Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק Published: February 20, 2013 doi: 10.3791/3891
Automatic Translation
1, 1
1Boston Biomedical Research Institute

Summary

זרימות עבודת תיוג איזוטופים יציבות המעסיקות

Abstract

איזוטופים יציבים הם כלים חיוניים בספקטרומטריית מסה ביולוגית. מבחינה הסטורית, 18 איזוטופים יציבים O-נעשו שימוש הנרחב כדי ללמוד את המנגנונים קטליטי של אנזימים פרוטאוליטים 1-3. עם כניסתו של פרוטאומיקה המונית ספקטרומטריית מבוססת, התאגדות enzymatically-הקטליזאטור של 18 O-אטומים ממים יציבים מועשרים isotopically הפכה שיטה פופולרית כמותית להשוות את רמת ביטוי חלבון (נבדק על ידי Fenselau ויאו 4, מיאגי וRao 5 ו יה et al. 6). 18 O-התיוג מהווה חלופה פשוטה וזולה לחומרים כימיים (למשל iTRAQ, ICAT) ו( למשל SILAC) טכניקות תיוג מטבוליות 7. בהתאם לפרוטאז המנוצל, 18 O-תיוג יכול לגרום להתאגדות של עד שני 18 O-אטומים בקבוצת carboxyl C-המסוף של מוצר המחשוף 3 8. בPaleo (עמ rotease-דואר abeling l ssisted mploying 18 הו מים מועשרים) הסתגלות של O-תיוג האנזימטית 18, שנוצלו 50% 18 הו מים מועשרים להניב חתימות איזוטופ ייחודיות. בשילוב עם רזולוציה גבוהה מטריצה ​​בסיוע יינון desorption ליזר זמן של טיסת טנדם ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/TOF MS / MS), את מעטפות איזוטופ אופייניות יכול לשמש כדי לזהות מוצרי ביקוע עם רמה גבוהה של פירוט. קודם לכן יש לנו להשתמש Paleo-המתודולוגיה כדי לזהות ולאפיין פרוטאזות אנדוגניים 9 ולנטר תגובות proteolytic 10-11. מאז Paleo מקודד את עצם מהותה של תגובת ביקוע פרוטאוליטי, ההתקנה הניסיונית היא enri פשוט וביוכימייםצעדי chment של מוצרי ביקוע ניתן לעקוף. Paleo-השיטה ניתן להרחיב בקלות ל( i) ניסויים כמובן הזמן שמפקחים על הדינמיקה של תגובות ביקוע proteolytic ו (ב) ניתוח של proteolysis בדגימות ביולוגיות מורכבות המייצגות את התנאים פיסיולוגיים. ניסויי Paleo-TimeCourse לעזור זיהוי צעדים מגבילי קצב עיבוד ביניים תגובה בתגובות מסלול proteolytic מורכבות. יתר על כן, Paleo-התגובה מאפשרת לנו לזהות אנזימים פרוטאוליטים כגון טריפסין פרוטאז סרין, כי הוא מסוגל ליחבוש את מוצרי הביקוע ולזרז את ההתאגדות של 18 2 O-Atom. "תיוג כפול" אנזימים כאלה יכולים לשמש לpostdigestion 18 O-תיוג, שבפפטידים מסומנים באופן בלעדי על ידי תגובת חילופי חמצן carboxyl. האסטרטגיה השלישית שלנו משתרעת תיוג מעסיק 18 הו מים מועשרים מעבר אנזימים ומשתמשת בתנאי pH חומצי להציג סימן איזוטופ יציב O-18atures לפפטידים.

Protocol

את זרימות עבודת ליאו הוצגו מאפשרות תיוג היציב איזוטופ של חלבון מקוצר ופפטידים סינטטיים. ניסויים אלו כמובן זמן (איור 1) חלים על מחקרי proteomics השוואתיים וכמותית, כמו גם מחקר פרוטאז. כל עבודה מורכבת משני שלבים ניסיוניים (איור 2):) זמן הדגימה תיפתר של התגובה המתאימה 18 O-איזוטופ היציב בקידוד (מחשוף פרוטאז קטליזאטור פפטיד; תגובת חילופי קטליזאטור-פרוטאז carboxyl חמצן; חילופי חמצן carboxyl חומצת קטליזאטור תגובה) ו-B) ניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה וייצוג גרפי של 18 קינטיקה O-התאגדות.

ניסויי TimeCourse א

I. Paleo-TimeCourse: תיוג פרוטאז-קטליזאטור של שסעי proteolytic

  1. (אופציונלי) אג"ח דיסולפיד של חלבונים (10 מיקרומטר) ופפטידים (250 מיקרומטר) מופחתים עם DTT (2.5 מ"מ ריכוז סופי)ב25 מ"מ NH 4 3 HCO (הן טריות) על ידי דגירה למשך 30 דקות ב 50 ° C.
  2. (אופציונלי) cysteines חינם הם alkylated עם iodoacetamide (ריכוז סופי 10 מ"מ) 25 מ"מ NH 3 4 HCO ידי דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  3. בהתאם לפרוטאז של עניין, פתרוני חלבון / פפטיד צריכים להיות ניקה-מעלה כדי להסיר חיץ שייר וסוכן אלקילציה. השתמש PepClean C-18 עמודות ספין (Thermo) לניקוי ופפטיד Vivaspin ריכוז צנטריפוגלי (סארטוריוס) להחליף למאגרי דגימות חלבון.
  4. Redissolve / פפטידים להחליף / חלבונים בחיץ תגובת פרוטאז μl 20 (ECE-1: 50 מ"מ MES-KOH, 5.5 pH; טריפסין: 25 מ"מ NH 4 3 HCO, pH 8.0) המכיל 1:1 (v / v) הסופי H 2 18 O (95%, סיגמא Isotec).
  5. לסגת מדגם נקודת זמן אפס לפני התוספת של פרוטאז: המיקס 0.5 μl של תערובת התגובה ו0.5 אלפא μl cyano-4-hydroxycinnamicחומצת מטריצה ​​(10 מ"ג / מ"ל ​​באצטוניטריל 50%, 0.1% TFA). מדגם כתם על צלחת Opti-TOF 384 MALDI יעד (א.ב. SCIEX) ולהשאיר את טיפי ממס בטמפרטורת חדר עד יבש (כ 5 דקות).
  6. פיצול פתרון התגובה לשני aliquots. Aliquot יהיה הראשון מודגרות עם פרוטאז עניין (ECE-1: 75 ננומטר; טריפסין: 0.04 nM) בטמפרטורת חדר או הטמפרטורה המומלצת לאנזים מסוים. Aliquot השני יהיה דגר בלי פרוטאז וישמש כמדגם שליטה. Aliquot הראשון מייצג מדגם סטנדרטי לפרוטאז קטליזאטור 18 O-תיוג והוא יכול לשמש לפפטיד וזיהוי חלבונים, זיהוי של פעילות חלבונים וניטור של תגובות ביקוע proteolytic. Aliquot השני משמש להראות ש18 O-התאגדות הוא מושרה על ידי פרוטאז, ולכן, לא תיוג ולא המחשוף צפוי למדגם זה.
  7. עקוב תגובה על ידי הסרת aliquots תגובה והבחין בם כdescribed תחת שלב 5 במרווחי זמן כנראה לנכון. את תנאי התגובה שתוארו לעיל משמשים לניטור תגובת פרוטאוליטי לתקופה של עד ארבעה ימים (24 ​​נקודות בערך). התחל דגימה כל 5 דקות עד 30 דקות, ולאחר מכן לזהות את כל 30 דקות עד 2 שעות, ולאחר מכן כל שעה עד שעות 8 וכל 8 שעות עד 4 ימים. מוצרי ביקוע אמורים להופיע תוך 12 השעות הראשונות והמצע צריך להיות לגמרי הידרוליזה לאחר 24 שעות. זמני דגירת תגובה מורחבים מאפשרים להגדיר תוצרי תגובה יציבים שאינם דיסקרטיים מתגובת ביניים, אשר מעובדים עוד יותר. בהתאם לשאלת מחקר וזוגות הניתנים אנזימי מצע, זמנים ייכונו וטמפרטורת דגירה יש להיות מווסת על מנת להבטיח דגימת תגובה אופטימלית.
  8. לאחר שנקודת זמן התגובה הסופית הבחינה או במרווחים בין ייכונו מורחבים, צלחת יעד MALDI מוגשת לניתוח MALDI-TOF/TOF MS / MS כמפורט להלן (סעיף ב ').

השני. Paleo-TimeCourse: Postdigתיוג estion של termini proteolytic

  1. (אופציונלי) אג"ח דיסולפיד של חלבונים (10 מיקרומטר) ופפטידים (250 מיקרומטר) מופחתים עם DTT (2.5 מ"מ ריכוז סופי) ב25 מ"מ NH 4 3 HCO (הן מוכנות טריות) על ידי דגירה למשך 30 דקות ב 50 ° C.
  2. (אופציונלי) cysteines חינם הם alkylated עם iodoacetamide (ריכוז סופי 10 מ"מ) 25 מ"מ NH 3 4 HCO ידי דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  3. בהתאם לפרוטאז של עניין, פתרוני חלבון / פפטיד צריכים להיות ניקה-מעלה כדי להסיר חיץ שייר וסוכן אלקילציה. השתמש PepClean עמודות C-18 ספין לניקוי הפפטיד וVivaspin ריכוז צנטריפוגלי לחילופי חיץ חלבון.
  4. Redissolve / להחליף את ניקה-up מוצרי פפטיד / חלבונים בחיץ תגובת פרוטאז μl 20 (לדוגמא טריפסין: 25 מ"מ NH 4 3 HCO, 8.0 pH) ולעכל עם פרוטאז עניין להשלמה (למשל טריפסין: 0.04 nM 3;7 מעלות צלזיוס; 12 שעות).
  5. מוצרי ביקוע ניקוי עם PepClean עמודות C-18 ספין. צעד זה יהיה לבטל פעילות הפרוטאז שיורית.
  6. Redissolve / להחליף את ניקה-up מוצרי פפטיד בחיץ תגובת פרוטאז μl 20 (טריפסין: 25 המ"מ NH 4 3 HCO, 8.0 pH) המכיל 1:1 (v / v) הסופי H 2 18 O.
  7. לסגת מדגם נקודת זמן אפס לפני התוספת של אנזים: 0.5 μl המיקס של תערובת התגובה ומטריצת 0.5 μl אלפא cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (10 מ"ג / מ"ל ​​באצטוניטריל 50%, 0.1% TFA). ספוט מדגם על צלחת יעד MALDI ולהשאיר את טיפי ממס בטמפרטורת חדר עד יבש (כ 5 דקות).
  8. פיצול פתרון התגובה לשני aliquots. Aliquot יהיה הראשון מודגרות עם פרוטאז של עניין (למשל טריפסין: 0.04 nM) בטמפרטורת חדר או הטמפרטורה המומלצת לאנזים מסוים. Aliquot השני יהיה דגר בלי פרוטאז וישמש כבקרה. 1aliquot מייצג מדגם סטנדרטי לפרוטאז קטליזאטור תיוג 18 O-postdigestion ויכול לשמש לפפטיד וכימות חלבון. Aliquot השני משמש להראות ש18 O-התאגדות מזורזת על ידי פרוטאז ולפיכך לא תיוג צפוי למדגם זה.
  9. עקוב תגובה על ידי הסרת aliquots תגובה והבחין בם כאמור בשלב 7.) במרווחי זמן כנראה לנכון. לדוגמה, אנו הבחנו בתחילה כל 5 דקות עד 30 דקות וכל 15 דקות לאחר שלפקח תגובת חילופי חמצן carboxyl מזורזת על ידי טריפסין.
  10. לאחר שנקודת זמן התגובה הסופית הבחינה או במרווחים בין ייכונו מורחבים צלחת יעד MALDI מוגשת לניתוח MALDI-TOF/TOF MS / MS כמפורט להלן (סעיף ב ').

ג. Aleo-TimeCourse: תיוג חומצת קטליזאטור של קבוצות carboxyl

  1. דגירת פפטידים בודדים (50 ננומטר) עם 1:1 (v / v) 18 הו מים מועשרים בtהוא נוכחות או עדר (שליטה) של 0.1% (v / v) חומצת trifluoroacetic סופית (30 μl נפח כולל).
  2. לדוגמה את תוצרי התגובה היומית ל48 ימים על ידי שיתוף איתור aliquot μl 0.5 של התערובת עם 0.5μl של מטריצת cyano-4-hydroxycinnamic חומצת אלפא (10 מ"ג / מ"ל ​​באצטוניטריל 50%, 0.1% TFA) ישירות על יעד MALDI צלחת.
  3. בין מרווחים ייכונו ואחרי שהבחין בנקודת זמן התגובה הסופית להגיש צלחת יעד MALDI לניתוח MALDI-TOF/TOF MS / MS כמתואר להלן בסעיף ב '

ב MALDI-TOF/TOF רכישת MS / MS נתונים וניתוח

  1. ספקטרום המוני נרכשים על MALDI TOF / TOF Analyzer 4800 (א.ב. SCIEX).
  2. לפני הניתוח, המכשיר מכויל בתערובת של סטנדרטי פפטיד (ערכת תקנים המונית לכיול של AB SCIEX מכשירי TOF / TOF) עם סובלנות מרבית המוני מדידת שגיאה של ± 50 עמודים לדקה ומספר מינימאלי של שישה שיאים להתאים.
  3. MS הספקטרום (טווח המוני400 - 4000 מ '/ z) נרכשים בשלושה עותקים באמצעות מצב יון חיובי עם עצמה מתכווננת ליזר (3400 - 3800; גודל צעד 50) עם טווח מקובל בסיס שיא עוצמת 2000 - 45000. יריות בודדות נרכשות ל- ספקטרום משנה, עם 400 יריות / ספקטרום כלל, לעצור תנאים ייכנסו לתוקף לאחר 800 תת ספקטרומים נרכשים (תעבור או ייכשל) או 400 קריטריונים לקבלה עוקף תת תחזיות. במקרה של דגימות נמוכות בשפע או בנוכחות רקע ביולוגי מורכב לקצה התחתון של טווח גילוי הטרשת הנפוצה יש להעלות עד 800 מ '/ z. בנוסף, ייתכן שיהיה צורך להסיר מלח ותרכובות אחרות המפריעות בצעד ניקוי מדגם כפי שתואר קודם לכן או על ידי הפרדת LC.
  4. קבצי נתוני MS (קבצים. t2d) מיוצאים מתוכנת 4000 סדרת סייר נתוני רכישה ומיובאת למערכת שלנו בבית מעבדת המידע, שעושה שימוש בתוכנה זקקה קמע (מטריקס מדע) לעיבוד וזיהוי ספקטרלי שיא. מעטפות איזוטופיםהם deconvoluted ויחסים 18 O-התאגדות שנקבעו באופן אוטומטי באמצעות אלגוריתם דומה לזה שתואר על ידי מייסון ואח' 12. והותאם על ידי הקבוצה שלנו 9. לחלופין, כלי תוכנה כגון ZoomQuant 13 ו 14 צפע, כמו גם חבילות תוכנה מסחריות, כBioWorks Xpress (תרם הפישר סיינטיפיק) וקמע זקק quantitation ארגז כלים (מטריקס מדע) יכול deconvolute 18 נתונים מסוג O 15,16. יחסי O-18 התאגדות מבוטאים את התרומה היחסית של מיני איזוטופ פפטיד בודדים (כלומר, פפטידים המכילים 16 O, 1 O או 18 O 18 2) למעטפה האיזוטופי כולו.
  5. עבור כל ניסוי TimeCourse, המונים המולקולריים ([M + H] +) לכל מיני פפטיד שהתגלו נשלפים מהקבצים המשויכים MS הנתונים והערכים זרקו לפח ברוחב המוני ppm 100.
  6. t לפחות שלושה [M + H] + מוגדרים יידרש כדי לאכלס סל. במקרה של מצעים ידועים, רשימת הסל המסונן בהשוואה לרשימה של מוצרי ביקוע proteolytic חזתה מרצף פפטיד המצע באמצעות כלי ExPASy FindPept 17 (http://au.expasy.org/tools/findpept.html) ו 200 סובלנות קבלת שגיאה המונית עמודים לדקה.
  7. MS / MS הספקטרום נרכש לכל הערכים ההמוניים של מוצרי ביקוע החזויים על ידי כלי FindPept וערכים לסל שיש להם 18 O-Incorporations קשורים בם. נתוני MS / MS נרכשים על מנתח 4800 MALDI TOF / TOF במצב יון 1kV רפלקטור החיובי, בעצמה קבועה ליזר של 4200 ו-CID גז במצב כבוי. 50 יריות נרכשות בדפוס אקראי לכל ספקטרום משנה עד לסך של 40-ספקטרום משנה לנקודה (מניב כולל של 2000 / יריות ספוט).
  8. קבצי נתוני MS (קבצים. t2d) MS / מיוצאים מהסדרה 4000 Exploתוכנת rer נתוני רכישה ומיובא לתוך מערכת מידע המעבדה בבית שלנו, פסגות מזוהות ורשימות MS / MS שיא קשורות עם נתוני MS זרקו לפח המתאימים.
  9. לזיהוי הפפטיד, רשימות MS / MS שיא הם חפשו מול מסד נתוני SwissProt באמצעות מנוע חיפוש קמע עם פרמטרי החיפוש הבאים: אין הספציפיות אנזים, יון 150 עמודים לדקה מבשרת ו0.2 טולרנסים המוניים יון בר אבא.
  10. הזדהויות פפטיד בנוסף ניתן לאמת באמצעות נתוני Explorer התוכנה (א.ב. SCIEX) יאשר את 18 דפוסי O-התאגדות האופייניים ברחבי יוני בר y-סדרה כפי שתואר על ידי שבצ'נקו et al. 18.

הכנת ג זמן ספקטרלית ו18 מגרשים O-התאגדות

חלקות הזמן Spectral: קבצי נתוני MS (. קבצי t2d) לכל נקודת זמן תגובה מיוצאות מתוכנת סייר הנתונים כASCII-קבצים באמצעותמאקרו ויובא לניתוח נתונים ותוכנה גרפית (למשל מקור על ידי OriginLab) ומוצג כחלקות מפל (איור 3).

18 מגרשים O-התאגדות: לכל אחד ממוצרי ביקוע פפטיד זרק לפח, את התרומה היחסית של מיני איזוטופ פפטיד בודדים (16 O, 18 1 O או 18 O 2) מופקת על פני כל נקודתי זמן התגובה וזממה נגד זמן (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו השתמשנו בעבודת Paleo-TimeCourse דינמי לפקח על ההתאגדות של 18 איזוטופים O-יציבים למוצרי ביקוע פפטיד שנוצרו על ידי אנזימי מפרקי חלבונים. הגישה שהוצגה היא כלי תכליתי יחסית ללמוד מסלולי עיבוד proteolytic למצע שונה ושילובי פרוטאז. באמצעות דגימת תגובות proteolytic שוב ושוב במהלך התגובה, ניסוי Paleo-TimeCourse מספק תצלומי הזמן נפתרו, של מצע ושכיחותם ופרטים על מוצרי עיבוד. שיתוף איתור דוגמאות עם פתרון מטריצת חומצי על צלחת היעד עוצר את הריאקציה אנזימטית והתגבשות מטריצה ​​נוספת משמר רכב מדגם. לכן, נקודתי זמן יכולות בדיעבד להיות מנותחות על ידי MALDI-TOF/TOF MS / MS לאחר סיום התגובה האנזימטית. כדי להתאים את נתוני הטבע העשיר של זרימות עבודה ניסיוניות אלה, יישמו מערכת ביואינפורמטיקה חצי אוטומטית שמחשבה 18 O-incorporatיחסי יונים לפפטיד. כל איור 3 מציגים עלילת נציג רפאי זמן במהלך העיבוד של פפטיד C Endokinin ידי ECE-1. נתוני Paleo-TimeCourse הם רבים ממדיים: התצוגה המורחבת של נתוני MS פני טווח המסה כולה בו זמנית מציגה את השכיחות של מצע פפטיד, כמו גם את שכיחותם של מוצרי פפטיד. ההסדר הזמני מאפשר פענוח הרצף של אירועי ביקוע וקביעה שברי פפטיד הם מוצרי ביקוע יציבים. Zoomed-בתצוגה של MS הנתונים מגלה את המעטפות האיזוטופי של כל הפפטיד והמחשוף מושרה 18 O-תיוג מזוהים בקלות על ידי חלוקת איזוטופ האופיינית. 18 O-התיוג מאפשר לברירה חיובית של מוצרי ביקוע לצורך זיהוי מאוחר יותר של MS / טרשת נפוצה. בסך הכל, assay Paleo-TimeCourse לוכד את הדינמיקה של עיבוד פרוטאוליטי ומאפשר הערכת אתרי ביקוע מועדפים של פרוטאזות. רמה נוספת של Information ניתן להשיג בהתאם למנגנון האנזימטית של פרוטאז מנוצל. פרוטאזות מסוימות כגון טריפסין פרוטאז סרין מסוגלות rebinding מוצרי ביקוע פפטיד קוולנטית. . הידרוליזה של תוצאות ביניים acyl-האנזים בשילוב של 2 18 O-Atom בקבוצת carboxyl C-מסוף האיור 4 מראה את השינויים המתקבלים בתרומה היחסית של isotopomers השונה לאורך זמן: תגובת מחשוף אג"ח פפטיד הראשונית תוצאות של 1:1 בפיצול בין 16 O ו 18 1 ברי פפטיד O. תוצאות carboxyl חמצן exchange התגובה בעלייה של 2 החלק 18 O ליחס של 25% בשיווי משקל עם ירידה מקבילה של שבריר 16 O. פרוטאזות המסוגלים להאיץ את תגובת חילופי חמצן carboxyl לכן יכולות לשמש לעבודה 18 נוספת O-תיוג, תיוג postdigestion של ter פרוטאוליטימיני. בסוגים אלה של ניסויים, מצעים הם מתעכלים בתחילה בהעדר H 2 18 O, מוצרי פפטיד ניקו ודגרו עם משלוח חדש של פרוטאז, אבל H 2 איור 18 א '4 הפעם בנוכחות של 50% מראה הבדלים בהתאגדות איזוטופ שניתן להבחין בשתי זרימות עבודה ניסיוניות אלו והבדלים במהירות התאגדות בין מצעי פפטיד בודדים. בעבודת תיוג postdigestion, השיעור הוא ל18 O-Incorporations נקבע על ידי תגובת חילופי חמצן carboxyl. קצב התגובה תלויה בנכונותה של פרוטאז אינטראקציה עם מוצרי המחשוף שלה. הזיקה למוצר התגובה עקיפה ניתן להשתמש כדי להסיק את הזיקה של פרוטאז למצע פפטיד המקורי. מידע כזה יכול להיות שימושי כדי לקבוע אילו רצפים פפטידים הם מצעים אידיאליים לדוגמה עבור tryptic מעכל במחקרים כמותיים proteomics. Peptides שהבקיעו בקלות והכפולה שכותרתו על ידי טריפסין, סביר שיהיו פפטידים proteotypic שנוצרים reproducibly וכמותית, ולכן אידיאלי ללימודי proteomics השוואתיים.

ב-pH הנמוך, oxygens של קבוצות carboxylic חומצת חילופים עם 19-20 ממס המימיים. תגובה זו יכולה לשמש כגישה חלופית לפרוטאז קטליזאטור תיוג אסטרטגיות להציג איזוטופים יציבים לפפטידים. בעבודת Aleo-TimeCourse (תיוג חומצת קטליזאטור מעסיק 18 O המועשר במים), אנו במעקב ההתאגדות האיטית של 18 O-אטומים לפפטידים סינטטיים. חילופי חמצן חומצת הקטליזאטור נעצרו לאחר התגבשות שיתוף עם מטריקס פתרון על צלחת יעד MALDI, ביעילות "הקפאה" מצב הפצת איזוטופ. אנחנו השתמשנו 1 אנגיוטנסין כפפטיד מודל ובדקנו מעטפת איזוטופ שלה לאורך הזמן (איור 5). ספיגה של שני 18 O-אטומים לכל מכוניתקבוצת boxyl נצפתה. תחת התנאים הניסיוניים הנוכחיים, תגובת חילופי חומצת קטליזאטור carboxyl החמצן הייתה איטית בהרבה מפרוטאז קטליזאטור 9 החילופים והגיעה שיווי משקל רק לאחר 48 ימים. עם זאת, גישת Aleo מציעה את היתרון של תיוג פפטידים שאינם מוכרים על ידי פרוטאזות. בנוסף, פפטידים לשלב 18 O-אטומים מרובים בהתאם למספר שרשרות צד חומציים, אשר עלול לגרום להפרדה מלאה של המעטפות האיזוטופי של מינים ללא תווית וכותרתו. שינוי המסה הכוללת מספק מידע על מספר שיירים חומציים בפפטיד נתון ומיקומם ניתן לגזור על ידי הניתוח של משמרות המוניות יון בר MS / MS. פפטידים 18 O-הכותרת להציג ליד התנהגות הכרומטוגרפיה זהה כמו עמיתיהם ללא תווית, ה מאפשר הניתוח ההשוואתי שלהם בשלב elution זהה. לסיכום, חומצת קטליזאטור 18 O-תיוג יכול לשמש כתחליף לכימיקלים, enתיוג zymatic וטבולים מתקרב נפוץ בפרוטאומיקה כמותיים. יישום מבטיח מסוים אחד של טכניקה זו הוא השימוש של 18 פפטידים O-שכותרתו כסטנדרטי איזוטופים יציבים.

איור 1
איור 1. תיוג 18 O מבוסס מציע מגוון רחב של זרימות עבודה כמובן הזמן. (אני) עבודת פרוטאז קטליזאטור Paleo-TimeCourse מאפשרת ניטור של הדינמיקה של תגובות ביקוע proteolytic. בהתאם לפרוטאז, אלה תוצאת תגובות ב( א) אחת (למשל במקרה של metalloproteases המסוים) או (ב) הכפולה O-התאגדות 18 (למשל במקרה של פרוטאזות סרין המסוימת). (השני) כגון דאבל 18 O-labeler כטריפסין יכול לשמש גם בתהליכי עבודת תיוג postdigestion, שבו O-18 התאגדות מתווכת רק על ידי פרוטאז הקטליזאטורתגובת חילופי חמצן carboxyl. (שלישית), לעומת זאת, זרימת עבודת Aleo-TimeCourse מסתמכת על תגובות החומצה catalyzed carboxyl חמצן החליפין של צד פפטיד חומצי וקבוצות מסוף. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. זרימות עבודה ניסיוניות של Paleo-ואסטרטגיות Aleo-TimeCourse. א) (I) בניסוי פרוטאז קטליזאטור Paleo-TimeCourse, מצעים מודגרת עם פרוטאז בנוכחות של H 2 18 O וכתוצאה מההתאגדות של עד 2 18 O-אטומים בהתאם לפרוטאז. (II) בניסוי תיוג postdigestion Paleo, מוצרי ביקוע מעיכול קודם הם מחדש הודגרו עם פרוטאז עניין בנוכחות של H 2 18 O. פרוטאזות המסוגלים תיוג כפול (בעבודתי) כזרז לשילוב של שני 18 O-אטומים. (III) בניסוי Aleo חומצת קטליזאטור, כל הקבוצות הפונקציונליות חומציים לשלב 18 O-אטומי B) ניתוח TimeCourse:.. במרווחי זמן קבוע, aliquots של תערובות התגובה הוא שיתוף הבחין-עם מטריצה ​​על צלחות MALDI-היעד עם MS- רכישת נתונים, חלקות רפאי זמן של תגובות ביקוע פפטיד, כמו גם 18 מגרשי O-התאגדות של מיני פפטיד בודדים נוצרות ומוצרי ביקוע נבחרים לזיהוי רצף MS / MS מבוסס. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
איור 3. חלקות הזמן Spectral להציג את הדינמיקה של תגובות ביקוע proteolytic. ידי התוויית ספקטרום MS ניסויי Paleo-TimeCourse בהסדר מפל, זה אפשרי בו זמנית לפקח שפלה של המצע ואת הופעתה של מוצרי ביקוע ביניים ותוצרים סופיים. כאן, המחשוף של פפטיד C Endokinin ביו ידי אנדותלין-converting enzyme-1 (ECE-1) מוצג. מוצרי ביקוע זוהו על ידי MS / MS והמעטפות האיזוטופי שלהם מוצגות את 18 חתימות O-התאגדות האופייניות (מסומן באדום).

איור 4
איור 4. פרוטאזות סרין כגון טריפסין לתווך ההתאגדות של עד 2 18 O-אטומים למוצרי ביקוע פפטיד. (אני) > טרונג בעבודת תיוג פרוטאז המבוסס, תוצאות פפטיד אג"ח ביקוע התגובה ב50% יחס יחיד 18 O-התאגדות למוצרי ביקוע פפטיד שנוצרו טרי (נקודות שחורות מצביעות שברים ללא תווית אדום יחידה שכותרת-פפטיד). פרוטאזות שתחבושנה את תוצרי התגובה שלהם (למשל פרוטאזות סרין כגון טריפסין) לזרז עוד יותר שילוב של 2 O אטום 18 באמצעות תגובת חילופי חמצן carboxyl (נקודות ירוקות, שבר פפטיד כפול שכותרת). בשיווי משקל, הפצת תווית של 0.25:0.5:0.25. (בלתי; יחיד; כפול מתויג-) הוא הגיע (ב ') בתיוג postdigestion של זרימת עבודת termini פרוטאוליטי, אין שסעי אג"ח פפטיד להתרחש. במקום זאת, שילוב של עד שני 18 O-אטומים הוא מבוסס רק על תגובת חילופי חמצן carboxyl. לכן, 18 O-התאגדות מתרחשת רק עם פרוטאזות שתחבושנה את מוצרי ביקוע פפטיד.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. חומצת קטליזאטור 18 O-התיוג מוביל לשילוב של שני 18 O-אטומים לקבוצת carboxyl. במהלך הניסוי, המעטפה האיזוטופי של אנגיוטנסין-1 עברה 2 משמרות מרובות Da המוני (קווים מקווקווים) מתאימות לספיגה של 18 O-אטומים. האתרים של 18 O-התאגדות מסומנים ברצף החומצות האמיניות (כחול).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

על ידי שילוב של תיוג איזוטופ יציב וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה באופן הזמן נפתר, שיטת Paleo-TimeCourse מאפשרת לניתוח דינמי של הדור של מוצרי פפטיד. הבדיקה יכולה לשמש ליצירת פפטידים שכותרת isotopically יציבים ללימודי proteomics כמותיים ואיכותיים ולהעריך את הקינטיקה של פפטידים שproteotypic נוצרים. יתר על כן, Paleo-TimeCourse נועד להעריך מסלולי proteolytic תחת vivo הספציפי, פיסיולוגי הרלוונטי תנאים לשעבר. חלבונים אנדוגניים, פפטידים ופרוטאזות כמו גם פפטידים סינטטיים ופרוטאזות רקומביננטי יכולים להיות מנוצלים בזרימת העבודה. בהתאם לתגובה המסוימת פרוטאוליטי להיחקר, תנאי assay וזמנים ייכונו יכול להיות מותאם כדי לספק לדגימה אופטימלית של תהליך התגובה. מניסיוננו, כדאי להאט תגובות proteolytic למטה (למשל באמצעות אנזים ריכוזים נמוכים, חדרטמפרטורה) כדי לאפשר למרווחי דגימה ידנית נוחים כמו במתודולוגיות תיוג-איזוטופ היציב אחרות, סטיות עבור 18 מדידות יחס הניסיוניות O-ההתאגדות הן קטנות -. בדרך כלל פחות מ 5% לפסגות עם סטטיסטיקת יון מספיקה. הפרוטוקול הכולל ניתן להתאים בקלות לפורמטי assay אחרים, למשל ההקרנה של קבוצה גדולה של מצעים סינטטיים או האפיון של עיבוד פרוטאוליטי של פפטידים אנדוגניים מדגימות ביולוגיות מורכבות (למשל, תקשורת סלולרית תרבות, נוזלי גוף). אנחנו הוכחנו בעבר עד כמה Paleo-הגישה ניתן מקף עם צעד LC-הפרדה, ומשמשת כדי להגדיר את ההרכב הדינמי של 9 peptidome הרוק האנושי. חתימות פרוטאוליטים זוהו על ידי Paleo-TimeCourse לספק עובדות חשובות לגבי המצע הספציפי של פרוטאז של עניין. בנוסף, נתוני הזמן נפתרו, גם תשואות מידע הקינטית. ידע כזה הוא שימושי במיוחד בהערכה של פפטידים proteotypic ללימודי proteomics כמותיים, בי הבחירה של פפטידים היעד לשעתק ונרחבים ביותר היא חיונית 21. כמו כן, שיעור זיהוי צעדים מגבילים, במסלולי proteolytic הוא של ריבית גבוהה לפיתוח תרופות חדשות המבוססים על פרוטאז. פרוטאזות הן גורמי מפתח בתהליכים רבים פיסיולוגיים ופתולוגיים (כגון הפרעות לב וכלי דם, מחלות ניווניות, סרטן) ותצפיות כאלה יכולות לפתוח הזדמנויות חדשות להתערבויות טיפוליות. אסטרטגיית Aleo - תיוג חומצת קטליזאטור של קבוצות carboxyl - מוחלת בקלות לפפטידים סינטטיים ואנדוגני לייצר סטנדרטים יציבים מקודדים isotopically. קינטיקה של תגובת חומצת הקטליזאטור היא איטית בהרבה מתגובת אנזים הקטליזאטור. לכן, ניסויים צריכים להיות מתוכננים בקפידה מראש. Aleo-TimeCourse היא אלטרנטיבה בעלות נמוכה כדי כימי, חילוף חומרים וסינטטיים תיוג מ 'ethods משמש כיום במחקרי proteomics. תהליך התיוג יכול להיות במעקב כדי לאמת כי 18 O-ההתאגדות הגיעו שיווי משקל, מה שיכול להיות יתרון על פני שיטות אחרות תיוג יציבות איזוטופים. לסיכום, את זרימות עבודת ליאו-TimeCourse שתוארו כאן הן כלים צדדיים שיצירתיות יכולה להיות מועסק ברבים איכותיים ומחקרים כמותיים proteomics כמו גם מחקר פרוטאז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR גרנט 1R01DE019796.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PepClean C-18 Spin Columns Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI target plate AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF/TOF AB SCIEX
Table 1. Materials
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich 70990-1G-F
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) R&D Systems 1784-ZN
Trypsin Gold Promega V5280
Water-18O, 97 atom % 18O Sigma Aldrich 329878-1G
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo 28904
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments AB SCIEX 4333604
Table 2. Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

Tags

ביוכימיה גיליון 72 ביולוגיה מולקולרית חלבונים פרוטאומיקה כימיה פיסיקה MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה פרוטאומיקה proteolysis כימות תיוג איזוטופ יציב תיוג זרז פפטידים O-18 מים מועשרים
פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק<sup&gt; 18</supמים&gt; O-מועשר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klingler, D., Hardt, M. Protease-… More

Klingler, D., Hardt, M. Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water. J. Vis. Exp. (72), e3891, doi:10.3791/3891 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter