En TIRF Mikroskopi Technique for i realtid, Samtidig Billeddannelse af TCR og dens associerede signalproteiner

Summary

Den opdeling af proteiner enten i plasmamembranen eller ind i intracellulære steder er en regulerende mekanisme, der kan have stor indflydelse signalanlæg resultater, og derfor til at forstå signalere er det vigtigt at studere den rumlige og tidsmæssige opførsel af de involverede proteiner. Vi beskriver her en TIRF mikroskopi system til at undersøge signaltransduktion i T-celler, men er bredt anvendelig.

Abstract

Signalering initieres via T-cellereceptor (TCR), når den er i indgreb med antigene peptid-fragmenter bundet af Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteiner, der udtrykkes på overfladen af ​​antigenpræsenterende celler (APC'er). TCR-komplekset består af ligandbinding TCRαβ heterodimer, der associerer ikke-covalent med CD3 dimerer (de εδ og εγ heterodimerer og ζζ homodimer) ^1. Ved indgreb af receptoren, er de CD3 £-kæderne phosphoryleret af Src-familiekinase, Lck. Dette fører til ansættelse af Syk familien kinase, Zap70, som derefter phosphoryleres og aktiveres af Lck. Efter at phosphorylerer Zap70 adapteren proteiner LAT og SLP76, initiering af dannelsen af den proximale signalering kompleks indeholdende et stort antal forskellige signalmolekyler ^2.

Dannelsen af ​​dette kompleks i sidste ende resulterer i calcium-og Ras-afhængige transcription faktor aktivering og den efterfølgende initiering af en kompleks række genekspressionssystemer programmer, som giver anledning til T-celle differentiering ^2. TCR-signaler (og den deraf følgende tilstand af differentiering) kan moduleres af mange andre faktorer, herunder antigen styrke og krydstale med co-stimulatory/co-inhibitory, chemokinet, og cytokin receptorer ^3-4. Undersøgelse af rumlige og tidslige organisering af proksimale signal kompleks under forskellige stimulering forhold er derfor nøglen til at forstå TCR signalvejen samt dens regulering af andre signalveje.

En meget nyttig model til undersøgelse signalering initieret af TCR på plasmamembranen i T-celler er glas-understøttede lipiddobbeltlag, som beskrevet tidligere ^5-6. De kan anvendes til at præsentere antigen pMHC komplekser, adhæsion og co-stimulatoriske molekyler til T-celler, tjener som kunstige APC'er. Ved billeddannelse af T-celler vekselvirker medlipiddobbeltlag med total indre refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM), kan man begrænse excitation inden for 100 nm i rummet mellem glasset og celleoverfladen ^7-8. Dette giver os mulighed for at billedet først og fremmest de signaler indtræffende begivenheder på plasmamembranen. Som vi er interesseret i billeddannelse af rekrutteringen af ​​signalering proteiner til TCR-komplekset, beskriver vi et to-kamera TIRF billeddannende system, hvori TCR, mærket med fluorescerende Fab (fragment antigenbinding) fragmenter af H57 antistof (oprenset fra hybridoma H57-597 , ATCC, ATCC Nr: kan HB-218), som er specifik for TCRβ og signalproteiner, mærket med GFP, der skal afbildes samtidigt og i realtid. Denne strategi er nødvendigt på grund af den meget dynamiske karakter af både T-cellerne og de signaleringsbegivenheder, der opstår på TCR. Dette imaging modalitet har gjort det muligt for forskerne til billede enkelt ligander ^9-11 samt rekruttering af signalmolekyler til aktiverede receptorer oger et fremragende system til at undersøge biokemi in situ ^12-16.

Protocol

Forsøgsfremgangsmåde

1. Transfektion under anvendelse Amaxa muse-T Cell Nucleofector Kit

Vi beskriver her transfektion af enten naive eller in vitro-aktiverede primære T-celler med ekspressionsplasmider kodende signalmolekyler mærkede ved GFP ved anvendelse af Amaxa muse-T Cell Nucleofector Kit. In vitro-aktivering af T-celler ved anvendelse af peptidbelastede milt APC'er udføres som beskrevet ovenfor ^7. Alle T-celler, der anvendes i vore studier udtrykke og TCR som genkender MCC peptid (88-103) bundet til MHC-molekylet IE ^k.. Transfektion foretages væsentlige i henhold til fabrikantens anbefalinger, men præsenterer vi nogle tips, der fremmer levedygtigheden af ​​T-celler efter transfektion. Både levedygtigheden og transfektionseffektivitet er meget højere i in vitro-aktiverede T-celler end i naive celler.

1. Før start, fremstilling 2 ml suppleret T-celle medium ved tilsætning af 20 pibegge medium komponenterne A og B og 100 pi af føtalt bovint serum (5%) for hver transfektion, der skal udføres. Ækvilibrere medium i en 12-brønds plade i en befugtet 37 ° C, _5% CO2 inkubator i mindst en time. Alternativt portioner af mediet suppleret med 5% serum, og komponent A kan fremstilles og opbevares nedfrosset. Hvis dette er tilfældet, tø det krævede antal alikvoter, tilsættes Komponent B og udføre ækvilibrering.

- Pre-ækvilibrering af mediet er meget vigtigt, da celledød vil resultere fra re-suspension af celler efter transfektion i medium, der er enten koldt eller har en pH-værdi end 7,2.

2. Dernæst forberede transfektion blanding. Kombiner 82 uL af muse-T Cell Nucleofector opløsning med 18 pi Supplement 2 og 5 ug af plasmid-DNA (koncentration ikke mindre end 0,5 ug / ul). Blandes grundigt ved at trykke røret eller ved anvendelse af mikro-pipette.

-Det er vigtigt at udføre en titrering af plasmid dosis for et fast antal af celler for hver konstruktion kan anvendes til transfektion. For nogle større konstruktioner kan yderligere DNA være påkrævet. DNA bør være fri for endotoksiner.

3. Overførsel 5 til 10 millioner celler i et 15 ml centrifugerør. Centrifugeres ved 600 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjerne så meget af supernatanten som muligt med et vakuum aspirator.

- De producenter anbefaler spinding cellerne på mindre end 90x g, i vores tilfælde, svarer denne hastighed til 75X g.. Den valgte relative centrifugalkraft (RCF) til opnåelse af en cellepellet er måske den mest vigtige variable, som centrifugering ved lav RCF udelukker beskadigelse af cellemembranen.

4. Genopslæmmes cellepelleten i transfektionsblandingen ved forsigtigt og langsomt pipettering cellepelleten indtil der ikke er store klumper af celler tilbage. Dette kan normalt ske ved helt at suge cellerne through pipettespidsen ikke mere end 3-4 gange.
5. Ved hjælp af en pipette, overføres forsigtigt til suspensionen til en certificeret Amaxa kuvette, sikrer, at der ikke er nogen luftbobler til stede. Hætten kuvetten.
6. Vælge Nucleofector program X-001 på Nucleofector enheden. Sæt kuvetten i Nucleofector kuvetteholderen og anvende det valgte program.

- Efter elektroporere cellerne, er det bedst at straks overføre dem til forækvilibreret dyrkningsmedium. Producenterne anbefaler, at cellerne holdes i nucleofector medium for længere end 15 minutter.

7. Bringe kuvetten, og præ-ækvilibreret fuldt suppleret dyrkningsmedium til hætten. Hjælp af den medfølgende plastpipette ca 500 pi af mediet tilsættes til kuvetten og overføre cellesuspensionen til mediet i pladen dråbevis.
8. Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 4 timer før imagografi. Naive celler er incubatED ved 30 ° C i stedet for 37 ° C. Dette bidrager til at opretholde deres reaktivitet med antigen.

- Tre til fire timers inkubation er generelt tilstrækkelig til T-celler til detekterbart udtrykke GFP mærkede proteiner. Vi valgte at billedet celler på dette tidspunkt, da niveauet af ekspression er lavt, og artefakter i over-ekspression bør minimeres. Hvis overekspression af et bestemt protein er ønsket, bør imidlertid T-celler fjernes fra Amaxa mediet efter 4 timer. Dette opnås ved igen pelletting cellerne ved lav RCF og resuspendering i præ-ækvilibreret T-celle dyrkningsmedium suppleret med 50 U / ml interleukin 2 (IL-2) ved en densitet på 2 millioner celler / ml.

2. TIRF Mikroskopi

Beskrivelse af TIRF mikroskop:

1. Generelle konfiguration: Optiske komponenter blev bygget omkring et Olympus IX71 fluorescens mikroskop, der oprindeligt var udstyret med et Olympus TIRF modul. Vi fik hurtigt discovered kromatiske effekter i dette modul, når en enkelt justering stat ikke opnå sammenfaldende collimation for laser linjer af forskellige bølgelængder. Dette modul, ville derfor ikke mulighed for samtidig TIRF billeddannelse ved hjælp af forskellige excitationsbølgelængder, og vi satte sig for at konstruere en brugerdefineret TIRF apparat, der minimerer kromatiske effekter i systemet, som vi diskuterer i detaljer i de følgende afsnit. Den her beskrevne metode blev udviklet for 150 X forstørrelse, 1,45 numerisk åbning (NA) TIRFM mål (Olympus), men fungerer lige så godt for 60 X forstørrelse, 1,45 NA versioner. For bred feltbelysning er mikroskop forbundet til et metalhalogenid Lambda-XL lyskilde og en excitationsfilter hjul (Sutter Instruments) udstyret med excitationsfiltre. Til automatiseret anbringelse af prøven fase med hensyn til formålet, er mikroskop udstyret med et motoriseret XY translation, piezo-kontrolleret Z trin (ASI). Billeder er taget med to identiske QuAntem elektron multiplicere (EM) CCD-kameraer (Photometrics). Den pixelstørrelse på disse kameraer matcher meget godt med den forstørrelse, der tilbydes af 150 X TIRF mål, hvilket giver en endelig løsning på 0,1 um per pixel. De EMCCD kameraer tilbyder også følsomheden til at visualisere GFP transfektanterne har lavt udtryk niveau.
2. Lasere: Til TIRF belysning, et system af 5 lasere levere en i alt 6 laserlinier (405, 440, 488, 514, 561 og 640 nm) er koblet til en single-mode fiber (Solamere Technologies). Argon laser og 561 nm diode pumpes faststof (DPSS) laser (linier 488, 514 og 561) er ført gennem en akusto-optisk afstemmelige fiber (AOTF) for intensitet kontrol, mens intensiteten af ​​diodelasere (405, 440 og 640 nm) styres ved at modulere spændingen af ​​deres strømforsyninger. Spændingen på AOTF og strømforsyninger af diodelaserne styres via et dataopsamlingssystem kort (DAC) board (Måling Computing) under anvendelse MetaMorph software (molekylærLAR Devices). Koblingseffektiviteten for diodelaserne er 30%, mens de af argon og DPSS lasere er ca 60% på grund af deres mindre beam diametre.
3. TIRF modul: For samtidigt at afbilde TCR og dens tilknyttede signalmolekyler, som beskrevet tidligere, var det vigtigt at have TIRF belysning, som blev kromatisk korrigeret, og som ikke ville kræve justering eller reorientering ved erhvervelse fluorescens-emissioner af forskellige bølgelængder. TIRFM blev opnået under anvendelse gennem-målet belysning, som beskrevet før ^17. Det fiberoptiske kabel, der leverer laserlys til mikroskopet blev sikret til en fiber lancering forsynet med en XY fiber-holder monteret oven på en mikrometer-dreven optisk bane til Z justering (Thorlabs). At opnå TIRF belysning, er laserstrålen fokuseres på bagsiden brændplan af målet ved hjælp af et system af to linser (L1 (kollimerende linse) og L2 (fokuseringslinsen) i figur 1), således at bEAM opstår kollimeret ud af målet. Dette sikrer, at alle lysstråler, der kommer ud af mål vil have samme vinkel i forhold til prøveplanet. Spidsen af ​​den optiske fiber er placeret ved centrum for den kollimerende linse. Ved at bevæge mikrometer langs den optiske skinnen i forhold til den kollimerende linse (Z-retningen) er det muligt at justere fokus for strålen og bevæge strålen i X-og Y-positionen under anvendelse af XY justeringsknapperne. På grund af den meget lille bagsiden åbning 150 X mål fandt vi, at for at opnå TIRF, størrelsen af ​​laserpletten på bagsiden brændplanet for at være lille. For at opnå fokus nødvendig for at producere den lille plet, linser med kort brændvidde var nødvendigt (Keir Neumann, personlig kommunikation), og derfor brugte vi en fokuserende linse med en brændvidde på ca 108 mm, der blev placeret i den dikroiske kuben direkte forud målet. Den kollimerende linse blev anbragt tættere på stråledeleren at bringes i TIRF belysning. For at minimere uønskede kromatiske effekt, vi brugte akromatiske dubletter (kromatisk korrigeret linse lavet af fusionere to linseelementer fremstillet af materialer af forskellige brydningsindeks) med antirefleksionsovertræk for både kollimering og fokusering objektiver (JML Optical). Fokus kan verificeres ved at kontrollere, at strålen opstår kollimeret ud af det mål, når den er anbragt i midten af ​​ryggen blænde og skal danne en tæt plet på rummets loft. Positionen af ​​det fokuserede plet derefter bevæges mod kanten af ​​åbningen (i Y-retningen), der bevirker at strålen konvergere på billedplanet i store vinkler, og i sidste ende er den kritiske vinkel for total indre refleksion opnås. Ved hjælp af disse optiske komponenter, opnåede vi samtidig collimation for alle bølgelængder fra 442 til 640 nm på samme linie. En enkelt optisk justering, således gjort det muligt at udføre TIRFM samtidigt på tværs af flere bølgelængder.
4. Dual kamera tilsyneatus: Samtidig erhvervelse af særskilte fluorescensemission skyldes to forskellige fluorophorer blev opnået ved at opbygge et dobbelt kamerasystem, der deler emission i to bølgelængdeområder ved anvendelse af dikroiske spejle (figur 2). Emitterede lys reflekteres fra målet af den højre side port mikroskop. Da de fleste mål er uendeligt korrigeret (med billeder dannet ved uendelig), et rør linse er forpligtet til at fokusere billedet. At manipulere to emissionsbølgelængder samtidigt blev røret linsen på højre side port fjernet. En tilpasset adapter indeholdende c-mount gevind (Sutter Instruments) blev fastgjort og forbundet med et dikroisk spejl holder (Edmund Optics). Dikroiske spejle, der adskiller GFP-emissionen fra denne af organiske farvestoffer, der anvendes til mærkning af TCR (Alexa546, Alexa647, etc.) blev installeret i holderen. Dette modul blev fulgt i både lyse stier med et rør linseholder, en emission filterholderen og forlængerrør. Denrør linser (TL1 og TL2 (fig. 2)) har en brændvidde på 180 mm. Huller i forlængerrørene fører til EM CCD-kameraer blev dækket med sort papir for at beskytte de kameraer fra falsk lys. For at muliggøre tilpasning af de to kanaler, blev kameraer monteret på to brugerdefinerede XYZ oversættelse stande (Holmarc Products).

Nedenfor beskriver vi, hvordan at tilpasse mikroskop til to kanaler samtidig billeddannelse. De involverede trin er justering af TIRF belysning, justering af laser magt, og rette de to output billeder ved hjælp af sub-opløsning mikrokugler.

1. Før start, er alle komponenter af mikroskopet tændt. Den computer og software derefter startes, og det sikres, at alle hardwarekomponenter genkendes af softwaren.
2. Til anvendelse som et co-lokalisering standard fortyndes 1 ml af sub-opløsning (0,2 um) Fluoresbrite flere fluorescerende mikrosfærer i 2 ml PBS, og der tilsættes 0,25 ml af mikrokuglensuspension til hver brønd af en Lab-Tek II 8-brønds kamre dækglas system (Nunc). Placer kammeret slide systemet på platformen over målet. Perler, som er adsorberet til glasset bliver derefter bragt i fokus.
3. Ved anvendelse af Y opretningen af ​​XYZ fiber start, er positionen af ​​laserstrålen flyttet til midten af ​​ryggen åbning af målet. Det er vigtigt at gøre dette, når målet er i den position, hvor glasset flyet er i fokus. Hvis strålen ikke er kollimeret, er Z mikrometer justeres for at opnå fuld kollimering. Kollimation testes individuelt for alle laserlinier skal anvendes i eksperimentet. På dette tidspunkt er lasereffekten for hver linje målt ved anvendelse af en lasereffekt meter og justeres til 20-30 uW i hver kanal.

-T-celler er ekstremt følsomme over for laserstråling, og belysningen er begrænset til i alt 50 uW.

4. Billeder af perlerne er erhvervet ved hjælp af TIRF illumination i levende tilstand. Dreje Y-tilpasning mikrometer på fiberen start, så at strålen begynder at bevæge sig væk fra loftet, indtil dens vinkel i forhold til målet optiske akse fremgangsmåder 90 grader. Til sidst, når den kritiske vinkel for TIR er nået, vil laserlyset ikke forlade mål. TIRF opretning derefter bedømmes ved at fokusere op og ned gennem planet af dækglas. Hvis perlerne, der flyder i opløsning kan visualiseres, så vinklen for strålen i forhold til de objektive normale behov øges yderligere. Ved den korrekte TIRF justering, vil kun en optisk plan i fokus (dvs. kun perlerne, der er adsorberet til dækglasset). En finere test af TIRF justering kan gennemføres ved billeddannelse T-celler farvet med en overflade farvestof, som har spredt på en overflade. (Se punkt 3,4).
5. Efter TIRF belysning er opnået, kan de to kanaler blive rettet ind i forhold til hinanden. Fokuserer på perlerne og sammenligne positionen af ​​identifiable funktioner i billederne på begge kanaler. Ved hjælp af X og Y mikrometer skruer på et kamera stativ, bringer den relative position af perlerne ind i så tæt som muligt. Gem billeder fra begge kanaler. Disse billeder vil blive brugt som en co-lokalisering standard at tilpasse de to kanaler.
6. Kameraerne skal også tilpasses, så de er parfokalt forhold til hinanden. Dette opnås ved at erhverve et sæt af billeder af de sub-opløsning perler, der er adskilt fra hinanden i Z-retningen ved 100 nm. Hvis den maksimale intensitet pixel for perlerne ligger i samme plan for begge kameraer, så de er parfokalt.

3. Imaging

Når mikroskopet er oprettet, vil den næste opgave at fremstille strømningskamre indeholdende glas understøttede lipiddobbeltlag præsentere antigen og adhæsionsmolekyler som tidligere beskrevet ⁶ og derefter udføre TIRFM af transficerede T-celler interagerer medsubstrat. Den offentliggjorte dobbeltlag protokol ^5-6 blev fulgt som offentliggjort den undtagelse, at liposomerne ikke blev inkuberet i 20 minutter på dækglas efter strømningskammeret blev samlet. I stedet blev HBS-BSA puffer flød i flowcellen efter samling.

1. Samle et strømningskammer med plane lipiddobbeltlag dannet på dækglas, der indeholder Ni-NTA lipider. Adhæsionsmolekyler, er ICAM-1 (100 molekyler / um ^2), og peptid-MHC-komplekser, MCC indlæst IE ^k. (5-10 molekyler / um ^2), som er inkorporeret i dobbeltlaget via deres histidin-tags. Det costimulerende molekyle CD80 tilsættes ved anvendelse af en GPI-anker (100 molekyler / um ^2).
2. Anbring flowcellen på det stadium af mikroskopet og stabilisere den. Fastgøre fabrikanten leverede varmeelementet på flowcellen for at styre temperaturen. Placer målet om en dobbeltlaget og bring i dobbeltlaget flyet i at fokusere. Aktiver opvarmning af mål og strømmencelle for at stabilisere temperaturen af ​​kammeret ved 37 ° C.
3. Transficerede T-celler pelleteres efter 4 timers inkubation ved en hastighed på 80x g og resuspenderet i HBS-BSA puffer og suppleret med 10 ug / ml H57 Fab eller 20 ug / ml H57 enkelt kæde variable fragment (scFv) til mærkning af TCR. De celler injiceres derefter i strømmen celler. Billeddannelse sker i den kontinuerlige tilstedeværelse af Fab-eller scFv grund af deres høje dissociationskonstant. Deres tilstedeværelse på mellemlang ikke væsentligt øger baggrund som TIRF felt er meget tynd.
4. Imaging betingelser er sat op, så dual channel levende erhvervelse viser en live preview af TCR, og GFP-kanaler, der hjælper med at lede efter transfekterede celler. TIRF belysning bekræftes ved at fokusere glasset op flyet til at afsløre eventuelle lateral membranfarvning. Hvis laterale membraner ikke kommer i fokus derefter TIRF justeringen er god. Transficerede celler derefter afbildes en gang eller i en billedsekvens for at producere VidEOS.

4. Image Processing og dataanalyse

Softwaren udsender billeder fra de to kameraer i en enkelt ramme. Udgangen af ​​hvert kamera er 512 x 512 pixel, og derfor udgangsbilledet er 1024 x 512 pixels i størrelse. Billederne skal først opdeles i individuelle rammer svarende til de to kameraer. Billederne i sub-opløsning perler fra de to kanaler er overlejret og opstillingsparametre bestemmes. En funktion der er specifikke for vores system er en graders drejning af en kanal i forhold til den anden (se figur 3). Den mest sandsynlige kilde til denne rotation er kameraet stande. Efter denne rotation yderligere relative lineære transformationer i X og Y skal udføres for at slutter perfekt perlerne i forhold til hinanden. Billeder af perler fremstillet i hvert eksperiment for at bestemme de nøjagtige parametre for at bringe de to kanaler. Disse lineære og roterende omdannelser påføres derefter allebilleder og så er de underlagt segmentering algoritmer og co-lokalisering analyse.

5. Repræsentative resultater

Den her beskrevne system kan tilpasses til at studere signal nedstrøms for en receptor på plasmamembranen. Det er særdeles informativ i at studere TCR signalering, fordi signalering sker i optisk løses klynger kaldet TCR microclusters eller endosomer som for nylig beskrevet ^18. Hvis signalering fandt sted i sub-opløsning klynger af receptorer eller i un-klynger receptorer yderligere forsøg skulle gøres for at fortolke data. Som nævnt før, CD3-kæderne af TCR-komplekset undergå phosphorylering af Src-familiekinase Lck ved indgreb af TCR af peptid-MHC-komplekser. Den phosphorylerede CD3ζ kæde derefter rekrutterer den Syk-familien kinase Zap70. Visualisering rekruttering af ZaP70 således rapporterer om phosphorylering status CD3ζ kæde. Styrken af ​​TCR-stimulering kan ændres ved hjælp af peptider muterede ved TCR kontaktrester. Sådanne peptider kaldes ændret peptidligander (personelminer). Et repræsentativt eksperiment er vist i figur 4, hvor agonistpeptider robust rekrutterer Zap70 til TCR microclusters medens den nedre potens peptidet T102L ikke rekruttere Zap70 til TCR microclusters, hvilket viser, at CD3ζ kæden ikke er phosphoryleret i dette tilfælde. Vi kunne drage denne konklusion, fordi vi var nødt til at bare observere rekruttering af Zap70 til TCR-klynger, der blev let afsløres ved TIRFM. En automatiseret segmentering algoritme blev anvendt til at tælle antallet af ZAP70 microclusters per celle. Også vist i den supplerende filmen er den samtidige afbildning af TCR og Zap70 associeret fluorescens. Bemærk den dynamiske karakter af lamelipodium.

<br /> Figur 1. Billede og skematisk af den brugerdefinerede TIRF lanceringen. Panel A viser et fotografi af TIRF lancering monteret på mikroskopet, og panel B er en skematisk afbildning af TIRF start viser lysbanen. Den skematiske og billedet viser positionen af ​​samlelinsen, stråledeleren, fiberen start med X, Y og Z justeringer den kollimerende linse L1, og fokuseringslinsen L2 er installeret i den dikroiske terningen og TIRF mål. Den indsatte viser fokuseringslinsen installeret i den dikroiske terningen.

Figur 2. Billede og skematisk afbildning af de to kamerasystem. Panel A viser et fotografi af de to kamerasystemet som er fastgjort til mikroskopet, og panel B er en skematisk afbildning af samme. Den skematiske og billedet viser positionen af ​​det formål, spejl, dikroisk, rør linser TL1 og TL2, emissions-filtre F1 og F2, de to kameraer C1 og C2 på tarving står med deres respektive X, Y og Z justeringer.

Figur 3. Brug af sub-opløsning perler at tilpasse de to kanaler. Panelerne A og B viser overlays af sub-opløsning perlerne før (panel A) og efter (Panel B) justering. Panel A viser, at en af ​​kanalerne er drejet i forhold til den anden. Panelerne C og D er en undersektion af billederne i A og B. Felt E viser en to-kanals overlejringsbilledet i celler uden behandling. Opstillingsparametre anvendt i panel D blev påført på billedet vist i panel F. Bemærk, hvordan lamelipodium fra de to kanaler er perfekt på linie i panel F og ikke i panelet E. Målestok 4 um for alle paneler.

Figur 4. Zap70 rekruttering TCR microclusters som respons på forskellige personelminer. In vitro aktiverede og T celler blev transficeret med et plasmid kodende Zap70 fusioneret til GFP og blev inkuberet på glas båret Ni-NTA-dobbeltlag, der indeholder 6 molekyler / um ² peptid indlæst His-mærkede IE ^k, 100 molekyler / um ² i Alexa647 konjugeret His-tagget ICAM- 1 og 100 molekyler / um ² GPI-forankret CD80. De indlæst peptider er angivet i den indsatte. ICAM-1 refererer til celler i dobbeltlag indeholdende 100 molekyler / um ² Alexa-647 konjugeret His-mærket ICAM-1. Tokanal samtidige erhvervelse TIRF mikroskopi blev udført i kontinuerlig tilstedeværelse af Alexa546 konjugeret H57 Fab-fragment (ikke-blokerende) at farve TCR. Cellerne blev afbildet op til en time efter første kontakt med dobbeltlaget. Antallet af ZAP70 klynger per celle blev analyseret ved anvendelse af et automatiseret klynge tælling software. Mindst 40 celler blev analyseret i hvert tilfælde. Målestokken 2 um for alle billeder.

92/3892fig5.jpg "/>
Figur 5. Alignment af de to kamerasystemet anvendelse af to forskellige typer af kameraer. Dette panel viser den tilpassede overlejring af sub-opløsning perler afbildet ved hjælp af to kamerasystem, hvor de to kameraer har forskellige pixel størrelser (grøn: 6,45 um pixelstørrelse afbildet på 2x2 Binning og Red: 16 um pixelstørrelse afbildet på intet Binning). Indsatte viser forstørret billede af firkant i midten af ​​feltet. Målestokken 5 um.

Supplerende Movie. Zap70 rekruttering til TCR microclusters som reaktion på agonist peptid. In vitro aktiverede og T-celler blev transficeret med et plasmid kodende Zap70 fusioneret til GFP og blev inkuberet på glas båret Ni-NTA-dobbeltlag, der indeholder 6 molekyler / um ² peptid indlæst His-mærkede IE ^k, 100 molekyler / um ² Alexa647 konjugeret His-mærket ICAM-1 og 100 molekyler / um ² i GPI-forankret CD80. Dual-kanal samtidig encquisition TIRF mikroskopi blev udført ved den kontinuerlige tilstedeværelse af Alexa546 konjugeret H57 Fab-fragment (ikke-blokerende) til farvning af TCR. Et felt af transficerede celler blev gentagne gange afbildet 40 gange med en tidsmæssig opløsning på 10 sekunder pr. Skala bar 2 um. Klik her for at se supplerende film .

Discussion

Vi beskriver her et system til at studere signalering i antigen-specifikke primære muse-T-celler ved anvendelse TIRFM og glas understøttede lipiddobbeltlag som kunstige APC'er. Teknikken er baseret på vellykket udtrykker GFP mærkede proteiner i disse celler. Transfektering T-celler er altid en udfordrende opgave. Typisk elektroporation eller genafgivelse hjælp retrovira eller lentivira anvendes. En teknik er ikke overlegen over den anden; begge har deres begrænsninger og fordele. Vi finder, at elektroporering har følgende fordele: 1) Det kræves ikke, at cellerne blive aktivt dividere det er nødvendigt for retrovira, men ikke lentivira, og 2) ekspression kan styres ved at variere den tid, hvor cellerne inkuberes før imagografi. Den største ulempe er, at vi finder det meget svært at udtrykke proteiner, der er store i størrelse i primære celler. Vi har præsenteret en metode, der giver os meget god cellelevedygtighed efter elektroporation. Som et resultat er det applicable til at bruge den til at opnå siRNA medieret gen-nedregulering.

Vi beskriver også her en tilpasset to kanals samtidige erhvervelse TIRF mikroskop, der er kromatisk rettet og ikke kræver særskilt justering for forskellige bølgelængder. Disse funktioner, men er kommercielt tilgængelige. Vores system er baseret på principperne om TIRF mikroskopi udgivet af eksperter på området og er billigere end kommercielle alternativer. En mulig kritik af vores design er, at vi bruger den samme indfaldsvinkel til de forskellige excitationsbølgelængder. Dette ville resultere i en anden TIRF indtrængningsdybde for forskellige excitationsbølgelængder. Vi mener, at disse effekter er små, fordi den dæmpede bølge er en eksponentielt aftagende felt og dybden af ​​TIRF felt er en lineær funktion af bølgelængden. Fluoroforer tæt på glasoverfladen vil opleve nogen forskel i laser intensiteter mellem de to bølgelængder. For fluoroforer nær penetration dybde, vil intensiteten forskellen 1,3 gange for de to bølgelængder 488 og 640 nm og 1,15 gange for de to bølgelængder 488 og 561 nm. Det samme system kan anvendes sammen med super opløsning teknikker, der gør brug af TIRF belysning.

Vi har også beskrevet en to kamerasystem, der er specialbygget. Ligesom TIRF systemet er lignende apparater også kommercielt tilgængelige. Vores system giver fleksibilitet til at ændre filtrene og dichroics, tillader dets anvendelse med forskellige kombinationer af bølgelængder. Ulempen ved vores system er en grad af rotation for at tilpasse de to billeder. Dette problem kan løses ved at bruge kamera stande, der er piezo-drevet og tilbyder roterende grader af tilpasning. Vi har også med held gennemført to kamerasystem dette mikroskop, hvor kameraerne er forskellige og har forskellige pixel størrelse. Et system som dette ville være nyttigt, hvis en nødvendig følsomhed i den ene kanal og en stor dymisk område i en anden, som begge findes kun sjældent i det samme kamera. Vi brugte Photometrics HQ-2 kamera på 2x2 Binning giver os en effektiv pixel-størrelse på 12,9 um med Photometrics Quant-EM kamera, som har en pixelstørrelse på 16 um. En 180 mm brændvidde rør linse blev anvendt til Quant-EM og en 145 mm brændvidde rør linse blev anvendt til HQ-2-kamera. Den HQ-2 blev kontrolleret ved hjælp af Metamorph software og Quant-EM blev styret via mikro-manager software på en separat computer i ekstern trigger mode. Den eksterne trigger blev givet til Quant-EM kamera ved hjælp af et digitalt output af målingen computing DAC bord, som blev gennemført som en ekstra lukker i configure belysning indstillinger Metamorph. Forholdet mellem fokale længder af rør linser matcher mellem de effektive pixel størrelse. En repræsentativ tilpasning er vist i figur 5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells	Lonza Inc.	VPA-1006
PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit	Life Technologies	K2100-05	For endotoxin free DNA preps
Amaxa Nucleofector Device	Lonza Inc.	AAD-1001
Recombinant Murine IL-2	PeproTech Inc	212-12
Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm	Polysciences, Inc.	24050-5
Lab-Tek II 8-well chambered coverglass	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155409