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Biology

Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt Published: February 20, 2013 doi: 10.3791/3891

Summary

Stabile Isotopenmarkierung Workflows Einsatz

Abstract

Stabile Isotope sind unverzichtbare Werkzeuge in der biologischen Massenspektrometrie. Historisch gesehen, haben 18 O-stabilen Isotopen wurde ausgiebig genutzt, um die katalytischen Mechanismen von proteolytischen Enzymen 1-3 studieren. Mit dem Aufkommen der Massenspektrometrie basierenden Proteomik ist die enzymatisch-katalysierten Einbau von 18 O-Atomen, die aus stabilen Isotopen angereicherte Wasser zu einem beliebten Methode quantitativ zu vergleichen Proteinexpression Ebenen (Übersichtsartikel von Fenselau und Yao 4, Miyagi und Rao 5 und Ye et al. 6). 18 O-Kennzeichnung stellt eine einfache und preiswerte Alternative zur chemischen (zB iTRAQ, ICAT) und metabolische (zB SILAC) Markierungstechniken 7. Abhängig von der Protease verwendet wird, kann 18 O-Kennzeichnung in der Einarbeitung von bis zu zwei 18 O-Atomen in der C-terminalen Carboxylgruppe der Spaltprodukt 3 führen 8 unterteilen. In unserem Paléo (p rotease-a ssisted l Abeling e mploying 18 O-angereichertem Wasser) Anpassung der enzymatischen 18 O-Kennzeichnung, verwendeten wir 50% 18 O-angereichertem Wasser Unterscheidungskraft Isotopensignaturen ergeben. In Kombination mit hochauflösende Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight-Tandem-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/TOF MS / MS) können die charakteristischen Isotop Umschläge zu Spaltprodukten mit einem hohen Maß an Spezifität zu identifizieren. Wir haben vorher haben die Paläo-Methodik zur Erfassung und Charakterisierung endogene Proteasen 9 und überwachen proteolytische Reaktionen 10-11. Da Paleo kodiert das Wesen der proteolytischen Spaltung, ist der Versuchsaufbau einfache und biochemische enrichment Schritte von Spaltprodukten umgangen werden kann. Das Paléo-Verfahren kann leicht an (i) Zeitverlauf Experimente, die die Dynamik der proteolytischen Spaltung Reaktionen und (ii) die Analyse der Proteolyse in komplexen biologischen Proben, die physiologischen Bedingungen stellen zu überwachen erweitert werden. Paleo-Zeitverlauf Experimente helfen identifizieren geschwindigkeitsbestimmenden Verarbeitungsschritte und Intermediate in komplexen proteolytischen Stoffwechselweg Reaktionen. Weiterhin erlaubt die Paleo-Reaktion wir proteolytische Enzyme wie die Serinprotease Trypsin, die fähig, ihre Spaltprodukte binden und katalysieren den Einbau eines zweiten 18 O-Atom ist identifizieren. Solche "double-Kennzeichnung" Enzyme können für postdigestion 18 O-Kennzeichnung, bei denen Peptide ausschließlich durch die Carboxyl-Sauerstoff-Austausch sind beschriftet werden. Unsere dritte Strategie erstreckt Kennzeichnung beschäftigt 18 O-angereichertem Wasser über Enzyme und nutzt sauren pH-Bedingungen, um 18 O-stabilen Isotopen Zeichen einzuführenturen in Peptide.

Protocol

Die vorgestellten LeO-Workflows ermöglichen die stabile Isotopenmarkierung von Proteinverdaus und synthetischen Peptiden. Diese zeitliche Verlauf Experimente (Abbildung 1) sind für vergleichende und quantitativen Proteomik Studien sowie Protease Forschung. Jeder Workflow besteht aus zwei experimentellen Schritte (Abbildung 2): A) Die zeitaufgelöste Abtastung des jeweiligen 18 O-stabilen Isotopen-codierten Reaktion (Protease-katalysierten Peptidspaltung; Protease-katalysierten Carboxyl-Sauerstoff-Austausch; säurekatalysierte Carboxyl Sauerstoffaustausch Reaktion) und B) Analyse durch Massenspektrometrie und grafische Darstellung der 18 O-Einbau Kinetik.

A. Zeitverlauf Experimente

I. Paleo-Zeitverlauf: Protease-katalysierten Kennzeichnung von proteolytischen Spaltungen

  1. (Optional) Disulfidbindungen von Proteinen (10 uM) und Peptide (250 uM) mit DTT (Endkonzentration 2,5 mM) reduziertin 25 mM NH 4 HCO 3 (beide frisch zubereiteten) durch Inkubation für 30 min bei 50 ° C.
  2. (Optional) herunter Cysteine ​​mit Iodacetamid alkyliert (Endkonzentration 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 durch Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  3. Je nach Protease von Interesse, benötigen Protein / Peptid-Lösungen zu sein bereinigten um restliche Puffer und Alkylierungsmittel entfernen. Verwenden PepClean C-18 Spin-Säulen (Thermo) für Peptid-Bereinigung und Vivaspin Zentrifugalkonzentratoren (Sartorius) Puffer für Protein-Proben austauschen.
  4. Abgeblasen / exchange Peptide / Proteine ​​in 20 ul Protease Reaktionspuffer (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; Trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0), 1:1 (v / v) H 2 endgültige 18 O (95%, Sigma Isotec).
  5. Entnommen wird eine Null Zeitpunkt Probe vor der Zugabe der Protease: Mix 0,5 ul des Reaktionsgemisches und 0,5 ul alpha Cyano-4-HydroxyzimtsäureSäure-Matrix (10 mg / ml in 50% Acetonitril, 0,1% TFA). Spot-Probe auf einem Opti-TOF 384 MALDI Zieltafel (AB SCIEX) und lassen Sie die Lösungsmittel-Tröpfchen bei Raumtemperatur bis trocken (ca. 5 min).
  6. Teilen Sie die Reaktionslösung in zwei Aliquots. Bei Raumtemperatur oder der empfohlenen Temperatur für das jeweilige Enzym:;: der erste Aliquot wird mit der Protease von Interesse (0,04 nM 75 nM Trypsin ECE-1) inkubiert werden. Das zweite Aliquot wird ohne Protease inkubiert werden und wird als Kontrollprobe zu dienen. Das erste Aliquot eine Standardprobe für Protease-katalysierte 18 O-Kennzeichnung und kann für Peptid-und Protein-Identifizierung, Detektion von proteolytischen Wirkungen und Überwachung der proteolytischen Spaltung Reaktionen eingesetzt werden. Das zweite Aliquot wird verwendet um zu zeigen, dass 18 O-Einbau durch die Protease induziert wird, daher weder Kennzeichnung noch Spaltung wird für diese Probe erwartet.
  7. Befolgen Sie die Reaktion durch Entfernen Reaktionsaliquots und Schmierblutungen sie als described unter Schritt 5 in Zeitabständen scheinen, als fit. Die oben beschriebenen Reaktionsbedingungen werden verwendet, um eine proteolytische Reaktion für bis zu vier Tagen (ca. 24 Punkte) zu überwachen. Starten Probenahme alle 5 min bis 30 min, dann erkennen alle 30 min bis 2 h, dann ist jede Stunde bis 8 Stunden und alle 8 Stunden bis 4 Tage. Spaltprodukte sollte innerhalb der ersten 12 Stunden erscheinen und das Substrat sollte vollständig hydrolysiert nach 24 Stunden. Verlängerte Reaktionszeit Inkubationszeiten gestatten, um stabile Reaktionsprodukte, die aus diskreten Reaktionszwischenprodukte, das weiter verarbeitet werden, sind zu definieren. Je nach Fragestellung und bestimmten Enzym-Substrat-Paare haben Spotting Zeiten und Inkubationstemperatur moduliert werden, um eine optimale Reaktion Probenahme zu gewährleisten.
  8. Nachdem die letzte Reaktion Zeitpunkt ist fleckig oder zwischen ausgedehnten Spotting Zeitabständen die MALDI-Target Platte wird auf MALDI-TOF/TOF MS / MS-Analyse vorgelegt, wie unten (Abschnitt B) beschrieben.

II. Paleo-Zeitverlauf: Postdigestion Etikettierung von proteolytischen Termini

  1. (Optional) Disulfidbindungen von Proteinen (10 uM) und Peptide (250 pM) mit DTT (Endkonzentration 2,5 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 (beide frisch hergestellt) durch Inkubation reduziert und 30 min bei 50 ° C.
  2. (Optional) herunter Cysteine ​​mit Iodacetamid alkyliert (Endkonzentration 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 durch Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  3. Abhängig von der Protease von Interesse, benötigen Protein / Peptid-Lösungen zu sein bereinigten um restliche Puffer und Alkylierungsmittel entfernen. Verwenden PepClean C-18 Spin-Säulen für die Peptid-Bereinigung und Vivaspin Zentrifugalkonzentratoren für Protein-Puffer Austausch.
  4. Abgeblasen / tauschen die bereinigten Peptid products / Proteine ​​in 20 ul Protease Reaktionspuffer (z. B. Trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) und Verdau mit Protease von Interesse bis zur Fertigstellung (z. B. Trypsin: 0,04 nM; 37 ° C; 12 h).
  5. Cleanup Spaltprodukte mit PepClean C-18 Spin-Säulen. Dieser Schritt wird Eliminierung restlicher Proteaseaktivitäten.
  6. Abgeblasen / tauschen die bereinigten Peptid Produkte in 20 ul Protease Reaktionspuffer (Trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0), 1:1 (v / v) final H 2 18 O
  7. Entnommen wird eine Null Zeitpunkt Probe vor der Zugabe des Enzyms: Mix 0,5 ul des Reaktionsgemisches und 0,5 ul alpha Cyano-4-Hydroxyzimtsäure Matrix (10 mg / ml in 50% Acetonitril, 0,1% TFA). Spot-Probe auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie die Lösungsmittel-Tröpfchen bei Raumtemperatur bis trocken (ca. 5 min).
  8. Teilen Sie die Reaktionslösung in zwei Aliquots. Bei Raumtemperatur oder der empfohlenen Temperatur für das jeweilige Enzym: der erste Aliquot wird mit Protease von Interesse (0,04 nM zB Trypsin) inkubiert werden. Das zweite Aliquot wird ohne Protease inkubiert werden und wird als Kontrolle zu dienen. Die ersteAliquot eine Standardprobe für Protease-katalysierten 18 O-postdigestion Beschriftungen und können für Peptid-und Protein-Quantifizierung verwendet werden. Das zweite Aliquot wird verwendet um zu zeigen, dass 18 O-Einbau durch die Protease katalysiert wird, daher wird keine Markierung für diese Probe erwartet.
  9. Befolgen Sie die Reaktion durch Entfernen Reaktionsaliquots und Spotting ihnen wie unter Schritt 7 beschrieben.) In zeitlichen Abständen scheinen, als fit. Zum Beispiel sahen wir zunächst alle 5 min bis zu 30 min und jede 15 min nach, dass die Carboxyl-Sauerstoff-Austausch durch Trypsin katalysiert überwachen.
  10. Nachdem die letzte Reaktion Zeitpunkt ist fleckig oder zwischen ausgedehnten Spotting Abständen die MALDI-Target Platte wird auf MALDI-TOF/TOF MS / MS-Analyse vorgelegt, wie unten (Abschnitt B) beschrieben.

III. Aleo-Zeitverlauf: Säurekatalysierte Kennzeichnung von Carboxylgruppen

  1. Inkubieren einzelnen Peptide (50 nM) mit 1:1 (v / v) 18 O-angereicherte Wasser in ter An-oder Abwesenheit (Kontrolle) von 0,1% (v / v) Trifluoressigsäure endgültige (Gesamtvolumen 30 ul).
  2. Probe die Reaktionsprodukte täglich für 48 Tage durch Co-Spotting eine 0,5 ul Aliquots der Mischung mit 0.5μl von alpha Cyano-4-Hydroxyzimtsäure Matrix (10 mg / ml in 50% Acetonitril, 0,1% TFA) direkt auf ein MALDI-Target Platte.
  3. Zwischen Spotting Abständen und nach dem Spotten der endgültigen Reaktion Zeitpunkt einzureichen MALDI Zieltafel für MALDI-TOF/TOF MS / MS-Analyse wie in Abschnitt B beschrieben

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Datenerfassung und-analyse

  1. Massenspektren werden auf einem 4800 MALDI TOF / TOF-Analysator (AB SCIEX) erworben.
  2. Vor der Analyse wird das Gerät mit einer Mischung von Peptid-Standards (Mass Standards Kit zur Kalibrierung von AB SCIEX TOF / TOF Instrumente) mit einer zulässigen Gesamtmasse Messfehler von ± 50 ppm und einer minimalen Anzahl von sechs Gipfeln passend kalibriert.
  3. MS-Spektren (MassenbereichSchrittgröße 50) mit einer annehmbaren Base Peakintensität Bereich von 2.000 - 45.000; 400 - 3.800 - 4.000 m / z) werden in dreifacher Ausfertigung mit positiven Ionen-Modus mit einer einstellbaren Laserintensität (3.400 erworben. Einzelaufnahmen für Sub-Spektren erworben werden, mit insgesamt 400 Schuss / Spektrum, Stopp-Bedingungen in Kraft nach 800 sub-Spektren kommen erworben werden (bestanden oder nicht bestanden) oder 400 sub-Spektren Pass Akzeptanzkriterien. Im Falle einer low-reiche Proben oder in Gegenwart komplexer biologischer Herkunft das untere Ende des MS Erfassungsbereich sollte bis 800 m / z erhöht werden. Darüber hinaus kann es erforderlich sein, Salz und anderen störenden Verbindungen mit einer Probe Aufräumsegments wie früher oder durch LC-Trennung beschrieben zu entfernen.
  4. MS-Dateien (. T2d Dateien) werden von der 4000 Series Explorer Datenerfassungs-Software exportiert und importiert in unsere in-house Labor-Informations-System, das MASCOT Distiller-Software (Matrix Science) zur spektralen Verarbeitung und Peak-Erkennung nutzt. Isotopic Umschlägesind entfalteten und 18 O-Einbau-Verhältnisse automatisch unter Verwendung eines Algorithmus ähnlich dem von Mason et al. 12 beschrieben und angepasst durch unsere Gruppe 9. Alternativ Software-Tools wie ZoomQuant 13 und Viper 14, als auch kommerzielle Software-Pakete wie Als BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) und Mascot Distiller Quantifizierung Toolbox (Matrix Science) können dekonvolutieren 18 O-Typ-Daten 15,16. 18 O-Einbau-Verhältnisse als die relativen Beiträge der einzelnen Peptid-Isotop Arten ausgedrückt werden (dh Peptide mit 16 O, 18 O 18 O 1 oder 2) auf die gesamte isotopischen Umschlag.
  5. Für jede Zeitverlauf Experiment wurden die molekularen Massen ([M + H] +) für alle detektierten Peptidspezies werden aus den zugehörigen MS-Daten extrahiert, und die Werte bei einer 100 ppm Masse Breite klassierten.
  6. At mindestens drei [M + H] + sind so eingestellt, erforderlich, um eine bin zu füllen. Im Falle der bekannten Substrate wird das gefilterte bin Liste in eine Liste von proteolytischen Spaltprodukten vorhergesagten von dem Substrat unter Verwendung der Peptidsequenz ExPASy FindPept Werkzeug 17 (Vergleich http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) und einen 200 ppm Masse Fehler Akzeptanz Toleranz.
  7. MS / MS-Spektren sind für alle Massewerte von Spaltprodukten durch den FindPept Tool und bin Werte, die 18 O-Gründungen mit ihnen verknüpft sind vorausgesagt erworben. MS / MS-Daten werden auf dem 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer in 1kV Reflektor positive Ionen-Modus erworben, mit einer festen Laserintensität von 4200 und CID-Gas im ausgeschalteten Zustand. 50 Aufnahmen werden in einem randomisierten Muster pro Sub-Spektren bis zu einem Gesamtbetrag von 40 sub-Spektren pro Spot (was eine Gesamtmenge von 2.000 Schuss / spot) erworben.
  8. MS / MS-Daten-Dateien (. T2d Dateien) werden von der 4000 Series Explo exportiertrer Datenerfassungs-Software importiert und in unsere in-house Labor-Informations-System, werden Peaks erkannt und MS / MS Peaklisten werden mit den entsprechenden klassierte MS Daten verbunden sind.
  9. Für Peptid-Identifizierung, werden MS / MS Peaklisten gegen die SwissProt Datenbank mit dem MASCOT Suchmaschine mit folgenden Suchparametern gesucht: kein Enzym Spezifität, 150 ppm Vorläufer-Ion und 0,2 Da Fragment Ionenmasse Toleranzen.
  10. Peptid Identifikationen kann zusätzlich unter Verwendung des validierten Daten-Explorer-Software (AB SCIEX) durch Bestätigen der charakteristischen 18 O-Inkorporation Muster über y-Reihe Fragmentionen wie durch Shevchenko et al. 18.

C. Herstellung von Spectral Zeit und 18 O-Einbau Plots

Spectral Zeitdiagramme: MS-Dateien (. T2d Dateien) für jede Reaktion Zeitpunkt werden aus dem Data Explorer-Software als exportiert ASCII-Dateien mit einerMakro-und Importieren in eine Datenanalyse und Grafik-Software-Programm (zB Origin von OriginLab) und als Wasserfall Plots (Abbildung 3).

18 O-Inkorporation Plots: Für jede klassierte Peptidspaltungsproduktes, die jeweiligen Beiträge der einzelnen Peptid Isotop Spezies (16 O, 18 O 18 O 1 oder 2) sind in allen Punkten Reaktionszeit extrahiert und gegen die Zeit aufgetragen (Abb. 4).

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Representative Results

Wir nutzten die Paleo-Zeitverlauf Workflow dynamisch überwachen den Einbau von 18 O-stabilen Isotopen in Peptid Spaltprodukte durch proteolytische Enzyme erzeugt. Der vorgestellte Ansatz ist ein vielseitiges Werkzeug vergleichsweise studieren proteolytische Prozessierung Wege für unterschiedliche Substrat und Protease-Kombinationen. Durch Abtasten proteolytischen Reaktionen wiederholt über den Verlauf der Reaktion stellt das Paleo-Zeitverlauf Experiment zeitaufgelösten Momentaufnahmen von Substrat und Produkt Häufigkeiten und Verarbeiten Details. Co-Spotting Proben mit sauren Matrixlösung auf einer Zielplatte stoppt der enzymatischen Reaktion und Kristallisation Matrix ferner bewahrt Probenzusammensetzung. Daher kann nachträglich von Zeitpunkten MALDI-TOF/TOF MS / MS nach Abschluß der enzymatischen Reaktion analysiert werden. Um die Daten-reiche Natur dieser experimentellen Workflows gerecht zu werden, haben wir ein semi-automatische Bioinformatik-System, das 18 O-Incorporat berechnetIonenverhältnisse für jedes Peptid. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative spektrale Zeitverlauf Grundstück von der Verarbeitung von Peptid Endokinin C von ECE-1. Paleo-Zeitverlauf Daten multidimensional: Die erweiterte Ansicht der MS-Daten über den gesamten Massenbereich gleichzeitig zeigt die Häufigkeiten der Peptid-Substrat als auch die Häufigkeiten der Peptid-Produkte. Die zeitliche Anordnung ermöglicht die Reihenfolge der Entschlüsselung Spaltungsereignisse und Bestimmen, welche Peptidfragmente stabile Spaltprodukte sind. Die vergrößerten Ansicht des MS-Daten offenbart die Umschläge Isotop von jedem Peptid-induzierten Spaltung und 18 O-Kennzeichnung wird leicht durch seine charakteristische Isotopenverteilung identifiziert. 18 O-Kennzeichnung ermöglicht die positive Selektion von Spaltprodukten für nachfolgende Identifizierung durch MS / MS. Insgesamt erfasst die Paleo-Zeitverlauf Assay die Dynamik der Prozessierung und ermöglicht die Bewertung bevorzugte Spaltstellen von Proteasen. Doch eine andere Ebene von Informationtion erhalten je nach enzymatischen Mechanismus des verwendeten Protease werden. Bestimmte Proteasen wie die Serinprotease Trypsin Lage sind, kovalent Rebinding ihren Peptid-Spaltprodukte. . Die Hydrolyse der Acylenzym Zwischenergebnisse in dem Einbau eines zweiten 18 O-Atom in der C-terminalen Carboxylgruppe Abbildung 4 zeigt die resultierenden Verschiebungen in der relativen Beiträge der einzelnen Isotopomere im Zeitverlauf: Der anfängliche Peptidbindung Spaltungsreaktion Ergebnisse in einem 1:1-Spaltung zwischen dem 16 O und 18 O 1 Peptidfraktionen. Die Carboxyl Sauerstoffaustausch Reaktion resultiert in der Erhöhung des O 2-Anteil 18 bis 25% des Verhältnisses im Gleichgewicht mit einer gleichzeitigen Abnahme der 16 O Fraktion. Proteasen katalysieren vermag die Carboxyl Sauerstoffaustausch Reaktion kann daher für einen zusätzlichen 18 O-Kennzeichnung Arbeitsablauf verwendet werden, die Etikettierung von proteolytischen postdigestion termini. In diesen Arten von Experimenten werden Substrate zunächst in Abwesenheit von H 2 18 O, Peptid Produkten gereinigt und gewaschen und mit einer frischen Charge der Protease verdaut, diesmal aber in Gegenwart von 50% H 2 18 O 4 zeigt die Unterschiede in der Isotopen-Inkorporation, die in diesen zwei experimentelle Arbeitsabläufe und die Unterschiede in der Einbeziehung Geschwindigkeit zwischen den einzelnen Peptid-Substrate beobachtet werden können. In der postdigestion Kennzeichnung Workflow wird die Rate für beide 18 O-Eingemeindungen durch die Carboxyl Sauerstoffaustausch Reaktion bestimmt. Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt, wie ohne weiteres die Protease interagiert mit deren Spaltprodukte. Die Affinität für das Reaktionsprodukt kann indirekt verwendet werden, um die Affinität der Protease auf die ursprüngliche Peptidsubstrat abzuleiten. Solche Informationen könnten nützlich sein, um festzustellen, welche Peptidsequenzen ideale Substrate zum Beispiel für tryptischen Verdaus in der quantitativen Proteomik Studien sind. Peptides, die leicht gespalten werden und doppelt markierten durch Trypsin wahrscheinlich proteotypischen Peptide, die reproduzierbar und quantitativ gebildet werden und daher ideal für vergleichende Proteomik Studien geeignet sein.

Bei niedrigem pH, Austausch Sauerstoffatome Carbonsäuregruppen mit dem wässrigen Lösungsmittel 19-20. Diese Reaktion kann als ein alternativer Ansatz, um die Protease-katalysierte Markierungsstrategien, stabile Isotope in Peptide einzuführen verwendet werden. In der aleo-Zeitverlauf (Säure-katalysierten Kennzeichnung beschäftigt 18 O-angereichertem Wasser) Workflow, beobachteten wir die langsame Aufnahme von 18 O-Atome in synthetischen Peptiden. Die Säure-katalysierten Sauerstoffaustausch gestoppt, nachdem Co-Kristallisation mit dem Matrix-Lösung auf der MALDI Zieltafel, effektiv "Einfrieren" der Isotopenverteilung Zustand. Wir verwendeten ein Angiotensin als Modell-Peptid und untersucht sein Isotop Hüllkurve über die Zeit (Abbildung 5). Eine Aufnahme von zwei 18 O-Atome für jede KabineCarboxyl-Gruppe beobachtet wurde. Unter den gegenwärtigen experimentellen Bedingungen war die säurekatalysierte Carboxyl-Sauerstoff-Austausch viel langsamer als der Protease-katalysierten Austausch 9 und erreichte Gleichgewicht erst nach 48 Tagen. Allerdings bietet die aleo Ansatz den Vorteil der Markierung von Peptiden, die nicht durch Proteasen erkannt werden. Zusätzlich enthalten Peptide multiple 18 O-Atomen je nach der Anzahl der sauren Seitenketten, die in voller Abtrennung der Isotope Einhüllenden unmarkierten und markierten Spezies führen kann. Die Gesamtmasse Verschiebung liefert Informationen über die Anzahl von sauren Resten in einem gegebenen Peptid und deren Lage kann durch die Analyse der MS / MS-Fragment Ionenmasse Verschiebungen ableiten. 18 O-markierte Peptide anzuzeigen nahezu identische chromatographische Verhalten als ihre unmarkierten Gegenstücken, welche ermöglicht ihre vergleichende Analyse auf gleiche Elutionszeit. Zusammenfassend säurekatalysierte 18 O-Markierung kann als Alternative zur chemischen, en dienenenzymatische und metabolische Markierung nähert häufigsten verwendeten in der quantitativen Proteomik. Ein besonderer vielversprechende Anwendung dieser Technik ist die Verwendung von 18 O-markierte Peptide als stabiles Isotop Standards.

Abbildung 1
Abbildung 1. 18 O-basierte Kennzeichnung bietet eine Vielzahl von zeitlichen Verlauf Workflows. (I) Die Protease-katalysierte Paleo-Zeitverlauf Arbeitsablauf ermöglicht die Überwachung der Dynamik der proteolytischen Spaltung Reaktionen. Abhängig von Protease, diese Reaktionen führen (eine) einzelne (z. B. im Falle von bestimmten Metalloproteasen) oder (b) double 18 O-Einbaurate (z. B. im Falle von bestimmten Serinproteasen). (II) Doppelte 18 O-Etikettierer solchen B. Trypsin kann auch in postdigestion Kennzeichnung Workflows verwendet werden, in denen 18 O-Inkorporation allein durch die Protease-katalysierte vermitteltCarboxyl-Sauerstoff-Austausch. (III) Im Gegensatz dazu setzt die aleo-Zeitverlauf Workflow auf den Säure-katalysierten Carboxyl-Sauerstoff-Austausch von sauren Peptids Seite und Endgruppen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Experimentelle Abläufe der Paläo-und aleo-Zeitverlauf Strategien. A) (I) In einem Protease-katalysierte Paleo-Zeitverlauf Experiment Substrate mit einer Protease in Gegenwart von H 2 18 O inkubiert was den Einbau von bis zu zwei O-Atome 18 abhängig von der Protease. (II) In einem Paléo postdigestion Markierungsexperiment werden Spaltprodukte aus einer vorherigen Aufschluß mit erneut inkubiert eine Protease von Interesse in der Gegenwart von H 2 18 O Proteasen in der Lage doppelte Kennzeichnung (im Workflow I) katalysiert den Einbau von zwei 18 O-Atome. (III) In einer säurekatalysierten aleo Experiment übernehmen alle sauren funktionellen Gruppen 18 O-Atomen B) Zeitverlauf Analyse:.. In Zeitintervallen wurden Aliquots der Reaktionsansätze mit Matrix auf MALDI-Target Platten zusammenarbeiten gesichtet Nach MS- Datenerfassung, spektrale Zeitdiagramme der Peptidspaltung Reaktionen sowie 18 O-Einbau Plots der einzelnen Peptid-Spezies erzeugt und Spaltprodukte sind für MS / MS-basierte Sequenzidentifizierung ausgewählt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 3. Spektralen Zeitdiagramme zeigen die Dynamik der proteolytischen Spaltung Reaktionen. Durch Auftragen MS-Spektren von Paleo-Zeitverlauf Experimenten in einem Wasserfall Anordnung ist es möglich, gleichzeitig überwachen den Abbau des Substrats und der Entstehung von Zwischen-und abschließenden Spaltprodukte. Hier wird die Spaltung des bioaktiven Peptids Endokinin C durch Endothelin-Converting-Enzyme-1 (ECE-1) gezeigt. Spaltprodukte wurden durch MS / MS und ihre Isotopen-Umschläge erscheint die charakteristischen 18 O-Einbau Signaturen (rot markiert) identifiziert.

Abbildung 4
Abbildung 4. Serinproteasen wie Trypsin vermitteln die Einarbeitung von bis zu zwei 18 O-Atomen in Peptid-Spaltprodukte. (I) trong> In der Protease-basierten Markierung Arbeitsablauf, die Peptidbindungsspaltung Reaktion resultiert in einer 50% einzigen 18 O-Einbauverhältnis für frisch erzeugte Peptid-Spaltprodukte (schwarze Punkte geben unmarkierten, rot-markiertes Peptid-Fraktionen). Proteasen, die ihre Reaktionsprodukte (z. B. Serinproteasen wie Trypsin) binden weiteren katalysieren die Einarbeitung eines zweiten 18 O-Atom über das Carboxy-O-Austauschreaktion (grüne Punkte, doppelt markierten Peptidfraktion). Im Gleichgewicht, ein Label Verteilung der 0.25:0.5:0.25. (Un-, Einzel-, Doppel-markiert) erreicht wird (II) In der postdigestion Kennzeichnung von proteolytischen Termini Workflow treten keine Peptidbindung Spaltungen. Stattdessen wird die Einarbeitung von bis zu zwei O-Atome 18 ausschließlich auf der Carboxyl Sauerstoffaustausch Reaktion. Deshalb, 18 O-Einbau erfolgt nur mit Proteasen, die ihre Peptidspaltung Produkte binden.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Säurekatalysierte 18 O-Kennzeichnung führt zum Einbau von zwei 18 O-Atomen pro Carboxyl-Gruppe. Im Verlauf des Experiments wurden die isotopische Umschlag von Angiotensin-1 2 Da mehrere Masse Verschiebungen (gestrichelte Linien) entsprechend der Aufnahme unterzog von 18 O-Atomen. Die Standorte der 18 O-Einbau sind in der Aminosäuresequenz (blau) markiert.

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Discussion

Durch die Kombination von stabilen Isotopenmarkierung und hochauflösende Massenspektrometrie in einer zeitaufgelösten Weise ermöglicht die Paleo-Zeitverlauf-Methode für eine dynamische Analyse der Erzeugung von Peptid-Produkte. Der Assay kann verwendet werden, um stabile isotopenmarkierte Peptide für die quantitative und qualitative Proteomstudien erzeugen und die Kinetiken, mit denen proteotypischen Peptiden erzeugt werden ausgewertet werden. Weiterhin ist Paleo-Zeitverlauf zur proteolytischen Wege unter speziellen, physiologisch relevanten Bedingungen ex vivo zu bewerten. Endogene Proteine, Peptide und Proteasen sowie synthetische Peptide und rekombinante Proteasen im Arbeitsablauf verwendet werden können. Abhängig von der jeweiligen proteolytischen Reaktion untersucht werden, Assaybedingungen und Spotting Zeiten eingestellt werden, um für eine optimale Abtastung des Reaktionsprozesses bereitzustellen. Nach unserer Erfahrung ist es hilfreich, proteolytische Reaktionen verlangsamen (z. B. durch niedrige Enzymkonzentrationen, ZimmerTemperatur) für die bequeme manuelle Abtastintervallen ermöglichen Wie bei anderen stabilen-Isotopenmarkierung Methodiken sind Abweichungen für die experimentellen 18 O-Einbauverhältnis Messungen klein -. typischerweise weniger als 5% für Ionen mit ausreichender Peaks Statistik. Das allgemeine Protokoll kann leicht auf andere Assayformate angepaßt werden, beispielsweise dem Screening einer großen Reihe von synthetischen Substraten oder der Charakterisierung der proteolytischen Prozessierung von endogenen Peptide aus komplexen biologischen Proben (zB, Zellkulturmedien, Körperflüssigkeiten). Wir haben bereits gezeigt, wie das Paléo-Ansatz mit einem LC-Trennschritt kann getrennt werden, und verwendet, um die dynamische Zusammensetzung des menschlichen Speichel Peptidoms 9 definieren. Proteolytische Signaturen durch das Paléo-Zeitverlauf identifiziert wichtige Fakten über das Substrat der Protease von Interesse. Zusätzlich können die zeitaufgelösten Daten ergibt auch kinetische Information. Dieses Wissen ist besonders nützlich bei der Auswertung der proteotypischen Peptide für die quantitative Proteomanalyse Studien, wobei die Auswahl der reproduzierbaren und zahlreicheren Zielpeptide 21 ist wesentlich. Ebenso Identifizieren geschwindigkeitsbestimmenden Schritte proteolytische Wege ist von großem Interesse für die Entwicklung von neuen Protease-basierte Medikamente. Proteasen sind wichtige Faktoren in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen (zB Herz-Kreislauf-Erkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen, Krebs) und solche Beobachtungen eröffnen neue Möglichkeiten für therapeutische Interventionen. Die aleo-Strategie - Säure-katalysierten Kennzeichnung von Carboxylgruppen - wird einfach auf synthetische und endogener Peptide zu stabilen Isotopen kodiert Standards produzieren angewendet. Die Kinetik der säurekatalysierten Reaktion ist viel langsamer als der Enzym-katalysierten Reaktion. Deshalb haben Experimente sorgfältig im Voraus geplant werden. Aleo-Zeitverlauf ist ein Low-Cost-Alternative zu chemischen, metabolische und synthetische Kennzeichnung methoden derzeit in der Proteomik Studien verwendet. Der Beschriftungsvorgang kann überwacht werden, um zu validieren, dass 18 O-Inkorporation Gleichgewichts, was ein Vorteil gegenüber anderen stabilen Isotop Markierungsverfahren sein kann erreicht werden. Im Ergebnis sind die Leo-Zeitverlauf Workflows hier beschriebenen vielseitige Werkzeuge, die kreativ in vielen qualitativen und quantitativen Proteomik Studien sowie Protease Forschung eingesetzt werden können.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom NIH / NIDCR Stipendium 1R01DE019796 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PepClean C-18 Spin Columns Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI target plate AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF/TOF AB SCIEX
Table 1. Materials
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich 70990-1G-F
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) R&D Systems 1784-ZN
Trypsin Gold Promega V5280
Water-18O, 97 atom % 18O Sigma Aldrich 329878-1G
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo 28904
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments AB SCIEX 4333604
Table 2. Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt<sup&gt; 18</sup&gt; O-angereichertem Wasser
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Klingler, D., Hardt, M. Protease-More

Klingler, D., Hardt, M. Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water. J. Vis. Exp. (72), e3891, doi:10.3791/3891 (2013).

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