziler: Bir kullanarak her reaksiyon süresi noktası için MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) olarak Veri Explorer yazılım ihraç edilmektedir ASCII dosyalarımakro ve veri analizi ve grafik yazılım programı (originlab örneğin Kökeni) ithal ve şelale araziler (Şekil 3) olarak görüntülenir.
18 O-kuruluş grafikleri: Her binned peptid bölünme ürün için, bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları (16 O, 18 O 1 veya 18 O 2) her reaksiyon zamanı noktalarında ayıklanır ve (Şekil 4) Zamana karşı çizilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz dinamik proteolitik enzimler tarafından üretilen peptit parçalanma ürünleri içine 18 O-kararlı izotoplar dahil izlemek için paleo-timecourse iş akışı kullanılır. Sunulan yaklaşım nispeten farklı substrat ve proteaz kombinasyonları için proteolitik işleme yolları incelemek için çok yönlü bir araçtır. Reaksiyon boyunca art arda proteolitik reaksiyonlar alınarak, Paleo-timecourse deney substrat ve ürün bolluk zaman çözüme anlık ve işleme ayrıntıları sağlar. Co-lekelenme bir hedef plaka üzerinde asidik matris çözüm örnekleri enzimatik reaksiyon ve matris kristalleşme daha örnek kompozisyon korur durur. Bu nedenle, zaman puan retrospektif enzimatik reaksiyon bitmesinden sonra MALDI-TOF/TOF MS / MS ile analiz edilebilir. Bu deneysel iş akışlarının veri açısından zengin doğası yerleştirmek için, 18 Ey-incorporat hesaplayan bir yarı-otomatik biyoinformatik sistemini hayataHer peptid. Şekil 3 iyon oranları ECE-1 peptit Endokinin C işleme temsilcisi spektral zaman ders planını gösterir. Paleo-timecourse çok boyutlu veri gibidir: Tüm kütle aralığı boyunca MS verileri, genişletilmiş görüş aynı anda peptit substratının bollukları hem de peptid ürünleri bollukları göstermektedir. Zamansal düzenlemesini bölünme olayların sırası deşifresi ve peptid fragmanları stabil parçalanma ürünleri olan belirleyici sağlar. Yakınlaştırılmış-MS veri görünümü izotop her peptid zarflar ve dilinim indüklenen 18 O-etiketleme kolayca onun karakteristik izotop dağılımı ile tanımlanır. 18 O-etiketleme MS / tarafından sonradan belirlenmesi için parçalanma ürünleri pozitif seçimine olanak tanıyan ortaya koymaktadır MS. Toplamda, Paleo-timecourse tahlil proteolitik işleme dinamiklerini yakalar ve proteazların tercih bölünme siteleri değerlendirmek sağlar. Bilgiler henüz başka bir seviyeyetion kullanılan proteaz enzim mekanizmaya bağlı olarak elde edilebilir. Bu tür bir serin proteazdır tripsin gibi bazı proteazlara kovalent bunların peptid parçalanma ürünleri yeniden bağlama yeteneğine sahiptir. ., C-terminal karboksil grubunda bir ikinci 18 O-atomu dahil edilmesi, açil-enzim ara sonuçları hidroliz Şekil 4 saat boyunca farklı isotopomers göreli katkı ortaya çıkan kaymalar gösterir: ilk peptit bağı bölünme reaksiyonu 16 O ve 18 O 1 peptit fraksiyonları arasındaki 1:1 bölünme ile sonuçlanır. 16 O fraksiyonu bir azalma ile birlikte denge% 25 oranı 18 O 2 fraksiyonu artış karboksil oksijen değişiminin reaksiyon sonuçları. Karboksil oksijen değişim reaksiyonu katalize yeteneğine sahip proteazlar bu nedenle proteolitik ter postdigestion etiketleme, ek 18 O-etiketleme akışı için de kullanılabilirMini. Bu tür deneyler olarak, substrat başlangıçta H 2 yokluğunda 18 O, peptid ürünleri temizlenmiş ve proteaz taze bir grup ile inkübe sindirilir, ancak en az% 50 varlığında, bu süre H 2. 18 O. Şekil 4'te gösterilmektedir edilir Bu iki deneysel iş akışları ve bireysel peptid substrat arasındaki birleşme hız farklılıkları görülebilir izotop kuruluş farklılıklar. Postdigestion etiketleme iş akışında, 18 O-birleştirmeleri için her iki oran karboksil oksijen değişim reaksiyonu ile tespit edilir. Reaksiyon hızı proteaz onun parçalanma ürünleri ile nasıl etkileşim kolayca bağlıdır. Reaksiyon ürünü için afinitesi dolaylı olarak alt tabaka ile orijinal peptit proteaz afinite belirlemek için de kullanılabilir. Bu tür bilgiler peptid dizileri triptik kantitatif proteomikler çalışmalarda digests için, örneğin uygun bir substrat olduğunu belirlemek için yararlı olabilir. Ptripsin ile kolayca parçalanabilen ve çift-etiketli eptides çoğaltıcı ve nicel olarak oluşan ve bu nedenle ideal olarak proteomikler karşılaştırmalı çalışmalar için uygun olan peptitler proteotypic olması muhtemeldir.
19-20 sulu çözücü düşük pH'ta, karboksilik asit gruplarının oksijen değişimi. Bu reaksiyon, proteaz tarafından katalizlenen peptidleri içine kararlı izotopları tanıtmak için stratejiler etiketleme için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Aleo-timecourse (asit katalizörlü etiketleme 18 O-zenginleştirilmiş su istihdam) iş akışı, biz sentetik peptidler içine 18 O-atomları yavaş birleşme izlenir. Asit katalizörlü oksijen alışverişi izotop dağılımı devletin etkin "donma" MALDI hedef plaka üzerinde matris çözümü, işbirliği kristalizasyon sonra durdu. Biz bir model peptid olarak Anjiyotensin 1 kullanılır ve zamanla izotop zarf (Şekil 5) incelendi. Her araç için iki 18 O-atomları bir tutulumboxyl grup gözlenmiştir. Mevcut deney koşulları altında, asit-katalizli karboksil oksijen değişim reaksiyonu katalize proteaz değiş tokuş 9 çok daha yavaş olduğunu ve sadece 48 gün sonra dengeye ulaştı. Ancak, Aleo yaklaşımı proteazlar tarafından tanınmayan peptidler etiketleme avantajı sunuyor. Buna ek olarak, peptidler, etiketlenmemiş ve etiketlenmiş türlerin izotop zarf tam olarak ayrılması ile sonuçlanabilir asidik yan zincirler sayısına bağlı olarak birden fazla 18 O-atomu içermektedir. Toplam kütle kayması verilen bir peptid içinde asidik artıkların sayısı hakkında bilgi sağlar ve onların yerini MS / MS fragmanı iyon kütle vardiya analizi ile elde edilebilir. 18 O-etiketli peptidlerin etiketsiz meslektaşları gibi aynı kromatografik davranış, yakın, hangi ekranın özdeş elüsyon zamanda kendi karşılaştırmalı analizi sağlar. Özet olarak, asit-katalizli 18 O-etiketleme kimyasal, en alternatif olarak hizmet edebilirzymatic ve metabolik etiketleme kantitatif proteomik yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar. Bu yöntemin özel bir izotop umut verici bir uygulama standart olarak 18 O-etiketli peptid kullanılmasıdır.
Şekil 1. 18 O-tabanlı etiketleme zaman tabii iş akışları sunar. (I) proteaz-katalizli Paleo-timecourse akışı proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerinin izlenmesi için izin verir. Proteaz bağlı olarak, (a) tek bir (bazı metalloproteinazların durumunda) ya da (b) O-18 çift birleşme (belirli serin proteaz durumunda olduğu gibi). (II) çift 18 O-Labeler böyle bir durumda, bu reaksiyonların sonucunda tripsin gibi 18 O-birleşme sadece proteaz-katalize aracılık eder ki içinde, postdigestion etiketleme akışları içinde de kullanılabilirkarboksil oksijen değişiminin reaksiyon. (III) aksine, aleo-timecourse akışı asitli peptid tarafı ve terminal grupları asit katalizörlü karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar dayanmaktadır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Paleo-ve aleo-timecourse stratejileri Deneysel iş akışları. A) (I) bir proteaz-katalize Paleo-timecourse deneyde, substrat H 2 varlığında bir proteaz ile inkübe edilir proteaz bağlı olarak, iki adet 18 O-atomuna kadar birleşme sonucu 18 O. (II) bir eski postdigestion etiketleme deneyde, bir önceki sindirim parçalanma ürünleri ile tekrar kuluçkaya yatırılır H 2 varlığında 18 O. ilgi bir proteaz Çift etiketleme (iş akışı I) yeteneğine Proteazlar iki 18 O-atomları kuruluş katalize edecek. (III) bir asit-katalizli aleo bir deneyde, tüm asidik fonksiyonel gruplar 18 O-atomu içermektedir B) timecourse analiz:.. Zamanlanmış aralıklarda, reaksiyon karışımı bir oyuktan MALDI-hedef plakalar üzerine matris ile bir arada fark vardır üzerine MS- veri toplama, spektral zaman peptid bölünme reaksiyonların araziler yanı sıra bireysel peptid türlerin 18 Ey-şirketleşme araziler oluşturulur ve parçalanma ürünleri MS / MS tabanlı sırası tanımlama için seçilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
Şekil 3,. Spektral zaman araziler proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerini görüntüler. Şelale düzende Paleo-timecourse deneyler MS spektrumları komplo olarak, aynı anda substrat ve ara ve nihai bölünme ürünlerin ortaya çıkması bozulması izlemek mümkündür. Burada tarafından biyoaktif peptid Endokinin C arasında bölünme endotelin dönüştürücü enzim-1 (ECE-1) gösterilmiştir. Dilinim ürünler MS / MS ve izotop zarflar karakteristik 18 O-kuruluş imzaları (kırmızı olarak vurgulanır) görüntülenir saptanmıştır.
Şekil 4. Gibi tripsin gibi Serin proteazlar peptid parçalanma ürünleri içine iki 18 O-atomları kadar birleşme arabuluculuk. (I) proteaz bazlı etiketleme iş akışında Trong>, taze üretilen peptid parçalanma ürünleri (siyah noktalar etiketsiz, kırmızı tek etiketli peptid kesirler belirtmek) için% 50 tek 18 O-birleşme oranı peptid bağı bölünme reaksiyonu sonuçlar. Bunların reaksiyon ürünleri (örneğin tripsin gibi örneğin serin proteaz) bağlamanız Proteazlar fazla karboksil oksijen değişiminin reaksiyon (yeşil nokta, çift etiketli peptid fraksiyonu) ile ikinci bir 18 O atomu ile birleşmesiyle katalize. Dengede, 0.25:0.5:0.25 bir etiket dağıtımı. (Un-, tek, çift etiketli) ulaşıldı (II) proteolitik termini akışının postdigestion etiketleme, hiçbir peptid bağı bölünmelere oluşabilir. Bunun yerine, iki adet 18 O-atomuna kadar birleşme sadece karboksil oksijen değişim reaksiyonu esas alınmaktadır. Bu nedenle, 18 Ey-dahil sadece kendi peptid parçalanma ürünleri yeniden bağlamanız proteazlar ile oluşur.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Asit katalizli 18 O-etiketleme karboksil grubu başına iki adet 18 O-atomu birleşme yol açar. Deney boyunca, Anjiyotensin-1 izotopik zarf alımını karşılık gelen birden fazla +2 Da kütle kaymalar (kesikli hatlar) uygulandı 18 O-atomlu. 18 O-şirketleşme siteleri amino asit dizisi (mavi) vurgulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Izotop etiketleme ve zamana bağımlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştirerek, Paleo-timecourse yöntemi peptid ürünlerinin nesil dinamik bir analiz sağlar. Tahlil nicel ve nitel proteomikler çalışmalar için kararlı izotopik olarak etiketlenmiş bir peptit üretmek için ve proteotypic peptidler elde edildikleri kinetik değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, Paleo-timecourse spesifik olarak, fizyolojik olarak uygun koşullar altında ex vivo olarak proteolitik yollar değerlendirmek için tasarlanmıştır. Endojen proteinler, peptidler ve proteazlar gibi sentetik peptidlerin ve rekombinant proteazlar akışı içinde kullanılabilir. Belirli bir proteolitik araştırılması için reaksiyon, tahlil koşulları ve lekelenme kez bağlı olarak reaksiyon sürecinin en iyi örnekleme sağlamak için ayarlanabilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu (örneğin, düşük enzim konsantrasyonu kullanılarak, oda aşağı proteolitik reaksiyonları yavaşlatmak için yardımcı oluruygun elle örnekleme aralıkları için izin sıcaklık) diğer kararlı-izotop etiketleme yöntemleri ile olduğu gibi, deney 18 O-birleşme oranı ölçümleri için sapmalar küçük -. genellikle% 5'inden az yeterli iyon istatistikleri ile zirveleri için. Genel protokol kolayca başka tahlil formatları için adapte edilmiş, örneğin sentetik substrat arasında bir büyük grubu ya da kompleks biyolojik örnekler (ör., hücre kültür ortamı, vücut sıvıları) dan endojen peptidler proteolitik işleme karakterizasyonu tarama şekilde olabilir. Daha önce paleo-yaklaşım LC-ayrıştırma aşaması ile tire, ve insan tükürük peptidome 9 dinamik kompozisyon tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Paleo-timecourse tarafından tanımlanan proteolitik imza proteaz enziminin substrat spesifitesi ile ilgili önemli bilgiler sağlamaktadır ilgi. Buna ek olarak, zamana bağımlı veri da kinetik bilgi üretir. Bu bilgiler tekrar üretilebilir ve yüksek derecede bol hedef peptidleri tercih 21 önemlidir kantitatif proteomik çalışmaları için, proteotypic peptidler değerlendirilmesi özellikle yararlıdır. Aynı şekilde, proteolitik yollar oran sınırlayıcı tanımlayan adımlar yeni proteaz bazlı ilaçların geliştirilmesi için büyük ilgi görmektedir. Proteazlar birçok fizyolojik ve patolojik süreçler (örneğin kardiyovasküler bozukluklar, nörodejeneratif hastalıklar, kanser) ve bu gözlemler terapötik müdahaleler için yeni fırsatlar açabilir önemli faktörlerdir. Aleo-stratejisi - karboksil gruplarının asit katalizörlü etiketleme - kolayca kararlı izotopik olarak kodlanmış sentetik standartlar üretmek için ve endojen peptidler uygulanır. Asit katalizli reaksiyon kinetiği, enzim-katalizörlü tepkime çok daha yavaştır. Bu nedenle, denemeleri dikkatlice önceden planlanmış olması gerekir. Aleo-timecourse kimyasal bir düşük maliyetli bir alternatif, metabolik ve sentetik etiketleme methods şu anda proteomikler çalışmalarında kullanılmıştır. Etiketleme süreci 18 O-şirketleşme diğer izotop etiketleme yöntemleri üzerinde bir avantaj olabilir dengeye ulaşmış olduğunu doğrulamak için izlenebilir. Sonuç olarak, burada açıklanan Leo-timecourse iş akışları yaratıcı birçok kalitatif ve kantitatif proteomik çalışmalarının yanı sıra proteaz araştırma istihdam edilebilir yönlü araçlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
