Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Protease-og syrekatalyseret Mærkning arbejdsgange Anvender Published: February 20, 2013 doi: 10.3791/3891

Summary

Stabile isotopmærkning arbejdsgange beskæftiger

Abstract

Stabile isotoper er vigtige redskaber i biologisk massespektrometri. Historisk set har 18 O-stabile isotoper omfang blevet anvendt til at undersøge de katalytiske mekanismer af proteolytiske enzymer 1-3. Med fremkomsten af massespektrometri-baseret proteomics har den enzymatisk katalyserede inkorporering af 18 O-atomer fra stabil isotopisk beriget vand blevet en populær metode til kvantitativt sammenligne protein ekspressionsniveauer (gennemgået af Fenselau og Yao 4, Miyagi og Rao 5 og Ye et al. 6). 18 O-mærkning er en enkel og billig alternativ til kemiske (f.eks iTRAQ, ICAT) og metaboliske (f.eks SILAC) mærkningsteknikker 7. Afhængigt af den anvendte protease, kan 18 O-mærkning føre til optagelse af op til to 18 O-atomer i den C-terminale carboxylgruppe af spaltningsproduktet 3 8. I vores paleo (p rotease-en ssisted l abeling e mploying 18 O-beriget vand) tilpasning af enzymatisk 18 O-mærkning, vi udnyttet 50% 18 O-beriget vand til opnåelse af markante isotop signaturer. I kombination med høj opløsning matrix-assisteret laser desorption ionisering time-of-flight tandem-massespektrometri (MALDI-TOF/TOF MS / MS), kan de karakteristiske isotop konvolutter anvendes til at identificere spaltningsprodukter med en høj grad af specificitet. Vi tidligere har brugt palæo-metoden til at opdage og karakterisere endogene proteaser 9 og overvåge proteolytiske reaktioner 10-11. Siden paleo koder selve essensen af ​​den proteolytiske spaltning reaktion, forsøgsopstillingen er enkel og biokemisk enrichment trin spaltningsprodukter kan omgås. Paleo-metoden kan let udvides til (i) tidsforløbet eksperimenter, der overvåger dynamikken i proteolytiske spaltningsreaktioner og (ii) analyse af proteolyse i komplekse biologiske prøver, der repræsenterer fysiologiske betingelser. Palæo-tidsforløbet eksperimenter hjælpe med at identificere rate-begrænsende procestrin og reaktionsmellemprodukter i komplekse proteolytiske pathway reaktioner. Endvidere er palæo-reaktionen gør det muligt at identificere proteolytiske enzymer, såsom serin protease trypsin, der er i stand til at binde dets spaltningsprodukter og katalysere inkorporeringen af en anden 18 O-atom. Sådanne "dobbelt-mærkning" enzymer kan anvendes til postdigestion 18 O-mærkning, i hvilke peptider udelukkende mærket ved carboxyl oxygen udskiftningsreaktion. Vores tredje strategi udvider mærkning beskæftiger 18 O-beriget vand ud over enzymer og bruger sure pH-betingelser for at indføre 18 O-stabile isotoper skiltturer i peptider.

Protocol

De præsenterede Leo-arbejdsgange muliggør den stabile isotop mærkning af protein fordøjer og syntetiske peptider. Disse tidsforløb eksperimenter (figur 1) gælder for sammenlignende og kvantitative proteomics undersøgelser samt protease forskning. Hver arbejdsproces består af to eksperimentelle trin (figur 2): A) Den tid løst sampling af de respektive 18 O-stabil isotop-kodet reaktion (protease-katalyseret peptidspaltning, protease-katalyseret carboxyl oxygen udskiftningsreaktion, syrekatalyseret carboxyl iltudvekslingen reaktion) og B) analyse ved massespektrometri og grafisk repræsentation af 18 O-inkorporering kinetik.

A. tidsforløbet Eksperimenter

I. palæo-tidsforløbet: Protease-katalyseret mærkning af proteolytiske spaltninger

  1. (Valgfrit) Disulfidbindinger af proteiner (10 uM) og peptider (250 pM) reduceres med DTT (slutkoncentration 2,5 mM)i 25 mM NH4 HCO3 (både frisk fremstillet) ved inkubation i 30 minutter ved 50 ° C.
  2. (Valgfrit) frie cysteiner er alkyleret med iodacetamid (slutkoncentration 10 mM) i 25 mM NH4 HCO3 ved inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  3. Afhængigt af protease af interesse, skal protein / peptid løsninger skal være rensede at fjerne resterende puffer og alkyleringsmiddel. Brug PepClean C-18 spinkolonner (Thermo) for peptid oprydning og Vivaspin Centrifugal Concentrator (Sartorius) til at udveksle buffere for protein prøver.
  4. Genopløses / udveksling peptider / proteiner i 20 ul protease reaktionspuffer (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5, trypsin: 25 mM NH4 HCO 3, pH 8,0) indeholdende 1:1 (vol / vol) endelig H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
  5. Trække et Nultidspunktet prøven forud for tilsætningen af ​​proteasen: Mix 0,5 gl af reaktionsblandingen og 0,5 pi alpha cyano-4-hydroxykanelsyrematrixacid matrix (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA). Stikprøveform på en Opti-TOF 384 MALDI målplade (AB Sciex) og lad opløsningsmidlet smådråber ved stuetemperatur indtil tørhed (ca. 5 min).
  6. Split reaktionsopløsningen i to alikvoter. Den første alikvot vil blive inkuberet med proteasen af ​​interesse (ECE-1: 75 nM; trypsin: 0,04 nM) ved stuetemperatur eller den anbefalede temperatur for det pågældende enzym. Den anden portion vil blive inkuberet uden protease og vil fungere som kontrolprøve. Den første portion er en standardprøve for protease-katalyseret 18 O-mærkning og kan anvendes til peptid-og protein-identifikation, påvisning af proteolytiske aktiviteter og overvågning af proteolytiske spaltningsreaktioner. Den anden portion anvendes til at vise, at 18 O-inkorporering induceres af proteasen, og derfor er hverken mærkning eller spaltning forventes for denne prøve.
  7. Følge reaktionen ved at fjerne reaktions alikvoter og spotting dem som destilskrevet under trin 5 ved tidsintervaller, som synes passende. Reaktionsbetingelserne beskrevet ovenfor anvendes til at overvåge en proteolytisk reaktion i op til fire dage (ca. 24 spots). Start prøveudtagning hver 5 min indtil 30 min, og derefter få øje hver 30 min indtil 2 timer, derefter hver time indtil 8 timer og hver 8 timers indtil 4 dage. Spaltningsprodukter skal vises i de første 12 timer, og underlaget skal være helt hydrolyseret efter 24 timer. Forlængede reaktionstider inkubationstider muligt at definere stabile reaktionsprodukter, der er adskilt fra reaktionsmellemprodukter, som forarbejdes yderligere. Afhængig forskning spørgsmål og givet enzym-substrat par, har spotting gange og inkubationstemperatur skal moduleres at sikre optimal reaktion prøveudtagning.
  8. Efter den sidste reaktionstid punkt er plettet eller mellem udvidede spotting intervaller er MALDI målplade forelagt MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse som beskrevet nedenfor (afsnit B).

II. Palæo-tidsforløbet: Postdigestion mærkning af proteolytiske termini

  1. (Valgfrit) Disulfidbindinger af proteiner (10 uM) og peptider (250 pM) reduceres med DTT (slutkoncentration 2,5 mM) i 25 mM NH4 HCO3 (både frisk fremstillet) ved inkubation i 30 minutter ved 50 ° C.
  2. (Valgfrit) frie cysteiner er alkyleret med iodacetamid (slutkoncentration 10 mM) i 25 mM NH4 HCO3 ved inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  3. Afhængigt af proteasen af ​​interesse, skal protein / peptid løsninger skal være rensede at fjerne resterende puffer og alkyleringsmiddel. Brug PepClean C-18 spinkolonner for peptid oprydning og Vivaspin Centrifugal Concentrator for protein buffer udveksling.
  4. Genopløses / udveksle de rensede peptidprodukter / proteiner i 20 ul protease reaktionspuffer (fx trypsin: 25 mM NH4 HCO 3, pH 8,0) og fordøje med protease af interesse til færdiggørelse (fx trypsin: 0,04 nM, 37 ° C, 12 timer).
  5. Oprydning spaltningsprodukter med PepClean C-18 spin-søjler. Dette skridt vil fjerne resterende proteaseaktiviteter.
  6. Genopløses / udveksle de rensede peptidprodukter i 20 pi protease reaktionsbuffer (trypsin: 25 mM NH4 HCO 3, pH 8,0) indeholdende 1:1 (vol / vol) endelig H 2 18 O.
  7. Trække et Nultidspunktet prøven før tilsætning af enzym: Mix 0,5 gl af reaktionsblandingen og 0,5 pi alpha cyano-4-hydroxykanelsyre-matrix (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA). Stikprøveform på en MALDI målplade og lade opløsningsmidlet smådråber ved stuetemperatur indtil tørhed (ca. 5 min).
  8. Split reaktionsopløsningen i to alikvoter. Den første alikvot vil blive inkuberet med protease af interesse (fx trypsin: 0,04 nM) ved stuetemperatur eller den anbefalede temperatur for det pågældende enzym. Den anden portion vil blive inkuberet uden protease og vil tjene som en kontrol. Den førsteportion er en standardprøve for protease-katalyseret 18 O-postdigestion mærkning og kan anvendes til peptid-og protein kvantificering. Den anden portion anvendes til at vise, at 18 O-inkorporering er katalyseret af den protease, og derfor er ingen mærkning forventes for denne prøve.
  9. Følge reaktionen ved at fjerne reaktions alikvoter og spotting dem som beskrevet under trin 7). Ved tidsintervaller som synes passende. For eksempel opdagede vi i første omgang hver 5 min i op til 30 minutter, og hvert 15 min derefter at overvåge carboxyl iltudvekslingen katalyseret af trypsin.
  10. Efter den endelige reaktion tidspunkt er plettet eller mellem forlængede spotting mellemrum MALDI målplade underkastes MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse som beskrevet nedenfor (afsnit B).

III. Aleo-tidsforløbet: syrekatalyseret mærkning af carboxylgrupper

  1. Inkuber individuelle peptider (50 nM) med 1:1 (v / v) 18 O-beriget vand i tHan nærvær eller fravær (kontrol) af 0,1% (volumen / volumen) endelig trifluoreddikesyre (totalvolumen 30 ul).
  2. Prøve reaktionsprodukterne dagligt i 48 dage ved co-spotting en 0,5 ul prøve af blandingen med 0.5μl af a cyano-4-hydroxykanelsyre-matrix (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA) direkte på en MALDI target plade.
  3. Mellem spotting intervaller og efter spotting af det endelige reaktionsprodukt tidspunkt indgive MALDI målplade for MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse som beskrevet nedenfor i afsnit B.

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Data Acquisition og analyse

  1. Massespektre erhverves på en 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB Sciex).
  2. Forud for analysen, er instrumentet kalibreres med en blanding af peptid standarder (Mass Standards Kit til Kalibrering af AB Sciex TOF / TOF instrumenter) med en totalmasse målefejl tolerance på ± 50 ppm og et minimum af seks toppe til at matche.
  3. MS-spektre (masseinterval400 - 4.000 m / z) erhverves in triplo ved hjælp af positiv ion-mode med en justerbar laser intensitet (3400 - 3800; trinstørrelse 50) med en acceptabel base topintensitet området 2.000 - 45.000. Enkelte skud erhverves for sub-spektre, med 400 i alt skud / spektrum, stop betingelser træder i kraft efter 800 sub-spektre er erhvervet (bestået eller ikke bestået) eller 400 sub-spektre pass godkendelseskriterier. I tilfælde af lav-rigelige prøver eller i nærvær af komplekse biologiske baggrunde den nedre ende af MS detekteringsområde bør hæves til 800 m / z. Desuden kan det være nødvendigt at fjerne salt og andre interfererende forbindelser med en prøve oprydning trin som beskrevet tidligere eller ved LC separation.
  4. MS datafiler (. T2D-filer) er eksporteret fra 4000 Series Explorer dataopsamlingssoftware og importeres til vores in-house laboratorium informationssystem, der udnytter MASCOT Distiller software (Matrix Science) til spektral behandling og topdetektion. Isotopiske kuverterer deconvoluted og 18 O-inkorporering nøgletal bestemmes automatisk ved hjælp af en algoritme svarende til den, der er beskrevet af Mason et al. 12 og tilpasset af vores gruppe 9. Alternativt software værktøjer som ZoomQuant 13 og Viper 14, samt kommercielle softwarepakker såsom som BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) og Mascot Distiller Kvantificering Toolbox (Matrix Science) kan deconvolute 18 O-typen data 15,16. 18 O-inkorporering forhold er udtrykt som de relative bidrag fra individuelle peptid isotop arter (dvs. peptider, som indeholder 16 O, 18 O 1 eller 18 O 2) til hele isotopiske kuvert.
  5. For hvert Tidsforløbet forsøg, de molekylmasser ([M + H] +) for alle detekterede peptid-arter er ekstraheret fra de tilknyttede MS datafiler og værdierne binned i en 100 ppm masse bredde.
  6. At mindst tre [M + H] + er indstillet til at blive forpligtet til at udfylde en bakke. I tilfælde af kendte substrater, er den filtrerede bin listen i forhold til en liste af proteolytiske spaltningsprodukter forudsagt fra substratet peptidsekvens med ExPASy FindPept værktøjet 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) og en 200 ppm masse error accept tolerance.
  7. MS / MS spektre erhverves for alle masseværdier af spaltningsprodukter forudsagt af den FindPept værktøj og for bin værdier, der har 18 O-inkorporering forbundet med dem. MS / MS data erhverves på 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer i 1kV reflektor positiv ion-mode, med en fast laser intensitet af 4200 og CID-gas i slukket tilstand. 50 skud er erhvervet i et randomiseret mønster per sub-spektre op til i alt 40 sub-spektre pr plet (hvilket giver en total på 2.000 skud / spot).
  8. MS / MS datafiler (. T2D-filer) er eksporteret fra 4000 Series Explorer dataopsamlingssoftware og importeres til vores in-house laboratorium informationssystem, der toppe detekteres og MS / MS peak lister er forbundet med de tilsvarende binned MS-data.
  9. For peptid identifikation, er MS / MS peak lister søgte mod SwissProt databasen vha. MASCOT søgemaskine med følgende søgeparametre: ingen enzym specificitet, 150 ppm prækursor-ion og 0,2 Da fragmention masse tolerancer.
  10. Peptid identifikationer kan desuden blive valideret ved hjælp af Data Explorer software (AB Sciex) ved at bekræfte de karakteristiske 18 O-inkorporering mønstre på tværs af y-serien fragmentioner som beskrevet af Shevchenko et al. 18.

C. Fremstilling af Spectral Time og 18 O-inkorporering Plots

Spectral tid matrikelnumre: MS datafiler (. T2D filer) for hver reaktion tidspunkt der eksporteres fra Det Data Explorer software som ASCII-filer ved hjælp af enmakro og importeres til en dataanalyse og grafisk software program (f.eks Origin af OriginLab) og vises som vandfald plots (Figur 3).

18 O-inkorporering marker: For hver binned peptid-spaltningsprodukt, er de relative bidrag af individuelle peptid isotop arter (16 O, 18 O 1 eller 18 O 2) ekstraheret i alle reaktions tidspunkter og afbildet mod tiden (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brugte palæo-tidsforløbet workflow til dynamisk overvåge inkorporeringen af 18 O-stabile isotoper til peptid spaltningsprodukter genereret af proteolytiske enzymer. Den foreslåede metode er et alsidigt værktøj til forholdsvis studere proteolytiske processeringssteder veje til forskellige underlag og protease kombinationer. Ved at udtage proteolytiske reaktioner gentagne gange i løbet af reaktionen tilvejebringer palæo-tidsforløbet eksperiment tidsopløst snapshots af substrat og produkt mængderne og behandling detaljer. Co-spotting prøver med en sur matrix opløsning på en målplade stopper den enzymatiske reaktion og matrix krystallisation yderligere bevarer prøvesammensætning. Derfor kan tidspunkter efterfølgende analyseres ved MALDI-TOF/TOF MS / MS efter afslutningen af ​​den enzymatiske reaktion. For at imødekomme den data-rige karakter af disse eksperimentelle arbejdsprocesser, vi implementeret en semi-automatisk bioinformatik system, der beregner 18 O-som indarbejderionforhold for hvert peptid. Figur 3 viser et repræsentativt spektral tidsforløb afbildning af behandling af peptid Endokinin C i ECE-1. Palæo-tidsforløbet data har flere dimensioner: Den udvidede betragtning af MS-data tværs af hele masseintervallet samtidigt viser mængderne af peptidsubstratet og mængderne af de peptidprodukter. Den tidsmæssige arrangement tillader dechifrering sekvensen af ​​spaltningsbegivenheder, og bestemmelse af, hvilke peptidfragmenter er stabile spaltningsprodukter. Den zoomet-i betragtning af MS-data afslører isotop konvolutter af hvert peptid og spaltning induceret 18 O-mærkning let identificeret ved dets karakteristiske isotop distribution. 18 O-mærkning muliggør positiv selektion af spaltningsprodukterne for efterfølgende identifikation af MS / MS. Alt i alt palæo-tidsforløbet assay indfanger dynamikken i proteolytisk processering og tillader evaluering foretrukne spaltningssteder af proteaser. Endnu et andet niveau af oplysningertion kan opnås, afhængigt af den enzymatiske mekanisme af den anvendte protease. Visse proteaser, såsom serinproteasen trypsin er i stand til covalent gentilknytningsangreb deres peptid-spaltningsprodukter. . Hydrolyse af acyl-enzym-mellemprodukt resulterer i inkorporering af en anden 18 O-atom i den C-terminale carboxylgruppe Figur 4 viser de resulterende ændringer i det relative bidrag fra de forskellige isotopomers over tid: Det oprindelige peptidbinding spaltningsreaktion resulterer i en 1:1 splittelse mellem 16 O og 18 O 1 peptidfraktioner. Carboxyl iltudvekslingen reaktion resulterer i forøgelse af de 18 O 2 fraktion til 25% forholdet mellem ligevægtskoncentrationen med et ledsagende fald i 16 O fraktionen. Proteaser stand til at katalysere carboxyl oxygen-reaktionen kan derfor anvendes i yderligere 18 O-mærkning arbejdsgang, at postdigestion mærkning af proteolytisk termini. I disse typer af eksperimenter, der er substrater først fordøjet i fravær af H 2 18 O, peptidprodukter renset og inkuberet med en frisk batch af protease, men denne gang i nærværelse af 50% H 2 18 O. Figur 4 viser forskelle i isotop inkorporering, der kan iagttages i disse to eksperimentelle arbejdsgange og forskellene i inkorporering hastighed mellem de enkelte peptidsubstrater. I postdigestion mærkning arbejdsproces, satsen for både 18 O-inkorporering bestemmes af carboxyl iltudvekslingen reaktion. Reaktionshastigheden afhænger af, hvor let proteasen interagerer med dens spaltningsprodukter. Affiniteten for reaktionsproduktet indirekte kan bruges til at udlede affiniteten af ​​protease til den oprindelige peptidsubstrat. Sådanne oplysninger kan være nyttigt at afgøre, hvilke peptidsekvenser er ideelle substrater for eksempel for tryptiske fordøjelser i kvantitative proteomics undersøgelser. Peptides, der let spaltes og dobbelt-mærket ved trypsin sandsynligvis vil være proteotypic peptider, der reproducerbart og kvantitativt dannet og derfor velegnede til komparative proteomics undersøgelser.

Ved lavt pH, udveksling oxygenatomer af carboxylsyregrupper med det vandige opløsningsmiddel 19-20. Denne reaktion kan anvendes som en alternativ metode til protease-katalyseret mærkning strategier til at indføre stabile isotoper til peptider. I aleo-tidsforløbet (syrekatalyseret mærkning beskæftiger 18 O-beriget vand) workflow, overvåges vi den langsomme inkorporering af 18 O-atomer i syntetiske peptider. Den syrekatalyserede iltudvekslingen stoppet efter co-krystallisation med matrixen løsning på MALDI målplade, effektivt "frysning" isotopen fordeling tilstand. Vi anvendte Angiotensin 1 som en model peptid og undersøgt dens isotop kuvert over tid (figur 5). En optagelse af to 18 O-atomer for hver bilboxyl gruppe blev observeret. Under de nuværende eksperimentelle betingelser var den syrekatalyserede carboxyl oxygen udskiftningsreaktion meget langsommere end protease-katalyseret udveksling 9 og nåede ligevægt efter 48 dage. Imidlertid aleo fremgangsmåde frembyder den fordel mærkning af peptider, der ikke genkendes af proteaser. Derudover er der en peptider multiple 18 O-atomer afhængigt af antallet af sure sidekæder, som kan resultere i fuldstændig adskillelse af isotop konvolutter af umærket og mærket arter. Den samlede masse skift giver oplysninger om antallet af sure rester i en given peptid og deres placering kan udledes af analysen af MS / MS fragmention masse forskydninger. 18 O-mærkede peptider viser næsten identiske kromatografisk adfærd som deres umærkede modparter, som muliggør deres sammenlignende analyse på samme elueringstid. Sammenfattende 18 O-mærkning syrekatalyseret kan tjene som alternativ til kemiske, enzymatic og metabolisk mærkning nærmer almindeligvis anvendes i kvantitative proteomics. En særlig lovende anvendelse af denne teknik er anvendelsen af 18 O-mærkede peptider som stabile isotop standarder.

Figur 1
Figur 1. 18 O-baseret mærkning tilbyder en række tidsforløb arbejdsgange. (I) Den protease-katalyseret palæo-tidsforløbet workflow giver mulighed for overvågning af dynamikken i proteolytiske spaltningsreaktioner. Afhængigt af protease, disse reaktioner resulterer i (a) single (fx ved visse metalloproteaser), eller (b) double 18 O-inkorporering (fx i tilfælde af visse serinproteaser). (II) Dobbelt 18 O-etiketteringsindretning sådan som trypsin kan også anvendes i postdigestion mærkning arbejdsgange, ved hvilken 18 O-inkorporering udelukkende medieres af protease-katalyseretcarboxyl iltudvekslingen reaktion. (III) I modsætning hertil bygger den aleo-tidsforløbet arbejdsgangen på syrekatalyserede carboxyl iltudvekslingen reaktioner af sure peptid side og terminale grupper. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Eksperimentelle arbejdsgange i palæo-og aleo-Tidsforløbet strategier. A) (I) I en protease-katalyseret palæo-tidsforløbet eksperiment, er substrater inkuberes med en protease i nærvær af H2 18 O resulterer i inkorporeringen af op til to 18 O-atomer afhængigt af protease. (II) I en paleo postdigestion mærkning eksperiment, er spaltningsprodukter fra en tidligere nedbrydning igen inkuberet med en protease af interesse i nærværelse af H 2 18 O. Proteaser kan dobbelt mærkning (i workflow I) vil katalysere inkorporeringen af to 18 O-atomer. (III) I en syrekatalyseret aleo eksperimentet, indarbejde alle sure funktionelle grupper 18 O-atomer B) Tidsforløbet Analyse:.. Med bestemte intervaller, er alikvoter af reaktionsblandingerne co-plettet med matrix på MALDI-målplader Upon MS- datafangst, der spektrale tid plots af peptid spaltningsreaktioner samt 18 O-inkorporering jordlodder af individuelle peptid arter genereret og spaltningsprodukter er udvalgt til MS / MS-baseret sekvens identifikation. Klik her for at se større figur .

pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Spektrale time plots viser dynamikken af proteolytiske spaltningsreaktioner. Ved at afbilde MS spektre af palæo-tidsforløbet eksperimenter i et vandfald arrangement er det muligt samtidigt at overvåge nedbrydningen af substratet og fremkomsten af mellemliggende og endelige spaltningsprodukter. Her, at spaltning af det bioaktive peptid Endokinin C med endothelin-konverterende enzym-1 (ECE-1) er vist. Spaltningsprodukter blev identificeret ved MS / MS og deres isotop kuverter viste de karakteristiske 18 O-inkorporering signaturer (fremhævet med rødt).

Figur 4
Figur 4. Serinproteaser, såsom trypsin medierer inkorporeringen af op til to 18 O-atomer i peptid-spaltningsprodukter. (I) Trong> I protease-baserede mærkning arbejdsgang, peptid-bindingsspaltning reaktion resulterer i en 50% enkelt 18 O-inkorporering ratio for frisk genereret peptid-spaltningsprodukter (sorte prikker angiver umærkede, røde single-mærkede peptid-fraktioner). Proteaser, binde deres reaktionsprodukter (fx serinproteaser, såsom trypsin) yderligere katalysere inkorporeringen af en anden 18 O atom via carboxyl oxygen udskiftningsreaktion (grønne prikker, dobbelt-mærket peptid fraktion). Ved ligevægt, en etiket fordeling af 0.25:0.5:0.25. Er (un-;, enkelt-dobbelt-mærket) nåede (II) I postdigestion mærkning af proteolytisk termini workflow, ingen peptidbindingsspaltninger forekomme. I stedet er inkorporeringen af op til to 18 O-atomer udelukkende er baseret på den carboxyl oxygen udskiftningsreaktion. Derfor 18 O-inkorporering kun sker med proteaser, der REBIND deres peptid spaltningsprodukter.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Figur 5
Figur 5. Syrekatalyseret 18 O-mærkningen fører til inkorporeringen af to 18 O-atomer pr carboxylgruppe. Løbet af eksperimentet undergik isotopiske konvolut af angiotensin-1 multiple 2 Da mass forskydninger (punkterede linier), der svarer til optagelsen af 18 O-atomer. De steder, 18 O-inkorporering er fremhævet i aminosyresekvensen (blå).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved at kombinere stabil isotop mærkning og høj opløsning massespektrometri på en tidsopløst måde, gør det muligt for palæo-tidsforløbet fremgangsmåde til en dynamisk analyse af dannelsen af ​​peptidprodukter. Assayet kan anvendes til at generere stabile isotopmærkede peptider til kvantitative og kvalitative proteomics undersøgelser og vurdere kinetikken hvorved proteotypic peptider genereres. Endvidere er palæo-tidsforløbet designet til at evaluere proteolytiske omsætningsveje under specifikke, fysiologisk relevant betingelser ex vivo. Endogene proteiner, peptider og proteaser såvel som syntetiske peptider og rekombinante proteaser kan anvendes i arbejdsprocessen. Afhængigt af den særlige proteolytiske reaktion, der skal undersøges, assaybetingelser og spotting tider kan justeres for at skabe et optimalt prøveudtagning af reaktionsprocessen. Er vores erfaring, er det nyttigt at bremse proteolytiske reaktioner ned (fx ved at bruge lave enzymkoncentrationer, rumtemperatur) for at muliggøre bekvemme manuel sampleintervaller Ligesom med andre stabil-isotop mærkning metoder er afvigelser for de eksperimentelle 18 O-inkorporering forholdet målinger lille -. typisk mindre end 5% for toppe med tilstrækkelige ion statistikker. Den overordnede protokol kan let tilpasses andre assayformater, for eksempel screening af en stor mængde syntetiske substrater eller karakterisering af den proteolytiske processering af endogene peptider fra komplekse biologiske prøver (f.eks celledyrkningsmedier, kropsvæsker). Vi har tidligere vist, hvordan palæo-fremgangsmåde kan deles med en LC-separationstrinnet, og anvendes til at definere den dynamiske sammensætning af human spyt-peptidome 9. Proteolytiske signaturer identificeret af palæo-tidsforløbet giver vigtige kendsgerninger med hensyn til substratspecificitet af proteasen af interesse. Desuden de tidsopløst data giver kinetiske oplysninger. En sådan viden er særlig nyttig ved evaluering af proteotypic peptider til kvantitative proteomics undersøgelser, hvor valget af reproducerbare og meget rigelig target peptiderne er afgørende 21. Ligeledes identificere hastighedsbegrænsende trin i proteolytiske pathways, er af stor interesse for udvikling af hidtil ukendte protease-baserede lægemidler. Proteaser er nøglefaktorer i mange fysiologiske og patologiske processer (f.eks kardiovaskulære lidelser, neurodegenerative sygdomme, kræft), og sådanne observationer kan åbne op for nye muligheder for terapeutiske indgreb. The aleo-strategi - syrekatalyseret mærkning af carboxylgrupper - kan let påføres syntetiske og endogene peptider at fremstille stabile isotop kodede standarder. Kinetikken af ​​den syrekatalyserede reaktion er meget langsommere end den enzymkatalyserede reaktion. Derfor eksperimenter skal nøje planlægges på forhånd. Aleo-tidsforløbet er en low-cost alternativ til kemiske, metaboliske og syntetisk mærkning metoder for tiden anvendes i proteomics undersøgelser. Mærkningen proces kan overvåges for at validere, at 18 O-inkorporering nået ligevægt, hvilket kan være en fordel frem for andre stabile isotopmærkning metoder. Sammenfattende er de Leo-Tidsforløbet arbejdsgange beskrevet her alsidige værktøjer, der kan kreativt være ansat i mange kvalitative og kvantitative proteomics undersøgelser samt protease forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PepClean C-18 Spin Columns Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI target plate AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF/TOF AB SCIEX
Table 1. Materials
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich 70990-1G-F
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) R&D Systems 1784-ZN
Trypsin Gold Promega V5280
Water-18O, 97 atom % 18O Sigma Aldrich 329878-1G
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo 28904
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments AB SCIEX 4333604
Table 2. Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

Tags

Biokemi Molecular Biology Proteins Proteomics kemi fysik MALDI-TOF massespektrometri proteomics proteolyse kvantificering stabil isotop mærkning etikettering katalysator peptider 18-O beriget vand
Protease-og syrekatalyseret Mærkning arbejdsgange Anvender<sup&gt; 18</sup&gt; O-beriget Water
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klingler, D., Hardt, M. Protease-More

Klingler, D., Hardt, M. Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water. J. Vis. Exp. (72), e3891, doi:10.3791/3891 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter