Summary
採用した安定同位体標識のワークフロー
Abstract
安定同位体は、生物学質量分析に不可欠なツールです。歴史的に見ると、18 O安定同位体は、広範囲に1から3のタンパク質分解酵素の触媒機構を研究するために使用されている。質量分析ベースのプロテオミクスの出現により、安定同位体濃縮された水の18 O原子の酵素によって触媒された定款は、定量的タンパク質発現レベル（Fenselauとヤオ4県、宮城県、ラオ5とYeによって見直さ比較する一般的な方法となっているら6）18 O標識は、化学物質（ 例えば iTRAQ、ICAT）と（ 例えば SILAC）代謝標識技術7に簡単かつ低コストの代替手段を構成する。利用プロテアーゼに応じて、18 O標識は、切断産物3のC末端カルボキシル基に2つの18 O原子までの取り込みをもたらすことができ8に細分することができる。酵素18 O標識の私たちのパレオ（P 18 O濃縮水をmploying 電子 abeling rotease-ssisted リットル ）の適応では、独特の同位体比の挙動を得るために50パーセント18 O濃縮水を利用した。高解像度のマトリックス支援レーザー脱離イオン化 - 飛行時間型タンデム質量分析（MALDI-TOF/TOF MS / MS）との組み合わせでは、特徴的な同位体エンベロープは特異性の高いレベルで切断産物を同定するために用いることができる。我々は以前に検出し、特徴づける内因性プロテアーゼ9とタンパク質分解反応10-11を監視するために古の方法論を使用してきました。パレオは、タンパク質分解的切断反応の本質をエンコードしているので、実験のセットアップは簡単で、生化学ENRIです切断産物のchmentステップは回避することができます。古法は容易にタンパク質分解的切断反応のダイナミクスと生理的条件を表す複雑な生物学的サンプル中のタンパク質分解の（ii）の分析の監視（i）が経時実験に拡張することができます。古経時実験は、複雑なタンパク質分解経路反応における律速処理ステップと反応中間体を識別するのに役立ちます。さらに、古反応は、私たちはそのようなその切断産物を再結合し、第二18 O原子の取り込みを触媒することが可能であるセリンプロテアーゼトリプシンなどのタンパク質分解酵素を識別することができます。このような"二重標識"酵素はペプチドが排他的にカルボキシル酸素交換反応によって標識されている、postdigestion 18 O標識のために使用することができます。私たちの3番目の戦略は酵素を超え18 O濃縮水を採用ラベリング延び、18 O安定同位体標識を導入するために酸性のpH条件を使用していますペプチドにatures。
Protocol
提示LEO-ワークフローはタンパク質消化物や合成ペプチドの安定同位体標識を可能にします。これらのタイムコース実験（ 図1）は、比較および定量的プロテオミクス研究ならびにプロテアーゼの研究にも適用可能である。各ワークフローには、2つの実験の手順（ 図2）から構成されています）は、それぞれ18のO-安定同位体でエンコードされた反応（プロテアーゼ触媒によるペプチド切断の解決されたサンプリング時間;プロテアーゼ触媒によるカルボキシル基の酸素交換反応、酸触媒カルボキシル酸素交換質量分析および18 O-取り込み動態をグラフィカルに表現することにより反応A）とB）分析。
Aの経時実験
I.古経時：タンパク質分解的切断のプロテアーゼ触媒によるラベリング
- （オプション）タンパク質（10μM）およびペプチド（250μM）のジスルフィド結合は、DTT（最終濃度2.5 mM）で還元される50℃で30分インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3（両方の新たに調製）で
- （オプション）無料システインは、暗所で室温で30分間インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3で（最終濃度10mM）ヨードアセトアミドでアルキル化されています。
- 興味のあるプロテアーゼに応じて、タンパク質/ペプチドのソリューションは、残った液、アルキル化剤を除去するためにクリーンアップする必要があります。タンパク質試料用のバッファを交換するためにペプチドのクリーンアップとVivaspin遠心コンセントレータ（ザルトリウス）のPepClean C-18スピンカラム（サーモ）を使用します。
- 1:1（v / v）の最終的なH 2を含む：;：20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0でトリプシン50mMのMES-KOH、pH5.5で、ECE-1）に交換ペプチド/タンパク質/を再溶解（18）O（95％、シグマアイソテック）。
- 前プロテアーゼの添加をゼロ時点サンプルを撤回：ミックス反応混合物の0.5μlと0.5μlのアルファシアノ-4 - ヒドロキシを酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）。のOpti-TOF 384 MALDIターゲットプレート（AB SCIEX）上のスポットサンプルを、室温で溶媒液滴のまま乾燥するまで（約5分）。
- 2つのアリコートに反応液を分割します。室温または特定の酵素のための推奨温度で：;：最初のアリコートは、関心のあるプロテアーゼ（0.04 nMでトリプシン75nmのECE-1）と共にインキュベートされます。第二のアリコートを、プロテアーゼなしでインキュベートされ、コントロールサンプルとして使用されます。第一のアリコートは、プロテアーゼ触媒による18 O標識のための標準試料を表しており、タンパク質分解的切断反応のペプチドやタンパク質同定、タンパク質分解活性の検出およびモニタリングに使用することができます。第二のアリコートは、18 O取り込みがプロテアーゼによって誘導されることを示すために使用されているため、どちらのラベルも切断はこのサンプル用に期待されています。
- 反応液の一部を除去し、DESとしてそれらをスポッティングすることにより反応をフォローフィット思えるような時間間隔でステップ5にcribed。上記の反応条件は4日間（約24箇所）までのタンパク質分解反応を監視するために使用されています。 30分まで、5分毎のサンプリングを開始し、8時間、4日までのすべての8時間まで、2時間まで30分ごとに、すべての時間を見つける。切断産物は、最初の12時間以内に表示されるべきであり、基板は24時間後に完全に加水分解されなければなりません。拡張反応のインキュベーション時間はさらに処理される反応中間体から離散的で安定した反応生成物を定義することができます。リサーチクエスチョンと与えられた酵素 - 基質ペアに応じて、スポッティング倍、培養温度は最適反応サンプリングを確保するために調節されることがあります。
- 最終反応時点をスポットまたは拡張スポッティング間隔の間にされた後、後述するように、MALDIターゲットプレート（セクションB）MALDI-TOF/TOF MS / MS分析に送信されます。
Ⅱ。古経時：Postdigタンパク質分解末端のestionラベリング
- （オプション）タンパク質（10μM）およびペプチド（250μM）のジスルフィド結合は、50℃で30分インキュベートし、25mMのNH 4 HCO 3（両方の新たに調製）にDTT（最終濃度2.5 mM）で還元される
- （オプション）無料システインは、暗所で室温で30分間インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3で（最終濃度10mM）ヨードアセトアミドでアルキル化されています。
- 興味のあるプロテアーゼに応じて、タンパク質/ペプチドのソリューションは、残った液、アルキル化剤を除去するためにクリーンアップする必要があります。タンパク質のバッファー交換のためのペプチドのクリーンアップとVivaspin遠心コンセントレータのためPepClean C-18スピンカラムを使用します。
- 再溶解/クリーンアップされたペプチド製品/タンパク質20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（ 例えば、トリプシン：25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0）に交換する（ 例えばトリプシン完成に関心のプロテアーゼで、ダイジェストを：0.04 nMで、37℃、12時間）。
- PepClean C-18スピンカラムによるクリーンアップの切断産物。このステップでは、残存プロテアーゼ活性を除去することができます。
- 1:1（v / v）の最終的なH 2 18 Oを含む：20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0でトリプシン）でクリーンアップされたペプチド生成物を再溶解/交換
- 反応混合物のミックス0.5μlおよび0.5μlのアルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）：事前の酵素の添加をゼロ時点サンプルを撤回します。スポットMALDIターゲットプレート上の試料と乾燥（約5分）になるまで室温で溶媒液滴のままにしておきます。
- 2つのアリコートに反応液を分割します。室温または特定の酵素のための推奨温度で：最初のアリコートは、関心のあるプロテアーゼ（0.04 nMで例えばトリプシン）と共にインキュベートされます。第二のアリコートを、プロテアーゼなしでインキュベートされ、コントロールとして機能します。最初のアリコートプロテアーゼ触媒による18 O postdigestionラベリングのための標準試料を表しており、ペプチドやタンパク質の定量化のために使用することができます。第二のアリコートは、18 O取り込みがプロテアーゼによって触媒されることを示すために使用されているため、全く標識はこのサンプル用に想定されていません。
- 反応液の一部を除去して、ステップ7で説明し、それらをスポッティングすることにより、反応に従ってください）時間間隔でフィット見えるように。例えば、私たちは、トリプシンによって触媒カルボキシル酸素交換反応を監視するために、その後最初に最大30分および15分毎にのために5分毎に斑点を付けた。
- 最終反応時点が目撃されているか、（セクションB）下記のように拡張された間隔の間にスポッティングMALDIターゲットプレートがMALDI-TOF/TOF MS / MS分析に提出された後。
Ⅲ。アレオ-経時：カルボキシル基の酸触媒によるラベリング
- 1:1（v / v）のtの18 O濃縮水を使用して個々のペプチド（50 nM）をインキュベート0.1％の彼は有無（制御）（v / v）の最終のトリフルオロ酢酸（総体積30μl）を。
- アルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）で直接MALDIターゲット上の0.5μlとの混合物との共スポッティングを0.5μlアリコートで48日間毎日サンプルの反応生成物プレート。
- スポッティング間隔の間、そして、セクションBに下記のようにMALDI-TOF/TOF MS / MS分析のためのMALDIターゲットプレートを提出し、最終反応時点のスポッティング後
B. MALDI-TOF/TOF MS / MSのデータ収集と分析
- 質量スペクトルは4800 MALDI TOF / TOFアナライザ（AB SCIEX）に取得されています。
- 分析前に、測定器は±50 ppmと一致するように、6つのピークの最小数の最大質量測定誤差の許容範囲を有するペプチド規格（AB SCIEX TOF / TOF機器のキャリブレーションのための質量標準キット）の混合物で校正されています。
- MSスペクトル（質量範囲45000 - 2000の許容ベースピーク強度範囲とステップサイズ50）、400 - 3800 - 4000 メートル/ z）は調整可能なレーザー強度（3400と正イオンモードを用いて三重に獲得されます。シングルショットは合計400ショット/スペクトルと、サブスペクトルを取得し、800のサブスペクトル後に発効する停止条件（合格または不合格）が取得されるか400のサブスペクトルパス合格基準。低濃度サンプルの場合や複雑な生物学的背景の存在下でMS検出範囲の下限は800のm / zに引き上げるべきである。また、LC分離したり、前述のように、サンプルクリーンアップステップと塩と他の干渉成分を除去することが必要かもしれません。
- MSデータファイル（。T2Dファイル）は4000シリーズExplorerデータ収集ソフトウェアからエクスポートして、スペクトル処理、ピーク検出のマスコットDistillerのソフトウェア（マトリックスサイエンス）を利用して、社内の研究室情報システムにインポートされます。同位封筒自動的にメイソンらによって記載されたものと同様のアルゴリズムを用いて決定し、デコンボリューションおよび18 O-混入比率は12であり、当社グループ9で適応した。あるいは、このようなZoomQuant 13とバイパー14と同様に、このような市販のソフトウェアパッケージなどのソフトウェアツールは、 BioWorksエクスプレス（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とマスコットキャラクターDistillerの定量ツールとして（マトリックスサイエンス）18 O型データ15,16をデコンボリューションすることができます18、O-取り込み比（ すなわち 、16を含むペプチドの個々のペプチドの同位体種の相対的な寄与として表されているO、18 O 1ま たは18 O 2）を全体同位封筒へ。
- 各時間経過の実験のために、分子量（[M + H] +）、検出されたすべてのペプチド種は、関連付けられたMSデータファイルから抽出された値が100 ppmの質量幅でビニングされるため。
- A少なくともトン3 [M + H] +のビンを移入するために必要とされるように設定されている。既知の基質の場合では、フィルタリングされたビンのリストがExPASy FindPeptツール17（使用基質ペプチド配列から予測されるタンパク質分解切断製品のリストと比較されhttp://au.expasy.org/tools/findpept.html ）と200 ppmの質量誤差の許容公差。
- MS / MSスペクトルをFindPeptツールによって、それらに関連付けられた18 O取り込みを持つビン値に対する予測切断産物の全質量の値で取得されています。 MS / MSデータは、オフモードで固定されたレーザー4200の強度と、CIDガスで、1kVのリフレクターポジティブイオンモードで4800 MALDI TOF / TOFアナライザで取得されています。 50ショットはアップスポットあたり40サブスペクトル（2000ショット/スポットの合計が得られる）との合計に対するサブスペクトル当たり無作為パターンで取得されています。
- MS / MSデータファイル（。T2Dファイル）は、4000シリーズの爆発からエクスポートされたRERのデータ収集ソフトと社内の検査情報システムにインポートされ、ピークが検出されるとMS / MSピークリストは、対応するビニングMSデータに関連付けられています。
- 無酵素特異性、150ppmの前駆イオンと0.2 Daのフラグメントイオンの質量の許容差：ペプチド同定は、MS / MSピークリストは次の検索パラメータを指定してMASCOT検索エンジンを使用して、SwissProtデータベースに対して検索されます。
- ペプチド同定はさらにシェフチェンコらによって説明されているようにYシリーズのフラグメントイオンを越え特性18 O取り込みパターンを確認することにより、データエクスプローラソフトウェア（AB SCIEX）を使用して検証することができます18。
スペクトルの時間および18 O-定款プロットのRNAサンプルの調製
スペクトルの時間プロット：各反応時間ポイントのMSデータファイル（。T2Dファイル）を使用して、ASCIIファイルとしてデータエクスプローラソフトウェアからエクスポートされたマクロとデータ解析とグラフィックソフトウェアプログラム（OriginLabの起源などによる）にインポートして、ウォーターフォールプロット（ 図3）として表示されます。
18 O取り込みプロット：各ビニングペプチド切断の製品については、個々のペプチドの同位体種の相対的な寄与（16 O、18 O 1ま たは18 O 2）をすべて反応時間ポイント間で抽出されます（ 図4）を時間に対してプロットした。
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Representative Results
我々は、動的にタンパク質分解酵素によって生成されたペプチドの切断産物に18 O安定同位体の取り込みを監視するために古経時ワークフローを使用していました。提示されたアプローチは比較的異なる基板とプロテアーゼの組み合わせに分解性プロセシング経路を研究するための多目的ツールです。反応の過程で繰り返しタンパク質分解反応をサンプリングすることにより、古経時実験は、基質と生成物の存在量と処理内容の時間分解スナップショットを提供します。ターゲットプレート上の酸性マトリックス溶液とのコ·スポッティングサンプルが酵素反応とマトリックスの結晶化がさらに試料組成を保持し停止します。したがって、時点を遡及的に酵素反応の終結後MALDI-TOF/TOF MS / MSで分析することができます。これらの実験のワークフローのデータが豊富な自然に適応するために、我々は18のO-incorporatを計算する半自動バイオインフォマティクスシステムを実装各ペプチドのイオン比図3は、ECE-1によるペプチドEndokinin Cの処理の代表的なスペクトルの経時変化のプロットを示します。古経時データが多次元である：全体の質量範囲全体でMSデータの拡大図は、同時にペプチド基質の存在量並びにペプチド製品の存在量を示しています。時間的な配置は、切断イベントのシーケンスを解読し、ペプチド断片が安定切断産物であるかを決定することができます。ズームインしたMSデータのビューには、各ペプチドの同位体の封筒を明らかにし、切断によって誘発される18 O標識が容易にその特徴的な同位体分布によって識別されます18 O標識は、MS /によるその後の識別のための切断産物の正の選択を可能にするMS。要するに、古経時アッセイは、タンパク質分解処理のダイナミクスをキャプチャし、プロテアーゼの好適な切断部位を評価することができます。情のさらに別のレベルるが利用プロテアーゼの酵素学的メカニズムに応じて取得することができる。そのようなセリンプロテアーゼトリプシンなどの特定のプロテアーゼは、共有結合、そのペプチドの開裂生成物を再バインドすることが可能である。 C-末端カルボキシル基における第二18 O原子の取り込みにおけるアシル-酵素中間結果の加水分解図4は、時間の経過とともに異なるアイソトポマーの相対的な寄与の結果の変化を示しています初期のペプチド結合開裂反応16 Oおよび18 O 1ペプチド画分の間に、1:1分割の結果。 16 Oの分画の併用減少と平衡状態で25％の比率を18 O 2画分の増加でカルボキシル酸素交換反応の結果。カルボキシル酸素交換反応を触媒することができるプロテアーゼは、したがって、追加の18 O標識ワークフロー、タンパク質分解TERのpostdigestion標識のために使用することができますミニ。実験は、これらのタイプでは、基板が最初にH 2 18 Oの非存在下で消化され、ペプチド製品はクリーンアップされ、プロテアーゼの新鮮なバッチと一緒にインキュベートしたが、50％の存在下で、今回、H 2 18 Oを図4に示しこれら二つの実験的なワークフローや、個々のペプチド基質の間の取り込み速度の違いで観察することができる同位体の取り込みの違い。 postdigestionラベリングワークフローでは、18 Oの両方の取り込み率はカルボキシル酸素交換反応によって決定される。反応速度は、プロテアーゼは、その開裂生成物とどのように相互作用するかは容易に依存します。反応生成物との親和性は、間接的に元のペプチド基質にプロテアーゼの親和性を推測するために使用されるかもしれません。このような情報は、ペプチド配列はトリプシンの定量的プロテオミクス研究にダイジェスト用例えば理想的な基質であるかを決定するために有用である可能性があります。 P容易に切断され、トリプシンによる二重標識eptidesは再現性と定量的に形成されており、従って、理想的に比較プロテオミクス研究のために適しているプロテオティピックペプチドである可能性が高い。
水性溶媒19から20と低pHで、カルボン酸基の酸素は交換。この反応は、ペプチドに安定同位体を導入するプロテアーゼ触媒によるラベリング戦略に代わるアプローチとして使用することができます。アレオ·時間経過（18 O濃縮水を用いる酸触媒ラベリング）ワークフローでは、合成ペプチドに18 O原子の遅い取り込みを監視した。酸触媒の酸素交換が同位体分布状態を効果的に "凍結" MALDIターゲットプレート上にマトリックス溶液で共結晶化した後に停止しました。我々は、モデルペプチドとしてアンジオテンシン1を使用し、時間をかけて、その同位体の封筒を（ 図5）について検討した。それぞれの車のための2つの18 O原子の取り込みboxyl群が観察された。現在の実験条件下では、酸触媒カルボキシル酸素交換反応は、プロテアーゼ触媒による交換9よりも時間がかかりましたし、わずか48日後に平衡に達した。しかし、アレオアプローチはプロテアーゼによって認識されていないペプチドを標識するという利点があります。また、ペプチドは、非標識及び標識種の同位体の封筒の完全分離をもたらすことができ酸性側鎖の数に応じて複数の18 O原子を組み込む。全体の質量シフトは、指定されたペプチド中の酸性残基の数に関する情報を提供し、それらの場所は、MS / MSフラグメントイオン質量シフトの解析により導出することができます18 O標識ペプチドは、そのラベルの付いていない相手と同一のクロマトグラフィー挙動、近くに表示される同一の溶出時間で彼らの比較分析を可能にします。要約すると、酸触媒18 O標識はen、化学物質への代替手段として使用できますzymaticと代謝標識は、定量的プロテオミクスで一般的に使用されて近づく。この技術の1つの特定の有望なアプリケーションは、安定同位体の標準として18 O標識ペプチドを使用することである。
図1 18 Oベースのラベリングは、時間経過のワークフローを幅広く提供しています。 （I）のプロテアーゼ触媒による古経時ワークフローでは、タンパク質分解的切断反応の動態に関するモニタリングを可能にします。プロテアーゼに応じて、（a）シングル（特定メタロプロテアーゼの場合など ）又は（b）二重18 O取り込み（特定のセリンプロテアーゼの場合など ）、（II）ダブル18 Oラベラーなどで、これらの反応の結果トリプシンとして18 O取り込みはもっぱらプロテアーゼを触媒とすることによって媒介される、postdigestionラベリングワークフローで使用することもできますカルボキシル酸素交換反応（III）とは対照的に、アレオ-経時ワークフローでは、酸性ペプチド側と末端基の酸触媒カルボキシル酸素交換反応に依存しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。古とアレオ-経時戦略の実験的なワークフロー。 （）私は）プロテアーゼ触媒による古経時実験では、基板はプロテアーゼに応じて2つの18 O原子までの混入が生じるH 2 18 Oの存在下でプロテアーゼと共にインキュベートする。 （Ⅱ）古postdigestionラベリング実験では、前の消化から切断産物はで再インキュベートされる H 2 18 Oの存在への関心のプロテアーゼ二重標識（ワークフローのI）が可能なプロテアーゼは2 18 O原子の取り込みを触媒する。 （III）の酸触媒アレオ実験では、すべての酸性官能基が18 O原子を組み込んだB）の経時分析：一定の間隔で、反応混合物のアリコートをMALDIターゲットプレート上のマトリクスと共存スポットされると、MS-。データ収集、ペプチド開裂反応だけでなく、個々のペプチド種の18 O定款プロットのスペクトルの時間プロットが生成され、切断産物がMS / MSベースのシーケンス識別のために選択されるが。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
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図3。スペクトルの時間プロットはタンパク質分解的切断反応のダイナミクスを表示します。滝配置で古経時実験のMSスペクトルをプロットすることで、同時に基材と中間と最後の切断産物の出現の劣化を監視することが可能である。ここでは、エンドセリン変換酵素-1（ECE-1）が示されていることにより生理活性ペプチドEndokinin Cの開裂。切断産物は、MS / MSにより同定とその同位体の封筒（赤で強調表示されている）特徴18 O定款の署名を表示されていました。
図4。トリプシンなどのセリンプロテアーゼは、ペプチドの切断産物に2 18 O原子までの取り込みを媒介する。 （I） プロテアーゼに基づく表示のワークフローではチョン·>は、新たに生成されたペプチドの開裂生成物（黒いドットがラベルされていない、赤単標識ペプチド画分を示す）については50％単18 O混入比率のペプチド結合切断反応の結果。その反応生成物を再バインドするプロテアーゼ（トリプシンなど例えばセリンプロテアーゼ）がさらにカルボキシル酸素交換反応（緑の点、二重標識したペプチド画分）を介して第18 O原子の取り込みを触媒する。平衡状態では、0.25:0.5:0.25のラベル配布。（UN-;シングル、二重標識）に達した（Ⅱ）タンパク質分解末端ワークフローのpostdigestionラベリングではなくペプチド結合の開裂は発生しません。代わりに、2つの18 O原子までの取り込みはもっぱらカルボキシル酸素交換反応に基づいている。したがって、18 Oを組み込むだけで、そのペプチドの開裂生成物を再バインドするプロテアーゼで発生します。p_upload/3891/3891fig4large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図5。酸触媒の18 O標識はカルボキシル基当たり2 18 O原子の取り込みにつながる。実験の過程で、アンジオテンシン-1の同位体エンベロープは取り込みに対応した複数の2 Daの質量シフト（破線）を受けO原子18。 18 O取り込みの部位はアミノ酸配列（青）で強調されています。
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Discussion
時間分解方法で、安定同位体標識と高分解能質量分析を組み合わせることで、古経時方法は、ペプチド生成物の生成の動的解析が可能になります。アッセイは、定量的および定性的プロテオミクス研究のための安定同位体で標識されたペプチドを生成するとプロテオティピックペプチドが生成されることにより反応速度を評価するために用いることができる。さらに、古経時は、特定の、生理学的に関連する条件を ex vivoでタンパク質分解経路を評価するために設計されています。内因性タンパク質、ペプチド、およびプロテアーゼならびに合成ペプチド及び組換えプロテアーゼがワークフローで利用することができる。調査されるべき特定のタンパク質分解反応に応じて、アッセイ条件とスポッティング時間は反応プロセスの最適なサンプリングを提供するために調整することができます。我々の経験では、それは、部屋、低い酵素濃度を使用することによって（ 例えば、タンパク質分解反応を遅くしておくと便利です。便利な手動のサンプリング間隔を可能にする温度）は、他の安定同位体標識方法論と同様に、実験的な18 O取り込み比測定のための偏差は小さいです-十分なイオン統計を持つピークでは5％以下（typ）。全体のプロトコルを容易に合成基質の大規模なセットや複雑な生物学的サンプル（ 例えば 、細胞培養培地、体液）からの内因性ペプチドのタンパク質分解処理の特性のスクリーニング、例えば、他のアッセイフォーマットに適合させることができます。我々は以前、古アプローチは、LC分離工程とハイフネーション、そしてヒト唾液ペプチドー9の動的構成を定義するために使用することができる方法を紹介しました。パレオ·時間経過によって識別されるタンパク質分解署名がプロテアーゼの基質特異性に関する重要な事実を提供する興味のある。また、時間分解データはまた、運動情報が得られます。そのような知識は、再現性が非常に豊富な標的ペプチドの選択は21不可欠である定量的プロテオミクス研究のためのプロテオティピックペプチドの評価に特に有用である。同様に、タンパク質分解経路における律速ステップを特定することは新規なプロテアーゼベースの治療薬の開発のために高い関心がある。プロテアーゼは、多くの生理学的および病理学的プロセス（ 例えば 、心血管障害、神経変性疾患、がん）とそのような観察 の重要な要因は、治療的介入のための新しい機会を開くことができますされます。アレオ·ストラテジー - カルボキシル基の酸触媒によるラベリングは - 簡単に安定同位体でエンコードされた基準を生成する合成および内因性ペプチドに適用されます。酸触媒反応の速度論は、酵素触媒反応よりもはるかに遅いです。したがって、実験は慎重に先に計画されなければならない。アレオ·時間経過は、化学に代わる低コスト、代謝や合成ラベルmです現在のプロテオミクス研究で使用ethods。ラベリング処理は、18 O取り込みは他の安定同位体標識法上の利点になります平衡に達しているかどうかを検証するために監視することができます。結論として、ここで説明LEO-経時ワークフローは、創造的に多くの定性的および定量的プロテオミクス研究ならびにプロテアーゼの研究に用いることができる汎用性の高いツールです。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIH / NIDCRグラント1R01DE019796によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
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