Summary
Den uppdelning av proteiner antingen inom plasmamembranet eller till intracellulära platser är en reglerande mekanism som kraftigt kan påverka signalsystem resultat, därmed att förstå signalering är det viktigt att studera den rumsliga och tidsmässiga beteendet hos de inblandade proteinerna. Vi beskriver här ett TIRF mikroskopi system för att studera signaltransduktion i T-celler, men är brett tillämpbar.
Abstract
Signalering initieras genom T-cellreceptorn (TCR) när den är i ingrepp med antigena peptidfragment som är bundna av större histokompatibilitetskomplex (pMHC) proteiner som uttrycks på ytan av antigenpresenterande celler (APC). TCR-komplexet är sammansatt av den ligandbindande heterodimer TCRαβ som associerar icke-kovalent med CD3-dimerer (de εδ och εγ heterodimerer och ζζ homodimer) 1. Vid ingrepp av receptorn är CD3 C, kedjor fosforyleras av Src-familjen kinas, Lek. Detta leder till rekrytering av Syk-familjen kinas, Zap70, som sedan fosforyleras och aktiveras av Lek. Därefter fosforylerar Zap70 adaptern proteiner LAT och SLP76, att initiera bildandet av den proximala signalering komplex innehållande en stor mängd olika signalmolekyler 2.
Bildandet av denna komplexa resulterar så småningom i kalcium-och Ras-beroende transcription faktor aktivering och därmed inleda en komplex serie program genuttryck som ger upphov till T-cell differentiering 2. TCR signaler (och den resulterande tillstånd differentiering) moduleras av många andra faktorer, inklusive antigen potens och överhörning med co-stimulatory/co-inhibitory, kemokin och cytokinreceptorer 3-4. Att studera den rumsliga och tidsmässiga organisering av den proximala signaleringen komplexet under olika stimulering förhållanden är därför nyckeln till att förstå TCR signalväg och dess förordning med signalvägar.
En mycket användbart modellsystem för att studera signalering initieras av TCR vid plasmamembranet i T-celler är glas-stödda lipiddubbelskikt, såsom beskrivits tidigare 5-6. De kan användas för att presentera komplex antigena pMHC, vidhäftning och co-stimulerande molekyler till T-celler-fungerar som konstgjorda APC. Genom avbildning av T-celler interagerar medlipidbiskiktet med total inre mikroskopi reflektion fluorescens (TIRFM), kan vi begränsa excitation till inom 100 nm av utrymmet mellan glaset och cellytan 7-8. Detta tillåter oss att bilden främst de signalerande händelserna inträffar vid plasmamembranet. Eftersom vi är intresserade av avbildning rekrytering av signalering proteiner till TCR-komplexet, beskriver vi en två-kamera TIRF bildsystem där TCR, märkt med fluorescerande Fab (fragment antigenbindning) fragment av H57 antikroppen (renat från hybridom H57-597 , ATCC, ATCC nummer: kan HB-218) som är specifik för TCRp och signalering proteiner, märkta med GFP, kan avbildas samtidigt och i realtid. Denna strategi är nödvändigt på grund av den mycket dynamiska naturen hos både T-cellerna och de signaleringshändelser som sker vid TCR. Denna avbildning modalitet har gjort forskare att bilden enstaka ligander 9-11 samt rekrytering av signalmolekyler till aktiverade receptorer ochär ett utmärkt system för att studera biokemi på plats 12-16.
Protocol
Försöksförfarande:
1. Transfektion med användning Amaxa mus T-cell Nucleofector Kit
Vi beskriver här transfektion av antingen aktiverade naiva eller in vitro primära T-celler med expressionsplasmider som kodar signalmolekyler etiketten genom GFP med användning av Amaxa mus T-cell Nucleofector Kit. In vitro aktivering av T-celler med användning av peptid-laddade mjält APC utförs såsom beskrivits tidigare 7. Alla T-celler som används i våra studier uttrycka och TCR som känner igen MCC peptid (88-103) bunden till MHC-molekylen dvs. K. Transfektion utförs huvudsakligen enligt tillverkarens rekommendationer, men vi några spetsar som främjar överlevnad av T-celler efter transfektion. Både livsduglighet och transfektionseffektivitet är mycket högre i in vitro aktiverade T-celler än i naiva celler.
- Innan du börjar, förbereda 2 ml kompletterat T-cell medium genom att tillsätta 20 plbåda mediumkomponenter A och B och 100 | il av fetalt bovint serum (5%) för varje transfektion som skall utföras. Jämvikta mediet i en 12-brunnsplatta i en befuktad 37 ° C, 5% CO2 inkubator under minst en timme. Alternativt alikvoter av medium kompletterat med 5% serum och komponent A, kan framställas och lagras frusen. Om detta är fallet, tina den erforderliga antalet alikvoter, tillsätt komponent B, och utför jämviktningen.
- Pre-jämvikt av mediet är mycket viktigt, eftersom celldöd kommer att resultera från resuspension av celler efter transfektion i medium som är antingen kallt eller har ett pH-värde än 7,2.
- Därefter förbereda transfektion blandningen. Kombinera 82 | il av mus T-cell Nucleofector Lösning med 18 | il av supplement 2 och 5 | ag av plasmid-DNA (koncentration ej lägre än 0,5 pg / pl). Blanda noggrant genom att trycka på röret eller med hjälp av mikro-pipett.
-Det är viktigt att utföra en titrering av plasmid dos för ett fast antal av celler för varje konstruktion som skall användas för transfektion. För vissa större konstruktioner, kan mer DNA krävas. DNA bör vara fri från endotoxiner.
- Överföra 5 till 10 miljoner celler till en 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 600 rpm under 5 minuter vid rumstemperatur. Bort så mycket av den supernatant som möjligt med en vakuumsug.
- De tillverkare rekommenderar att snurra på cellerna vid mindre än 90X g, i vårt fall motsvarar detta hastigheten till 75x gram. Vald relativ centrifugalkraft (RCF) för att erhålla en cellpellet är kanske den mest viktiga variabeln, såsom centrifugering vid låg RCF utesluter skada på cellmembranet.
- Återsuspendera cellpelleten i transfektionsblandningen genom att försiktigt och långsamt pipettering cellpelleten tills det inte finns några stora klumpar av celler kvar. Detta kan vanligen åstadkommas genom att helt aspirering cellerna through pipettspetsen inte mer än 3-4 gånger.
- Med hjälp av en pipett försiktigt överföra suspensionen i en certifierad Amaxa kyvett, se till att det inte finns några bubblor. Cap kuvetten.
- Välja Nucleofector programmet X-001 på Nucleofector anordningen. Sätt in kyvetten i Nucleofector kuvettsläden och tillämpa det valda programmet.
- Efter elektroporera cellerna, är det bäst att omedelbart överföra dem till pre-jämvikt odlingsmedium. Tillverkarna rekommenderar att cellerna hållas i nucleofector medium för längre än 15 minuter.
- Ta kyvetten och pre-jämvikt, fullt kompletterat odlingsmedium till huven. Hjälp av den medföljande plastpipett, tillsätt ca 500 pl av mediet till kyvetten och överföra cellsuspensionen till mediet i plattan droppe för droppe.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 4 timmar innan avbildning. Naiva celler är inkubterad vid 30 ° C i stället för 37 ° C. Detta hjälper till att bibehålla sin reaktivitet mot antigenet.
- Tre till fyra timmars inkubation är i allmänhet tillräckliga för T-celler för att detekterbart uttryck av GFP-märkta proteinerna. Vi valde att bild celler vid denna tidpunkt eftersom nivån av uttrycket är låg och artefakter av överuttryck bör minimeras. Om över-expression av ett speciellt protein önskas, bör emellertid T-celler avlägsnas från Amaxa mediet efter 4 timmar. Detta åstadkommes genom att återigen pelletering av cellerna vid låg RCF och återsuspendering i förjämviktad T-cell-odlingsmedium kompletterat med 50 U / ml av interleukin 2 (IL-2) vid en täthet av 2 miljoner celler per ml.
2. TIRF Mikroskopi
Beskrivning av TIRF mikroskop:
- Allmänna konfiguration: Optiska komponenter byggdes runt en Olympus IX71 fluorescensmikroskop som ursprungligen var utrustad med en Olympus TIRF modul. Vi snart discovered kromatiska effekter denna modul när en enda inriktning stat inte nådde sammanfalla kollimering för laser linjer med olika våglängder. Denna modul därför inte skulle möjliggöra samtidig TIRF avbildning med hjälp av olika exciteringsvåglängder och vi bestämde sig för att konstruera en egen TIRF apparat som minimerar kromatiska effekter i systemet, som vi diskuterar i detalj i de följande avsnitten. Den här beskrivna metoden har utvecklats för 150 gångers förstoring, fungerar 1,45 numerisk apertur (NA) TIRFM mål (Olympus), men lika bra för 60 gångers förstoring, 1,45 NA versioner. För bred fältbelysning är mikroskop ansluten till en metallhalogenid Lambda-XL ljuskälla och en excitations filterhjulet (Sutter Instruments) med excitations-filter. För automatisk positionering av provet scenen med hänsyn till målet, är mikroskop utrustat med en motoriserad XY översättning, piezo-styrd Z steg (ASI). Bilderna har tagits med två identiska QuAntem elektron multiplicera (EM) CCD-kameror (Photometrics). Pixelstorleken av dessa kameror matchar mycket väl med förstoringen erbjuds av 150 X TIRF mål, vilket ger en slutlig lösning av 0,1 m per pixel. De EMCCD kameror har också känsligheten att visualisera GFP transfektanter med lågt uttryck nivå.
- Lasrar: För TIRF belysning, ett system av 5 lasrar ger totalt 6 laserlinjer (405, 440, 488, 514, 561 och 640 nm) är kopplad till en singelmodfiber (Solamere Technologies). Argon laser och 561 nm diodpumpade solid state (DPSS) laser (linjer 488, 514 och 561) leds genom en akusto-optisk avstämbara fiber (AOTF) för intensitet kontroll medan intensiteten av diodlasrar (405, 440 och 640 nm) styrs genom att modulera spänningen över sina nätaggregat. Spänningen på AOTF och nätaggregat från diodlasrar styrs via ett datainsamlingssystem kort (DAC) ombord (Mätning Computing) med MetaMorph mjukvara (moleLAR enheter). Kopplingseffektiviteten för diodlasrar är 30%, medan de hos Argon och DPSS lasrar är ungefär 60% på grund av deras mindre stråldiametrar.
- TIRF modul: För att samtidigt bilden TCR och dess tillhörande molekyler signalering som beskrivs tidigare, var det viktigt att ha TIRF belysning som kromatiskt korrigerades och som inte skulle kräva omläggning eller inriktning vid förvärv av fluorescens utsläpp av olika våglängder. TIRFM uppnåddes med användning through-the-målet belysning, såsom beskrivits tidigare 17. Den fiberoptiska kabeln som levererar laserljus till mikroskopet säkrades till en fiber start försedd med en XY-fiberproduktion hållare monterad ovanpå en mikrometer driven optisk skena för Z-justering (Thorlabs). För att uppnå TIRF belysning, riktas laserstrålen fokuseras vid det bakre fokalplanet av målet med användning av ett system av två linser (L1 (kollimerande lins) och L2 (fokuseringslinsen) i figur 1), så att BEAM framkommer kollimerad ur målet. Detta säkerställer att alla ljusstrålar som kommer ut från målet kommer att ha samma vinkel i förhållande till provets plan. Spetsen av den optiska fibern är placerad vid centrum för den kollimerande linsen. Genom att flytta mikrometer längs den optiska skenan med avseende på den kollimerande linsen (Z-riktningen) är det möjligt att justera fokus för strålen och flytta strålen i X-och Y-positionen med användning av de XY rattarna. Grund av den mycket lilla bakre öppningen av 150 X objektiv, fann vi att uppnå TIRF, storleken av laserpunkten vid det bakre fokalplanet för att vara liten. För att uppnå fokus som krävs för att producera den lilla fläcken, var objektiv med kort brännvidd nödvändigt (Keir Neumann, personlig kommunikation), och därför använde vi en fokuseringslins med en brännvidd på ungefär 108 mm som placerades i den dikroiska kuben direkt före målet. Kollimatorlinsen placerades närmare stråldelaren att bringas i TIRF belysning. För att minimera oönskade kromatiska effekter, använde vi akromatiska dubbletter (kromatiskt korrigerad lins åstadkommas genom att smälta två linselement tillverkade av material med olika brytningsindex) med antireflekterande beläggningar för både kollimerande och fokusera linser (JML optisk). Fokus kan kontrolleras genom att strålen framkommer kollimerad ur målet när den är placerad i mitten av den bakre öppningen och bör utgöra en knipa på rummet taket. Positionen av den fokuserade fläcken förflyttas sedan i riktning mot kanten av öppningen (i Y-riktningen) vilken orsakar att strålen att konvergera på bildplanet vid stora vinklar, och slutligen, är den kritiska vinkeln för total inre reflektion uppnås. Med hjälp av dessa optiska komponenter, nådde vi samtidigt kollimering för alla våglängder från 442 till 640 nm på samma linje. En enda optisk justering, därför tillät oss att utföra TIRFM samtidigt över flera våglängder.
- Dual kamera appaATU-enheter: Samtidig förvärv av det distinkta fluorescensemissionen härrör från två olika fluoroforer uppnåddes genom att bygga en dubbel kamera system som delar upp utsläppet i två våglängdsområden med hjälp av dikroiska speglar (Figur 2). Emitterade ljuset reflekteras från målet av den högra sidoöppning hos mikroskopet. Eftersom de flesta mål är oändligt korrigeras (med bilder som bildas vid oändligt), ett rör lins krävs för att fokusera bilden. Att manipulera två emissionsvåglängder samtidigt, röret linsen på den högra sidoöppning avlägsnas. En skräddarsydd adapter innehållande C-mount gängor (Sutter Instruments) var fäst och kopplas till en dikroisk spegel hållare (Edmund Optics). Dikroiska speglar som separerar den GFP emissionen från den hos organiska färgämnen som används för att märka den TCR (Alexa546, Alexa647, etc) installerades i denna hållare. Denna modul följdes i både ljusa banor genom ett rör linshållare, ett utsläpp filterhållare och rör förlängning. Dentube linser (TL1 och TL2 (figur 2)) har en brännvidd på 180 mm. Luckor i förlängningsrören leder till EM CCD-kamerorna täcktes med svart papper för att skydda de kameror från ströljus. För att möjliggöra inriktning av de två kanalerna, var kameror monterade på två egna XYZ översättning står (Holmarc Products).
Nedan beskriver vi hur du vill justera mikroskop för två kanaler samtidigt avbildning. De inblandade steg anpassa TIRF belysning, justering av lasereffekten, och anpassa de två utgående bilder med hjälp av sub-upplösning mikropärlor.
- Före start, är alla komponenter i mikroskop påslagen. Datorn och programvaran sedan startas och det säkerställs att alla hårdvarukomponenter känns igen av programvaran.
- För användning som ett co-lokalisering standarden späddes 1 | il av sub-upplösning (0,2 pm) Fluoresbrite flera fluorescerande mikrosfärer i 2 ml PBS och tillsätt 0,25 ml av mikrosfärensuspensionen i varje brunn i en Lab-Tek II 8-brunn kammare täckglas systemet (Nunc). Placera systemet kammaren sliden på plattformen ovanför målet. Pärlor som adsorberas på glaset bringas sedan i fokus.
- Använda Y inriktningen av XYZ fiber lanseringen är läget för laserstrålen flyttas till mitten av den bakre öppningen av målet. Det är viktigt att göra detta när målet är i det läge där glaset planet är i fokus. Om strålen inte är kollimerad, är Z mikrometern justeras för att uppnå full kollimering. Kollimering testas individuellt för alla laserlinjema som skall användas vid experimentet. Vid detta stadium är den lasereffekt för varje linje uppmätt med användning av en mätare lasereffekt och justeras till 20-30 ^ W för varje kanal.
-T-celler är mycket känsliga för laserstrålning, och belysningen är begränsad till totalt 50 iW.
- Bilder av pärlorna förvärvas med TIRF illuminatjon i live-läge. Vrid Y-inriktningen mikrometer på fibern lanseringen så att strålen börjar röra sig bort från taket till dess vinkel i förhållande till målet optiska axeln närmar sig 90 grader. Slutligen, när den kritiska vinkeln för TIR är nådd kommer laserljuset inte längre lämnar målet. TIRF inriktning sedan bedöms genom att fokusera upp och ner genom plan täckglas. Om pärlorna som flyter i lösningen kan visualiseras, då vinkeln för strålen i förhållande till de objektiva normala behöver ökas ytterligare. På rätt TIRF inriktning, kommer bara en optisk plan vara i fokus (dvs endast pärlorna som adsorberas till täckglaset). En finare test av TIRF inriktning kan genomföras när avbildning T-celler färgas med en yta färgämne som har spridit på en yta. (Se punkt 3,4).
- Efter TIRF belysning har uppnåtts, kan de två kanalerna vara inriktade med avseende på varandra. Fokusera på pärlorna och jämföra ställning identifiable funktioner i de bilder som produceras i båda kanalerna. Med X-och Y-skruvarna mikrometer på ett kamerastativ, ta den relativa positionen för kulorna i så nära som möjligt. Spara bilder från båda kanalerna. Dessa bilder kommer att användas som ett sam-lokalisering standard för att anpassa de två kanalerna.
- Kamerorna måste också anpassas så att de är parfocal med avseende på en annan. Detta uppnås genom att förvärva en uppsättning av bilder av de sub-upplösning pärlor som är separerade från varandra i Z-riktningen av 100 nm. Om den högsta tillåtna stödnivån pixel för pärlorna ligger i samma plan för båda kamerorna, då de är parfocal.
3. Imaging
När mikroskopet är inställd, är nästa uppgift att förbereda flödeskamrarna innehåller glas stöds lipiddubbelskikt presenterar antigen och adhesionsmolekyler som tidigare beskrivits 6 och sedan utföra TIRFM av transfekterade T-celler interagerar medsubstrat. Den publicerade två skikt protokollet 5-6 följdes som publiceras förutom att liposomerna inte inkuberades i 20 minuter på täckglas efter flödeskammaren sattes ihop. Istället var HBS-BSA-buffert flöt i flödescellen omedelbart efter montering.
- Montera en flödeskammare med plana lipiddubbelskikt bildade på täckglas innehållande Ni-NTA lipider. Adhesionsmolekyler, är ICAM-1 (100 molekyler / xm 2), peptid-MHC-komplex, MCC laddade dvs. K (5-10 molekyler / xm 2), som införlivas i dubbelskiktet via sina histidin taggar. Den samstimulatorisk molekylen CD80 läggs med hjälp av en GPI-ankare (100 molekyler / im 2).
- Placera flödescellen på mikroskopets och stabilisera den. Fäst den tillverkaren medföljande värmeelement på flödet cellen att kontrollera dess temperatur. Placera mål om en biskikt och föra tvåskiktsmembran planet i att fokusera. Aktivera uppvärmning av målet och flödetcellen för att stabilisera temperaturen hos kammare vid 37 ° C.
- Transfekterade T-celler pelleteras efter 4 timmars inkubering vid en hastighet av 80x g och återsuspenderades i HBS-BSA-buffert kompletterad med 10 | ig / ml H57 Fab eller 20 | ig / ml H57 enkelkedjigt variabelt fragment (scFv) till märka TCR. Cellerna injiceras sedan i de flödesceller. Avbildning görs på den kontinuerliga närvaron av Fab-scFv eller på grund av deras höga dissociationskonstanten. Deras närvaro i mediet inte signifikant öka bakgrunden när TIRF fältet är mycket tunn.
- Imaging villkor ställas in så att dual channel levande förvärvet visar en levande förhandsgranskning av TCR och GFP kanaler som hjälper till att söka efter transfekterade celler. TIRF belysning bekräftas genom att fokusera upp glaset planet för att upptäcka eventuella sidled membranfärgning. Om sidomonterade membran inte kommer i fokus då TIRF inriktningen är bra. Transfekterade cellerna avbildas sedan en gång eller i en bildsekvens för att producera VIDEOS.
4. Bildbehandling och dataanalys
Programvaran matar bilder från de två kamerorna i en enda ram. Utsignalen från varje kamera är 512 x 512 pixlar, och därför är den utgående bilden 1024 x 512 bildpunkter. Bilderna måste först delas upp i enskilda bildrutor som motsvarar de två kamerorna. Bilderna av sub-upplösning pärlorna från de två kanalerna är överlagrade och inriktningsparametrar bestäms. Ett särdrag som är specifik för vårt system är en 1 ° rotation av en kanal i förhållande till den andra (se figur 3). Den mest sannolika källan till denna rotation är kameran står. Efter denna rotation ytterligare relativa linjära transformationer i X och Y måste utföras för att sluter pärlorna med avseende på varandra. Bilder av pärlor erhålls i varje experiment för att bestämma de exakta parametrar att anpassa de två kanalerna. Dessa linjära och roterande transformationer appliceras sedan på allabilder och så är de föremål för segmentering algoritmer och samlokalisering analys.
5. Representativa resultat
Det system som beskrivs här kan anpassas för att studera signalering nedströms någon receptor vid plasmamembranet. Det är särskilt informativt att studera TCR signalering eftersom signalering förekommer i optiskt lösas kluster kallas TCR microclusters eller i endosomer som nyligen beskrivits 18. Om signalering inträffade i sub-upplösning kluster av receptorer eller i FN: s klustrade-receptorer ytterligare experiment skulle behöva göras för att tolka data. Såsom nämnts tidigare är CD3-kedjorna i TCR-komplexet genomgå fosforylering av Src-familjen kinas Lck vid ingrepp av TCR genom peptid-MHC-komplex. Den fosforylerade CD3ζ kedjan rekryterar sedan Syk familjen kinas Zap70. Visualisera rekrytering av ZaP70 rapporterar alltså på fosforyleringen status CD3ζ kedja. Styrkan hos TCR-stimulering kan förändras genom att använda peptider muterade vid TCR-kontaktrester. Sådana peptider benämns förändras peptidligander (landminor). Ett representativt experiment visas i Figur 4, där de agonist-peptider kraftigt rekryterar Zap70 att TCR microclusters medan lägre potens peptiden T102L misslyckas att rekrytera Zap70 till TCR microclusters, vilket visar att CD3ζ kedjan inte är fosforylerad i detta fall. Vi skulle kunna dra denna slutsats eftersom vi var tvungna att bara iaktta rekryteringen av Zap70 till TCR kluster som lätt hade upptäckts av TIRFM. En automatiserad segmentering algoritm användes för att räkna antalet av ZAP70 microclusters per cell. Också visas i den kompletterande filmen är den samtidiga avbildningen av TCR och Zap70 förenad fluorescens. Notera dynamiska natur lamelipodium.
<br /> Figur 1. Bild och schematiskt den anpassade TIRF lanseringen. Panel A visar ett fotografi av TIRF lanseringen som installerad på mikroskopet, och Panel B är ett schema över TIRF lanseringen visar ljusvägen. Den schematiska och bilden visar läget av solfångaren linsen, stråldelaren, fibern lanseringen med X, Y och Z ändringar, kollimeringslinsen L1 och fokusera linsen L2 installeras i dikroiska kuben och TIRF målet. Insatsen visar den fokuserande linsen monteras i den dikroiska kuben.
Figur 2. Image och schema över två kamerasystemet. Panel A visar ett fotografi av två kamerasystemet som fäst vid mikroskopet, och Panel B är ett schema över densamma. Den schematiska och bilden visar positionen av målet, spegel, dikroiskt, linser rör TL1 och TL2, filter utsläpp F1 och F2, de två kamerorna C1 och C2 på tarvinge står med sina respektive X-, Y-och Z-justeringar.
Figur 3. Användning av sub-upplösning pärlor att anpassa de två kanalerna. Panelerna A och B visar överlagring av sub-upplösning innan pärlorna (panel A) och efter (fält B) inriktning. Panel A visar att en av kanalerna är roterad i förhållande till den andra. Paneler C och D är en sub del av bilderna i A och B. Panel E visar två bilder kanal överlagring av celler utan bearbetning. Inriktningsparametrar används i panel D applicerades på bilden som visas i panel C. Observera hur lamelipodium från de två kanalerna är perfekt i linje i panel F och inte i panelen E. Skalstreck 4 | im i alla panelerna.
Figur 4. Zap70 rekrytering till TCR microclusters som svar på olika landminor. In vitro aktiverade T-OCH Cellerna transfekterades med en plasmid som kodar Zap70 smält till GFP och inkuberades på glas stödda Ni-NTA dubbelskikt innehållande 6 molekyler / xm 2 av peptid laddad His-märkt-dvs. K, 100 molekyler / xm 2 i Alexa647 konjugerad His-märkt ICAM- 1 och 100 molekyler / xm 2 av GPI-förankrade CD80. De laddade peptider som anges i den infällda figuren. ICAM-1 avser celler på dubbelskikt innehållande 100 molekyler / xm 2 av Alexa-647 konjugeras His-märkt ICAM-1. Tvåkanalig samtidigt förvärvar TIRF mikroskopi utfördes i en kontinuerlig närvaro av Alexa546 konjugerad H57 Fab-fragment (icke-blockerande) för att färga TCR. Cellerna försågs med bild upp till en timme efter initial kontakt med det dubbla skiktet. Antal av ZAP70 kluster per cell analyserades med hjälp av en automatiserad mjukvara kluster räkning. Minst 40 celler analyserades för varje fall. Skala bar 2 m för alla bilder.
92/3892fig5.jpg "/>
Figur 5. Inriktning av de två kamerasystemet med användning av två olika typer av kameror. Denna panel visar linje överlagring av sub-upplösning pärlor avbildas med hjälp av två kameran systemet där de två kamerorna har olika pixel storlekar (Grön: 6,45 m pixelstorlek avbildas på 2x2 binning och Röda: 16 m pixelstorlek avbildas utan binning). Insatsen visar en förstorad vy av rutan i centrum av fältet. Skala bar 5 pm.
Kompletterande Movie. Zap70 rekryteringen till TCR microclusters svar på agonist peptid. In vitro aktiverade OCH T-celler transfekterades med en plasmid som kodar Zap70 smält till GFP och inkuberades på glas stödda Ni-NTA dubbelskikt innehållande 6 molekyler / xm 2 av peptid laddad His-märkt-dvs. K, 100 molekyler / xm 2 av Alexa647 konjugerad His-märkt ICAM-1 och 100 molekyler / xm 2 i GPI-förankrade CD80. Dual channel samtidigt encquisition TIRF mikroskopi utfördes i en kontinuerlig närvaro av Alexa546 konjugerad H57 Fab-fragment (icke-blockerande) för att färga TCR. Ett fält med transfekterade celler upprepade gånger avbildades 40 gånger med en tidsupplösning på 10 sekunder per ram. Skala bar 2 pm. Klicka här för att se kompletterande film .
Discussion
Vi beskriver här ett system för att studera signalering i antigen-specifika primära celler mus-T med TIRFM och glas som stöds lipiddubbelskikt som konstgjorda APC. Tekniken förlitar sig på ett framgångsrikt uttrycker GFP-märkta proteinerna i dessa celler. Transfektera T-celler är alltid en utmaning. Normalt är elektroporation eller gentillförsel använda retrovirus eller lentivirus användas. En teknik är inte överlägsen den andra, båda har sina begränsningar och fördelar. Vi finner att elektroporation har följande fördelar: 1) Det är inte krävs att cellerna aktivt delar som krävs för retrovirus men inte lentivirus, och 2) Uttrycket nivån kan kontrolleras genom att variera tiden cellerna inkuberas vid avbildning. Den största nackdelen är att vi har mycket svårt att uttrycka proteiner som är stora i storlek i primära celler. Vi har presenterat en metod som ger oss mycket bra cellviabiliteten efter elektroporering. Som ett resultat är det applicable att använda den för att få siRNA tystas medierad gen.
Vi beskriver också här en skräddarsydd två-kanals simultan mikroskop förvärvet TIRF som kromatiskt korrigeras och inte kräva separat justering för olika våglängder. Denna förmåga, men är kommersiellt tillgängliga. Vårt system bygger på principerna om TIRF mikroskopi publiceras av experter på området och är billigare än kommersiella alternativ. En möjlig kritik av vår design är att vi använder samma infallsvinkel för de olika exciteringsvåglängder. Detta skulle resultera i en annorlunda TIRF penetrationsdjup för olika exciteringsvåglängder. Vi tror att dessa effekter är liten eftersom den evanescenta vågen är en exponentiellt avklingande fält och djupet av den TIRF fältet är en linjär funktion av våglängden. Fluoroforer nära glasytan kommer att uppleva några skillnader i laserintensiteter mellan de två våglängderna. För fluoroforer nära penetration djup, kommer intensiteten skillnaden 1,3-faldig för de två våglängderna 488 och 640 nm och 1,15 vik för de två våglängderna 488 och 561 nm. Samma system kan användas i kombination med super upplösning tekniker som utnyttjar TIRF belysning.
Vi har också beskrivit ett två kamera system som är anpassade inbyggt. I likhet med TIRF-systemet, liknande anordningar är också kommersiellt tillgängliga. Vårt system ger möjlighet att byta filter och dikroiska, så att dess användning med olika kombinationer av våglängder. Nackdelen med vårt system är det en grad av vridning som krävs för att anpassa de två bilderna. Det här problemet kan lösas med hjälp av kamera står som piezo drivs och erbjuder roterande grader av anpassning. Vi har också framgångsrikt genomfört en två kamerasystem på detta mikroskop, där kamerorna är olika och har olika pixel storlekar. Ett system som detta skulle vara bra om man behöver känslighet i en kanal och en stor dymisk intervall i en annan, vilka båda är knappt i samma kamera. Vi använde Photometrics HQ-2 kameran 2x2 binning ger oss en effektiv pixelstorlek på 12,9 m med Photometrics Quant-EM kamera som har en pixelstorlek på 16 nm. En 180 mm brännvidd röret lins användes för Quant-EM och en 145 mm brännvidd röret lins användes för HQ-2-kamera. HQ-2 kontrollerades med hjälp Metamorph programvara och Quant-EM kontrollerades via mikro-Manager på en separat dator i extern trigger läge. Den externa trigger lämnades till Quant-EM kameran med hjälp av en digital utgång av mätningen datorer DAC styrelse, som genomfördes som en ytterligare slutare i Inställningar Anpassa belysning Metamorph. Förhållandet av fokallängder hos röret linserna innehåller förhållandet av de effektiva pixelstorlekar. En representativ linje visas i figur 5.
Disclosures
Alla djur som används i dessa experiment bibehölls i en specifik patogenfri miljö, och experimenten godkänt av National Institute of Health Animal Care and Use Committee.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av avdelningen för Interna Forskning av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, National Institutes of Health. Vi är tacksamma för Johannes Huppa och Mark Davis för att ge oss med scFv av H57 som används i dessa studier. RV vill tacka Keir Neumann för hjälp diskussion under utvecklingen av denna teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells | Lonza Inc. | VPA-1006 | |
| PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit | Life Technologies | K2100-05 | For endotoxin free DNA preps |
| Amaxa Nucleofector Device | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Recombinant Murine IL-2 | PeproTech Inc | 212-12 | |
| Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm | Polysciences, Inc. | 24050-5 | |
| Lab-Tek II 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155409 |
References
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function. Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S.T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).
- Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways. Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).
- Fraser, I. D., Germain, R. N. Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells. Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Yokosuka, T. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).
- Huppa, J. B. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Tolar, P., Pierce, S. K. A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).
- Treanor, B. The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor. Immunity. 32, 187-199 (2010).
- Treanor, B., Batista, F. D. Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling. Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).
- Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses. Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).
- Purbhoo, M. A. Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse. Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).
- Lasserre, R. Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse. EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Williamson, D. J. Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events. Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).
