Summary
Stabil isotop märkning arbetsflöden som använder
Abstract
Stabila isotoper är viktiga verktyg i biologisk masspektrometri. Historiskt har 18 O-stabila isotoper i stor utsträckning använts för att studera de katalytiska mekanismer av proteolytiska enzymer 1-3. Med tillkomsten av masspektrometri-baserade proteomik har enzymatiskt-katalyserad inkorporering av 18 O-atomer från stabil isotopanrikning vatten blivit en populär metod för att kvantitativt jämföra nivåerna proteinuttryck (granskad av Fenselau och Yao 4, Miyagi och Rao 5 och Ye et al. 6). 18 O-märkning är en enkel och billig alternativ till kemisk (t.ex. iTRAQ, ICAT) och metabola (t.ex. SILAC) tekniker märkning 7. Beroende på den utnyttjade proteaset, kan 18 O-märkning resultera i införlivandet av upp till två 18 O-atomer i den C-terminala karboxylgruppen av klyvningsprodukten 3 8. I vår Paleo (p rotease-en ssisted L abeling e mploying 18 O-berikat vatten) anpassning av enzymatisk 18 O-märkning, utnyttjade vi 50% 18 O-berikade vattnet för att ge distinkta isotop signaturer. I kombination med hög upplösning matris-assisterad laser desorption jonisering time-of-flight tandem-masspektrometri (MALDI-TOF/TOF MS / MS), kan de karakteristiska isotopen kuvert användas för att identifiera klyvningsprodukter med en hög grad av specificitet. Vi har tidigare använt Paleo-metoden för att upptäcka och karakterisera endogena proteaser 9 och övervaka proteolytiska reaktioner 10-11. Sedan paleo kodar själva kärnan i den proteolytiska klyvningen reaktionen är experimentuppställning enkel och biokemiska Enrichment steg klyvningsprodukter kan kringgås. Den Paleo-metoden kan lätt utvidgas till (i) experiment tidsförloppsdata som övervakar dynamiken i proteolytisk klyvning reaktioner och (ii) analys av proteolys i komplexa biologiska prover som representerar fysiologiska förhållanden. Paleo-tidsförloppet experiment hjälper identifiera hastighetsbegränsande processteg och intermediärer reaktionsprodukter i komplexa proteolytiska pathway reaktioner. Vidare medger paleo-reaktionen oss att identifiera proteolytiska enzymer såsom serinproteaset trypsin som är kapabel att binda sina klyvningsprodukter och katalyserar införlivandet av en andra 18 O-atomen. Sådana "dubbla" märkning enzymer kan användas för postdigestion 18 O-märkning, i vilka peptider uteslutande märkta av karboxyl syreutbytet reaktion. Vår tredje strategi sträcker märkning sysselsätter 18 O-berikade vattnet utanför enzymer och använder sura pH-förhållanden för att införa 18 O-stabil isotop skyltrer till peptider.
Protocol
De presenterade LEO-arbetsflöden möjliggöra stabila isotopen märkning av protein smälter och syntetiska peptider. Dessa tidsförloppsdata experiment (figur 1) är tillämpliga på jämförande och kvantitativa proteomik studier samt proteas forskning. Varje arbetsflöde består av två experimentella steg (figur 2): A) tidsupplöst provtagning av respektive 18 O-stabil isotop-kodad reaktion (proteas-katalyserad peptidklyvning, proteas-katalyserad karboxylgrupp syreutbytet reaktion, syrakatalyserad karboxylgrupp syreutbytet reaktion) och B) analys med masspektrometri och grafisk representation av 18 O-införlivande kinetik.
A. tidsförloppet Experiment
I. paleo-tidsförloppet: Proteas-katalyserad märkning av proteolytiska klyvningar
- (Valfritt) Disulfidbindningar av proteiner (10 | iM) och peptider (250 | iM) reduceras med DTT (slutlig koncentration 2,5 mM)i 25 mM NH 4 HCO 3 (båda nyberedd) genom inkubation under 30 minuter vid 50 ° C.
- (Valfritt) fria cysteiner alkyleras med jodacetamid (slutlig koncentration 10 mM) i 25 mM NH 4 HCO 3 genom inkubation under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Beroende på proteas av intresse, protein / peptid-lösningar måste rengöras för att avlägsna återstående buffert och alkyleringsmedel. Använd PepClean C-18 spinnkolonner (Thermo) för peptid sanering och Vivaspin Centrifugal Koncentratorer (Sartorius) att utbyta buffertar för proteinprover.
- Återupplös / utbyta peptider / proteiner i 20 pl proteas reaktionsbuffert (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5, trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) innehållande 1:1 (volym / volym) slutlig H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
- Uttag en noll prov tidpunkt före tillsatsen av proteas: Blanda 0,5 pl av reaktionsblandningen och 0,5 pl alfa cyano-4-hydroxikanelsyra-matris (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA). Spot provet på en Opti-TOF 384 MALDI måltavla (AB SCIEX) och låt lösningsmedlet dropparna vid rumstemperatur tills torr (ca 5 min).
- Split reaktionslösningen i två alikvoter. Den första alikvoten kommer att inkuberas med proteaset av intresse (ECE-1: 75 nM; trypsin: 0,04 nM) vid rumstemperatur eller den rekommenderade temperaturen för det speciella enzymet. Den andra alikvoten kommer att inkuberas utan proteas och kommer att fungera som kontrollprov. Den första alikvoten representerar ett standardprov för proteas-katalyserad 18 O-märkning och kan användas för peptid-och protein-identifiering, detektion av proteolytiska aktiviteter och övervakning av proteolytiska klyvningsreaktioner. Den andra alikvoten användes för att visa att 18 O-inkorporering induceras av proteaset, och därför varken märkning eller klyvning förväntas för detta prov.
- Följ reaktionen genom att ta bort reaktion alikvoter och spotting dem som described under steg 5 på tidsintervall som verkar lämpligt. De reaktionsbetingelser som beskrivits ovan används för att övervaka en proteolytisk reaktion för upp till fyra dagar (ca 24 platser). Börja provtagning var 5 min tills 30 minuter, sedan plats varje 30 min tills 2 timmar, därefter var hr till 8 timmar och varje 8 timmar till 4 dagar. Klyvningsprodukter ska visas inom de första 12 timmar och substratet ska vara helt hydrolyseras efter 24 timmar. Utökade reaktionstider inkubationstider möjligt att definiera stabila reaktionsprodukter som är skilt från reaktion mellanprodukter, vilket ytterligare behandlas. Beroende på forskningsfråga och givet enzym-substrat par har spotting tider och inkubationstemperatur att moduleras för att säkerställa optimal reaktion provtagning.
- Efter den sista reaktionen tidpunkten är fläckig eller mellan förlängda spotting intervall är MALDI måltavla in till MALDI-TOF/TOF MS / MS-analys som beskrivs nedan (avsnitt B).
II. Paleo-tidsförloppet: Postdigestion märkning av proteolytiska termini
- (Valfritt) Disulfidbindningar av proteiner (10 | iM) och peptider (250 | iM) reduceras med DTT (slutlig koncentration 2,5 mM) i 25 mM NH 4 HCO 3 (båda nyberedd) genom inkubation under 30 minuter vid 50 ° C.
- (Valfritt) fria cysteiner alkyleras med jodacetamid (slutlig koncentration 10 mM) i 25 mM NH 4 HCO 3 genom inkubation under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Beroende på proteaset av intresse, protein / peptid-lösningar måste rengöras för att avlägsna återstående buffert och alkyleringsmedel. Använd PepClean C-18 spinnkolonner för peptid sanering och Vivaspin Centrifugal Koncentratorer för protein buffert utbyte.
- Återupplös / utbyta städas upp peptidprodukter / proteiner i 20 pl proteas reaktionsbuffert (t.ex. trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) och smälta med proteas av intresse till fullbordan (t.ex. trypsin: 0,04 nM, 37 ° C, 12 timmar).
- Cleanup klyvningsprodukter med PepClean C-18 spinnkolonner. Detta steg kommer att eliminera kvarvarande proteasaktiviteter.
- Återupplös / utbyta städas upp peptidprodukter i 20 pl proteas reaktionsbuffert (trypsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) innehållande 1:1 (volym / volym) slutlig H 2 18 O.
- Uttag en noll prov tidpunkt före tillsats av enzym: Blanda 0,5 pl av reaktionsblandningen och 0,5 pl alfa cyano-4-hydroxikanelsyra-matris (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA). Spot provet på en MALDI måltavla och lämna lösningsmedlet dropparna vid rumstemperatur tills torr (ca 5 min).
- Split reaktionslösningen i två alikvoter. Den första alikvoten kommer att inkuberas med proteas av intresse (t.ex. trypsin: 0,04 nM) vid rumstemperatur eller den rekommenderade temperaturen för det speciella enzymet. Den andra alikvoten kommer att inkuberas utan proteas och kommer att fungera som en kontroll. Den förstaalikvot representerar ett standardprov för proteas-katalyserad 18 O-postdigestion märkning och kan användas för peptid-och protein-kvantifiering. Den andra alikvoten användes för att visa att 18 O-inkorporering katalyseras av proteaset, och därför är ingen märkning förväntas för detta prov.
- Följ reaktionen genom att ta bort reaktion alikvoter och spotting dem som beskrivs under steg 7.) Med tidsintervall verkar som passar. Till exempel, spotted vi inledningsvis var 5 min i upp till 30 min och var 15 min efter det att övervaka karboxyl reaktionen syreutbytet katalyseras av trypsin.
- Efter den sista reaktionen tidpunkten är fläckig eller mellan förlängda spotting intervall MALDI måltavla lämnas till MALDI-TOF/TOF MS / MS-analys som beskrivs nedan (avsnitt B).
III. Aleo-tidsförloppet: syrakatalyserad märkning av karboxylgrupper
- Inkubera individuella peptider (50 nM) med 1:1 (volym / volym) 18 O-anrikat vatten i than närvaro eller frånvaro (kontroll) av 0,1% (volym / volym) slutlig trifluorättiksyra (total volym 30 pl).
- Prov reaktionsprodukterna dagligen för 48 dagar med samtidig observation en 0,5 pl alikvot av blandningen med 0,5 pl av alfa cyano-4-hydroxikanelsyramatris (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA) direkt på en MALDI mål platta.
- Mellan spotting mellanrum och efter observation av den slutliga reaktionen tidpunkten lämna MALDI måltavla för MALDI-TOF/TOF MS / MS-analys såsom beskrivs nedan i avsnitt B.
B. MALDI-TOF/TOF MS / MS datainsamling och analys
- Masspektra förvärvas på en 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
- Före analysen instrumentet kalibreras med en blandning av peptid standarder (Mass Standards Kit för kalibrering av AB Sciex TOF / TOF instrument) med en totalvikt mätfel på ± 50 ppm och ett minsta antal sex toppar att matcha.
- MS-spektra (massintervall400 - 4.000 m / z) förvärvas i tre exemplar med positiv jon-läge med en justerbar laser intensitet (3400 - 3800, steg storlek 50) med en acceptabel bas topp intensitet mellan 2.000 - 45.000. Enstaka skott förvärvas för sub-spektra, med 400 totalt skott / spektrum, stoppvillkor träder i kraft efter 800 sub-spektra förvärvas (godkänd eller underkänd) eller 400 sub-spektra pass acceptanskriterier. Vid låg rikliga prov eller i närvaro av komplexa biologiska bakgrunder den nedre änden av MS-detektion intervallet bör höjas till 800 m / z.. Dessutom kan det vara nödvändigt att avlägsna salt och andra störande föreningar med ett prov sanering steg såsom beskrivits tidigare eller genom LC separationen.
- MS datafiler (. T2D filer) exporteras från 4000-serien Explorer datainsamling programvara och importeras till vår egen laboratorium informationssystem, som använder mjukvara MASCOT Distiller (Matrix Science) för spektral behandling och toppdetektering. Isotopiska kuvertär deconvoluted och 18 O-inkorporering nyckeltal bestäms automatiskt med hjälp av en algoritm som liknar den som beskrivs av Mason et al. 12 och anpassat genom vår grupp 9. Alternativt programverktyg som ZoomQuant 13 och Viper 14, samt kommersiella programvarupaket som som BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) och Mascot Distiller Kvantifiering Verktygslåda (Matrix Science) kan deconvolute 18 O-typ uppgifter 15,16. 18 O-inkorporering nyckeltal uttrycks som de relativa bidragen av individuella peptid isotopen arter (dvs. peptider som innehåller 16 O, 18 O 1 eller 18 O 2) till hela isotopisk kuvertet.
- För varje tidsförloppet experiment de molekylära massorna ([M + H] +) för alla detekterade peptid arter extraheras från de associerade MS datafiler och de värden arkiveras på en 100 ppm massa bredd.
- ENt minst tre [M + H] + är inställd på att behöva fylla en behållare. Vid kända substrat, är den filtrerade bin listan jämfört med en lista av proteolytiska klyvningsprodukter förutsagda från substratet peptidsekvensen med ExPASy FindPept verktyget 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) och en 200 ppm massa fel acceptans tolerans.
- MS / MS-spektra förvärvas för alla massa värden klyvningsprodukter förutspås av FindPept verktyg och bin värden som har 18 O-inkorporeringar associerade med dem. MS / MS-data förvärvas på 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer i 1kV reflektor positiv jon-läge, med en fast laser intensitet 4200 och CID-gas i avstängt läge. 50 skott förvärvas i en randomiserad mönster per sub-spektra upp till totalt 40 under-spektra per plats (vilket ger totalt 2.000 skott / plats).
- MS / MS-data-filer (. T2D filer) exporteras från 4000-serien ExploRER datainsamling programvara och importeras till vår egen laboratorium informationssystem är toppar detekteras och MS / MS topp listor är förknippade med de bin-indelade motsvarande MS-data.
- För peptid identifiering är MS / MS topp listor sökt mot SwissProt databasen med motorn MASCOT sökning med följande sökparametrar: inget enzym specificitet, 150 ppm föregångare jon och 0,2 Da fragmentjon toleranser massa.
- Peptid identifieringar kan dessutom valideras med hjälp av Data Explorer-programmet (AB SCIEX) genom att bekräfta de karakteristiska 18 O-inkorporering mönster över Y-serien fragmentjoner som beskrivs av Shevchenko et al. 18.
C. Framställning av Spectral Tid och 18 O-införlivande Tomter
Spektrala tid tomter: MS datafiler (. T2D filer) för varje reaktion tidpunkt exporteras från Data Explorer-programmet som ASCII-filer med hjälp av enmakro som importeras till en dataanalys och grafisk programvara (t.ex. ursprung genom OriginLab) och visas som vattenfall tomter (Figur 3).
18 O-inkorporering tomter: För varje arkiveras peptid klyvningsprodukt de relativa bidragen från enskilda arter peptid isotopen (16 O, 18 O 1 eller 18 O 2) utvinns i alla punkter reaktionstid och plottas mot tiden (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde Paleo-tidsförloppet arbetsflöde för att dynamiskt övervaka införlivandet av 18 O-stabila isotoper i peptid klyvningsprodukter genereras av proteolytiska enzymer. Den presenterade metoden är ett mångsidigt verktyg för att jämförelsevis studera proteolytiska bearbetning vägar för olika substrat och kombinationer proteas. Genom provtagning proteolytiska reaktioner gånger under loppet av reaktionen ger Paleo-tidsförloppet experiment tidsupplöst ögonblicksbilder av substrat och abundances produkt och bearbetning detaljer. Samtidig spotting prover med sur matris lösningen på en måltavla stoppar den enzymatiska reaktionen och matris kristallisation ytterligare bevarar provets sammansättning. Därför kan tidpunkter efterhand analyseras av MALDI-TOF/TOF MS / MS efter ingåendet av den enzymatiska reaktionen. För att tillgodose data-rika naturen hos dessa experimentella arbetsflöden genomförde vi en halvautomatisk bioinformatik system som beräknar 18 O-integrera detjonförhållanden för varje peptid. Figur 3 visar en representativ spektraldiagram tidsförloppet för bearbetning av peptiden Endokinin C genom ECE-1. Paleo-tidsförloppet data flerdimensionellt: Den utökade utsikt över MS-data över hela massområdet samtidigt visar bestånd av peptidsubstratet samt bestånd av peptiden produkterna. Den temporala arrangemanget tillåter dechiffrera sekvensen av klyvning händelser och bestämma vilka peptidfragment är stabila klyvningsprodukter. Den inzoomade tanke på MS-data avslöjar isotopen höljen varje peptid och klyvning inducerad 18 O-märkning lätt identifieras genom sin karaktäristiska isotop fördelning. 18 O-märkning möjliggör positiv selektion av klyvningsprodukter för efterföljande identifiering med MS / MS. Sammantaget fångar Paleo-tidsförloppet analysen dynamiken i proteolytisk bearbetning och tillåter utvärdering av föredragna klyvningsställen av proteaser. Ytterligare en nivå av informationning kan erhållas beroende på den enzymatiska mekanism utnyttjade proteaset. Vissa proteaser såsom serinproteaset trypsin är kapabla kovalent återbindning sina peptid klyvningsprodukter. . Hydrolysen av acyl-enzym delresultat i införlivandet av ett andra 18 O-atomen i den C-terminala karboxylgrupp Figur 4 visar de resulterande förändringarna i det relativa bidraget av olika isotopomererna över tiden: Den initiala peptidbindning klyvningsreaktion resulterar i en 1:1 split mellan 16 O och 18 O 1 fraktioner peptid. Karboxyl syreutbytet reaktion resulterar i en ökning av 18 O 2 fraktion till 25% förhållandet vid jämvikt med en åtföljande minskning av 16 O-fraktionen. Proteaser kan katalysera den karboxyl reaktionen syreutbytet kan därför användas för en ytterligare 18 O-märkning arbetsflöde, den postdigestion märkningen av proteolytisk TERMini. I dessa typer av experiment, är substrat initialt digereras i frånvaro av H 2 18 O, peptidprodukter städas upp och inkuberades med en färsk sats av proteas, men denna gång i närvaro av 50% H 2 18 O. Figur 4 visar skillnader i isotop inkorporering som kan observeras i dessa två experimentella arbetsflöden och skillnader i införlivande hastighet mellan enskilda peptidsubstrat. I postdigestion märkning arbetsflödet är hastigheten för både 18 O-bolagiseringar bestäms av karboxylgruppen syreutbytet reaktion. Reaktionshastigheten beror på hur lätt proteaset interagerar med sina klyvningsprodukter. Affiniteten för reaktionsprodukten kan indirekt användas för att sluta sig till affiniteten av proteaset till den ursprungliga peptidsubstratet. Sådan information kan vara användbar för att bestämma vilka peptidsekvenser är idealiska substrat t.ex. för tryptiska digereringar i kvantitativa proteomik studier. Peptides som lätt klyvs och dubbel-märkta av trypsin kommer sannolikt att vara proteotypic peptider som är reproducerbart och kvantitativt bildade och därför idealisk för jämförande proteomik studier.
Vid lågt pH, syreatomerna av karboxylsyragrupper utbyte med det vattenhaltiga lösningsmedlet 19-20. Denna reaktion kan användas som ett alternativ till proteas-katalyserad märkning strategier för att införa stabila isotoper i peptiderna. I Aleo-tidsförloppet (syrakatalyserad märkning använder 18 O-berikat vatten) arbetsflöde, övervakade vi den långsamma inkorporering av 18 O-atomer i syntetiska peptider. Den syrakatalyserade syreutbytet slutade efter sam-kristallisation med matrisen lösningen på MALDI måltavla, effektivt "frysa" isotopen distributionen staten. Vi använde Angiotensin 1 som modell peptid och undersökt sin isotop kuvert med tiden (Figur 5). Ett upptag av två 18 O-atomer för varje bilboxyl grupp observerades. Enligt de nuvarande experimentella förhållanden var den syrakatalyserade karboxylgrupp syreutbytet reaktion mycket långsammare än proteas-katalyserade utbyte 9 och nådde jämvikt först efter 48 dagar. Men ger Aleo tillvägagångssättet fördelen att märka peptider som inte erkänns av proteaser. Dessutom, peptider innefattar flera 18 O-atomer beroende på antalet sura sidokedjor, vilket kan resultera i fullständig separation av isotopen höljen av omärkt och märkt arter. Den totala massförskjutning ger information om antalet sura rester i en given peptid och deras läge kan erhållas genom analys av MS / MS fragmentjon massa förändringar. 18 O-märkta peptider visas nära identiska kromatografiska beteende som deras omärkta motsvarigheter, vilket gör deras jämförande analys vid samma elueringstid. Sammanfattningsvis syrakatalyserad 18 O-märkningen kan tjäna som ett alternativ till kemiska, svzymatic och metabolisk märkning närmar vanligt i kvantitativa proteomik. En särskild lovande tillämpning av denna teknik är användningen av 18 O-märkta peptider som stabila isotopen standarder.
Figur 1. 18 O-baserade märkning erbjuder en mängd olika arbetsflöden tidsförlopp. (I) proteas-katalyserade paleo-tidsförloppet arbetsflöde möjliggör övervakning av dynamiken i proteolytisk klyvning reaktioner. Beroende på proteas, Dessa reaktioner resulterar i (a) enkel (t.ex. i fråga om vissa metalloproteaser) eller (b) dubbel 18 O-inkorporering (t.ex. i fråga om vissa serinproteaser). (II) Dubbel 18 O-Labeler så eftersom trypsin kan också användas i arbetsflöden postdigestion märkning, där 18 O-inkorporering endast förmedlas av proteas-katalyseradekarboxyl syreutbytet reaktion. (III) Däremot förlitar sig Aleo-tidsförloppet arbetsflöde på syrakatalyserade karboxylgrupper reaktioner syreutbytet av sura peptid sida och ändstående. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Experimentella arbetsflöden för paleo-och Aleo-tidsförloppet strategier. A) (I) I en proteas-katalyserad paleo-tidsförloppet experimentet substrat inkuberas med ett proteas i närvaro av H 2 18 O resulterar i inkorporeringen av upp till två 18 O-atomer beroende på proteaset. (II) I en paleo postdigestion märkning experiment är klyvningsprodukter från en tidigare matsmältning åter inkuberas med ett proteas av intresse i närvaro av H-2 18 O. Proteaser kan dubbel märkning (i arbetsflödet I) katalyserar införlivandet av två 18 O-atomer. (III) I en syrakatalyserad Aleo experimentet, alla sura funktionella grupper innefattar 18 O-atomer B) tidsförloppet Analys:.. Vid tidsintervall, är alikvoter av reaktionsblandningarna samtidigt fläckig med matris på MALDI-målplattor Upon MS- datainsamling är spektrala tid tomter av peptiden klyvningsreaktioner samt 18 O-inkorporering tomter enskilda peptid arter genereras och klyvningsprodukter väljs för MS / MS-baserad sekvens identifiering. Klicka här för att se större bild .
pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Spektrala tid tomter visa dynamiken i proteolytisk klyvning reaktioner. Genom att rita MS-spektra av paleo-tidsförloppet experiment i ett vattenfall arrangemang är det möjligt att samtidigt övervaka nedbrytningen av substratet och uppkomsten av mellanliggande och slutliga klyvningsprodukter. Här,-endothelinomvandlande klyvningen av det bioaktiva peptiden Endokinin C genom enzym-1 (ECE-1) visas. Klyvningsprodukter identifierades av MS / MS och deras isotop kuvert visade de karakteristiska 18 O-inkorporering signaturer (markerade i rött).
Figur 4. Serinproteaser såsom trypsin förmedlar införlivandet av upp till två 18 O-atomer i peptid klyvningsprodukter. (I) Trong> I proteas-baserade märkning arbetsflöde, peptidbindningen klyvningsreaktion resulterar i en 50% enkel 18 O-inkorporering förhållandet för nyligen genererade peptid sönderdelningsprodukterna (svarta punkter indikerar omärkta, röd singel-märkta peptidfraktioner). Proteaser som Rebind deras reaktionsprodukter (t.ex. serinproteaser såsom trypsin) katalyserar ytterligare införlivandet av en andra 18 O-atom via karboxyl syreutbytet reaktion (gröna prickar, dubbel-märkt peptid fraktion). Vid jämvikt, en etikett distribution av 0.25:0.5:0.25. Har (un-;, enkel-dubbel-märkt) uppnåtts (II) i postdigestion märkning av proteolytiska terminaler arbetsflöde, inga peptidbindning klyftor uppstår. Istället, är införlivandet av upp till två 18 O-atomer uteslutande baserad på karboxylsidan syreutbytet reaktion. Därför sker 18 O-inkorporering endast med proteaser som binda sina peptid klyvningsprodukter.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.
Figur 5. Syrakatalyserad 18 O-märkningen leder till införlivandet av två 18 O-atomer per karboxylgrupp. Under loppet av experimentet, genomgick den isotopiska hölje av angiotensin-1 multipla 2 Da mass skift (streckade linjer) motsvarande upptag av 18 O-atomer. Platserna för 18 O-inkorporering markeras i den aminosyrasekvens (blå).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genom att kombinera en stabil isotop märkning och högupplösande masspektrometri i en tidsupplöst sätt tillåter paleo-tidsförloppet metod för en dynamisk analys av alstring av peptid-produkter. Analysen kan användas för att generera stabila isotopiskt märkta peptider för kvantitativa och kvalitativa proteomik studier och utvärdera kinetiken genom vilka proteotypic peptider genereras. Dessutom är paleo-tidsförloppet syftar till att utvärdera proteolytiska vägar under specifika, fysiologiskt relevanta förhållanden ex vivo. Endogena proteiner, peptider och proteaser samt syntetiska peptider och rekombinanta proteaser kan användas i arbetsflödet. Beroende på det speciella proteolytiska reaktionen som skall undersökas, villkor analys och spotting tider kan justeras för att tillhandahålla för optimal provtagning av reaktionsprocessen. Enligt vår erfarenhet är det bra att sakta proteolytiska reaktioner ner (t.ex. genom att använda låga enzymkoncentrationer, rumtemperatur) för att möjliggöra bekväm intervall manuell provtagning Liksom med andra stabila-isotopmärkning metoder, avvikelser för de experimentella 18 O-inkorporering förhållande mätningar är små -. vanligtvis mindre än 5% för toppar med tillräckliga jon statistik. Den totala protokoll kan enkelt anpassas till andra analysformat, t ex screening av ett stort antal syntetiska substrat eller karakterisering av den proteolytiska bearbetningen av endogena peptider från komplexa biologiska prover (t.ex. cellodlingsmedia, kroppsvätskor). Vi visade tidigare hur Paleo-metoden kan avstavas med en LC-separationssteg, och används för att definiera dynamiska sammansättningen av människans saliv peptidome 9. Proteolytiska signaturer identifierats av paleo-tidsförloppet ger viktiga fakta om substratspecificiteten av proteaset av intresse. Dessutom ger de tidsupplöst data också kinetisk information. Sådan kunskap är särskilt användbart vid utvärdering av proteotypic peptider för kvantitativa proteomik studier, där valet av reproducerbara och mycket rikligt målpeptider är viktigt 21. Likaså identifiera hastighetsbegränsande stegen i proteolytiska reaktionsvägar är av stort intresse för utveckling av nya proteas-baserade läkemedel. Proteaser är nyckelfaktorer i många fysiologiska och patologiska processer (t.ex. kardiovaskulära sjukdomar, neurodegenerativa sjukdomar, cancer) och sådana observationer kan öppna nya möjligheter för terapeutiska ingrepp. Den Aleo-strategi - syrakatalyserad märkning av karboxylgrupper - lätt appliceras på syntetiska och endogena peptider för att producera stabila isotopiskt kodade normer. Kinetiken för den syra-katalyserade reaktionen är mycket långsammare än den enzym-katalyserade reaktionen. Därför experiment måste planeras noggrant i förväg. Aleo-tidsförloppet är en låg kostnad alternativ till kemiska, metabolisk och syntetisk märkning methods används för närvarande i proteomik studier. Märkningen processen kan övervakas för att validera att 18 O-inkorporering i jämvikt, vilket kan vara en fördel jämfört med andra stabila metoder isotopmärkning. Sammanfattningsvis LEO-tidsförloppet arbetsflöden som beskrivs här är mångsidiga verktyg som kreativt kan användas i många kvalitativa och kvantitativa proteomik studier samt proteas forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
