Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة

doi: 10.3791/3892 Published: March 22, 2012

Summary

والتقسيم من البروتينات، سواء داخل غشاء البلازما أو في مواقع داخل الخلايا هي واحدة الآلية التنظيمية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير نتائج إشارة، وبالتالي فهم إشارات من المهم دراسة السلوك المكاني والزماني للبروتينات المعنية. نحن هنا وصف نظام الفحص المجهري TIRF يستند إلى دراسة نقل الإشارات في الخلايا التائية، ولكن قابلة للتطبيق على نطاق واسع.

Abstract

وبدأت إشارات من خلال مستقبلات الخلايا التائية (TCR) عندما تشارك بها شظايا الببتيد مستضدي ملزمة بمركب التوافق النسجي الأكبر (الشركة الفلسطينية للرهن) البروتينات وأعرب على سطح الخلايا مستضد تقديم (ناقلات الجنود المدرعة). ويتألف المجمع من TCR TCRαβ مثنوي مغاير يجند ملزم أن الزميلة غير تساهمي مع CD3 dimers (وεδ وεγ heterodimers وhomodimer ζζ) 1. على إشراك مستقبلات، وفسفرته سلاسل ζ CD3 من قبل عائلة كيناز SRC، LCK. هذا يؤدي إلى تجنيد من عائلة كيناز SYK، Zap70 الذي فسفرته ثم وتفعيلها من خلال LCK. بعد ذلك، Zap70 phosphorylates محول البروتينات اللات وSLP76، والشروع في تشكيل مجمع الإشارات القريبة التي تحتوي على عدد كبير من مختلف الجزيئات يشير الى 2.

تشكيل هذه النتائج في نهاية المطاف في مجمع الكالسيوم وهيئة تنظيم الاتصالات التي تعتمد على رأسnscription تفعيل عامل والشروع يترتب على ذلك من سلسلة معقدة من البرامج التعبير الجيني التي تؤدي إلى تمايز الخلايا T 2. إشارات TCR (والدولة الناتجة من تمايز) هي عن طريق التضمين العديد من العوامل الأخرى، بما في ذلك قوة مستضد والحديث المتبادل مع co-stimulatory/co-inhibitory، chemokine، ومستقبلات خلوى 3-4. دراسة التنظيم المكاني والزماني للمجمع إشارات الداني في ظل ظروف تنشيط مختلف ولذلك فإن المفتاح لفهم المسار إشارات TCR، فضلا عن تنظيمها من قبل مما يشير الى مسارات أخرى.

نظام واحد نموذجا مفيدا جدا لدراسة الإشارات التي بدأها TCR في غشاء البلازما في الخلايا التائية هي طبقات ثنائية الزجاج المدعومة من الدهون، كما هو موضح سابقا 5-6. ويمكن استخدام ما لتقديم مجمعات الشركة الفلسطينية للرهن المستضدية، التصاق، والجزيئات شارك في تنشيطية لخلايا T-بمثابة ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعي. بواسطة التصوير خلايا تي التفاعل معطبقة ثنائية الدهن باستخدام مجموع مضان انعكاس داخلي المجهري (TIRFM)، يمكننا الحد من الإثارة على بعد 100 نيوتن متر من المسافة بين الزجاج وسطح الخلية 7-8. هذا يسمح لنا صورة الأحداث التي وقعت في المقام الأول يشير تحدث في غشاء البلازما. كما نحن مهتمون في مجال التصوير تجنيد البروتينات مما يشير إلى مجمع TCR، ونحن تصف اثنين من الكاميرا نظام التصوير TIRF فيه على TCR، وصفت مع فاب فلوري (مستضد جزء ملزم) أجزاء من الجسم المضاد H57 (تنقيته من ورم هجين H57-597 ، آي تي ​​سي سي، عدد ATCC: لا يجوز تصوير HB-218) التي هي محددة لTCRβ، والبروتينات مما يشير، الموسومة ب GFP، في وقت واحد في الوقت الحقيقي. هذه الاستراتيجية هو ضروري نظرا لطبيعة ديناميكية للغاية من خلايا تي وكلا من الأحداث يشير إلى أن تحدث في TCR. وقد سمحت هذه طريقة من طرق التصوير الباحثين ليغاندس صورة واحدة 9-11، فضلا عن تجنيد من الجزيئات مما يشير إلى تنشيط مستقبلات وهو نظام ممتاز لدراسة الكيمياء الحيوية في الموقع 12-16.

Protocol

الإجراءات التجريبية:

1. ترنسفكأيشن Amaxa باستخدام الخلايا التائية الفأر Nucleofector كيت

نحن هنا وصف لترنسفكأيشن إما ساذجا أو في المختبر تنشيط خلايا تي الأولية مع البلازميدات التعبير ترميز الجزيئات يشير الموسومة بواسطة GFP، وذلك باستخدام خلية Amaxa تي الفأر Nucleofector كيت. تتم في المختبر تنشيط خلايا تي باستخدام الببتيد محملة ناقلات الجنود المدرعة الطحال كما هو موضح قبل 7. جميع خلايا تي المستخدمة في دراساتنا تعبر عن TCR والتي تعترف MCC الببتيد (88-103) منضمة إلى الجزيء MHC IE ك. ويتم ترنسفكأيشن خارج أساسا وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، ومع ذلك، فإننا نقدم بعض النصائح التي تعزز بقاء خلايا تي بعد ترنسفكأيشن. كلا سلامة وكفاءة ترنسفكأيشن هو أعلى بكثير في المختبر في خلايا تي المنشطة من السذاجة في الخلايا.

  1. قبل أن تبدأ، وإعداد 2 مل من استكمال المتوسطة الخلايا التائية وذلك بإضافة 20 ميكرولتر منالتي يتعين القيام بها على حد سواء مكونات المتوسطة A و B و 100 ميكروليتر من مصل بقري جنيني (5٪) لكل ترنسفكأيشن. تتوازن والمتوسطة في لوحة ال 12 بشكل جيد في 37 مرطب درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة ساعة على الأقل. بدلا من ذلك، aliquots متوسطة تستكمل مع مصل الدم بنسبة 5٪ ومكون قد تكون مستعدة لتجميد وتخزينها. إذا كان هذا هو الحال، ذوبان الجليد على العدد المطلوب من aliquots، إضافة مكون B، وتنفيذ موازنة.

- مرحلة ما قبل موازنة من وسيلة مهمة جدا، وموت الخلايا ستنجم عن تعليق اعادة الخلايا بعد ترنسفكأيشن في المتوسط ​​الذي هو بارد أو لديه درجة الحموضة الأخرى من 7.2.

  1. المقبل، وإعداد خليط ترنسفكأيشن. ضم 82 ميكرولتر من خلية الفأر تي الحل Nucleofector مع 18 ميكرولتر من الملحق (2) و5μg من البلازميد (تركيز ليست أقل من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر). مزيج دقيق من خلال الاستفادة من أنبوب أو مع استخدام ماصة متناهية الصغر.

-من المهم إجراء معايرة الجرعة البلازميد لعدد محدد من الخلايا في كل التركيبة التي ستستخدم لترنسفكأيشن. بالنسبة لبعض أكبر بنيات، قد يكون مطلوبا أكثر من الحمض النووي. يجب أن تكون خالية من الحمض النووي السموم الداخلية.

  1. نقل 5-10000000 الخلايا لأنبوب الطرد المركزي 15 مليلتر. الطرد المركزي في 600 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة أكبر قدر من طاف ممكن مع الشافطة فراغ.

- الشركات المصنعة توصي الغزل الخلايا في أقل من 90x ز، في حالتنا، وهذا يتوافق مع السرعة ز 75x. واختيار قوة الطرد النسبية (RCF) للحصول على خلية بيليه وربما كان المتغير الأكثر أهمية، كما الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي منخفض يحول دون ضرر لغشاء الخلية.

  1. اعادة تعليق على بيليه خلية في خليط ترنسفكأيشن بواسطة بلطف وpipeting ببطء بيليه الخلية حتى لا توجد كتل كبيرة من الخلايا المتبقية. ويمكن أن يتحقق هذا عادة من قبل الشفط تماما الخلايا التائيةhrough غيض ماصة أكثر من 3-4 مرات لا.
  2. باستخدام ماصة، بعناية نقل التعليق إلى كوفيت Amaxa المعتمدة، والتأكد من عدم وجود فقاعات الحالي. يضع حدا لكفيت.
  3. حدد برنامج Nucleofector X-001 على الجهاز Nucleofector. إدراج كفيت في حامل كوفيت Nucleofector وتطبيق البرنامج المحدد.

- بعد electroporating الخلايا، فمن الأفضل لنقل على الفور لثقافة المتوسط ​​قبل معايرتها. الشركات المصنعة توصي بأن تحفظ الخلايا في المتوسط ​​nucleofector مدة لا تزيد عن 15 دقيقة.

  1. جعل كفيت وقبل معايرتها والمتوسطة ثقافة بالكامل تستكمل إلى غطاء محرك السيارة. باستخدام ماصة بلاستيكية المقدمة، وإضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر من وسيلة لكفيت ونقل تعليق الخلية إلى المتوسطة في قطرة قطرة لوحة.
  2. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات قبل التصوير. خلايا ساذجة هي incubatإد في 30 درجة مئوية بدلا من 37 درجة مئوية. هذا يساعد في الحفاظ على امكانياتها التفاعلية للمستضد.

- ثلاث إلى أربع ساعات من الحضانة هي كافية عموما لخلايا T للتعبير عن detectably في GFP البروتينات المفتاحية. اخترنا صورة لخلايا في هذه المرحلة الزمنية، لأن مستوى التعبير منخفضة، وينبغي التقليل من القطع الأثرية للتعبير عن مدى. إذا كان المطلوب أكثر من التعبير عن وجود بروتين معين، ومع ذلك، يجب إزالة الخلايا التائية من المتوسط ​​Amaxa بعد 4 ساعات. ويتم إنجاز هذا بواسطة pelletting مرة أخرى الخلايا في إطار التعاون الإقليمي منخفضة وresuspending في مرحلة ما قبل معايرتها تي خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع 50 يو / مل من إينترليوكين 2 (IL-2) في مناطق ذات كثافة من 2 مليون خلية / مل.

2. TIRF المجهر

وصف للمجهر TIRF:

  1. وقد تم بناء المكونات البصرية حول مجهر IX71 أوليمبوس مضان الذي تم تجهيزه في الأصل مع وحدة TIRF أوليمبوس: عام التكوين. نحن دي قريباآثار لوني scovered في هذه الوحدة عندما لم دولة واحدة لا يحقق المواءمة إيزاء تتزامن للخطوط ليزر من موجات مختلفة. هذه الوحدة، ومن ثم فهي لا تسمح للتصوير TIRF في وقت واحد باستخدام موجات الإثارة المختلفة، وشرعنا في بناء جهاز TIRF المخصصة التي تقلل من آثار لوني في النظام، ونحن نناقش بالتفصيل في المقاطع التالية. وقد وضعت الطريقة الموصوفة هنا لتكبير 150 X، 1.45 الفتحة العددية (NA) هدف TIRFM (أوليمبوس)، ولكن تعمل فقط كذلك لتكبير X 60، 1.45 إصدارات NA. لإضاءة حقل واسع، يتم توصيل المجهر لمعدن هاليد مصدر الضوء امدا-XL وعجلة مرشح إثارة (آلات سوتر) مزودة مرشحات إثارة. لوضع آلية للمرحلة عينة فيما يتعلق الهدف، تم تجهيز المجهر مع ترجمة XY الميكانيكي، والتي تسيطر عليها بيزو Z مرحلة (ASI). ويتم التقاط الصور باستخدام اثنين من تشو متطابقةantEM الإلكترون الأثر المضاعف (EM) كاميرات اتفاقية مكافحة التصحر (Photometrics). حجم بكسل من هذه الكاميرات يتطابق تماما مع التكبير التي يوفرها هدف TIRF 150 X، وإعطاء قرار نهائي من 0.1 ميكرون لكل بكسل. الكاميرات EMCCD نقدم أيضا حساسية لتصور transfectants GFP وجود انخفاض مستوى التعبير.
  2. ويقترن لإضاءة TIRF، ووضع نظام ليزر من 5 تقديم ما مجموعه خطوط ليزر 6 (405، 440، 488، 514، 561 و 640 نانومتر) إلى واحد من الألياف وضع (تقنيات Solamere): ليزر. ضخ ليزر الأرجون و 561 نانومتر الصمام الثنائي في الحالة الصلبة (DPSS) يتم توجيه الليزر (خطوط 488، 514 و 561) عن طريق الألياف البصرية صوتية الانضباطي (AOTF) للسيطرة على شدة في حين أن شدة أشعة الليزر الصمام الثنائي (405، 440 و 640 ويتم التحكم نانومتر) من قبل التيار الكهربائي في تحوير من امدادات الطاقة الخاصة بهم. يتم التحكم في الجهد على AOTF وامدادات الطاقة من أشعة الليزر الصمام الثنائي من خلال بطاقة الحصول على البيانات (DAC) مجلس (قياس علوم الحاسب) باستخدام MetaMorph البرمجيات (الجزيئيةلار الأجهزة). كفاءة اقتران ليزر الصمام الثنائي هو 30٪ في حين ان تلك ليزر الأرجون و DPSS ما يقرب من 60٪ بسبب بهم بأقطار صغيرة شعاع.
  3. TIRF وحدة: من أجل صورة في وقت واحد TCR وجزيئاته الإشارات المرتبطة بها، كما هو موضح سابقا، كان من الضروري أن يكون TIRF الإضاءة التي تم تصحيحها لونيا، وأنه لن يتطلب إعادة ترتيب أو إعادة تركيز عند الحصول على انبعاثات مضان من موجات مختلفة. وقد تحقق من خلال استخدام TIRFM دون والهدف الإضاءة، كما هو موضح قبل 17. تم تأمين كابل الألياف البصرية التي توفر ضوء الليزر إلى مجهر إلى إطلاق الألياف مزودة حامل الألياف XY التي شنت على قمة السكك الحديدية ميكرومتر يحركها البصرية لتسوية Z (Thorlabs). لتحقيق TIRF الإضاءة، وتركز شعاع الليزر على طائرة الوصل الخلفي من الهدف باستخدام نظام اثنين من عدسات (L1 (collimating عدسة) وL2 (عدسة التركيز) في الشكل رقم 1)، حتى أن بموازى للعيان زير الشئون الخارجية للخروج من هذا الهدف. هذا يضمن أن كل أشعة الضوء القادمة من الهدف سيكون لها نفس الزاوية بالنسبة لطائرة عينة. يتم وضع غيض من الألياف البصرية في بؤرة العدسة collimating. عن طريق تحريك ميكرومتر على طول السكك الحديدية البصرية فيما يتعلق عدسة collimating (الاتجاه Z) فمن الممكن لضبط تركيز شعاع وتحريك شعاع في موقف X و Y باستخدام المقابض تعديل XY. نظرا لفتحة مرة أخرى صغيرة جدا من تحقيق الهدف × 150، وجدنا أنه من أجل تحقيق TIRF، حجم بقعة الليزر على طائرة الوصل يعود هناك حاجة إلى أن تكون صغيرة. لتحقيق التركيز اللازم لإنتاج بقعة صغيرة، وكانت عدسات البعد البؤري القصير الضرورية (كير نيومان، والاتصالات الشخصية)، وبالتالي كنا عدسة التركيز مع طول بؤري من ما يقرب من 108 مم التي تم وضعها في مكعب مزدوج اللون التي سبقت مباشرة الهدف. وضعت عدسة collimating أقرب إلى شاطر الحزمة التي أتت في منظمة الشفافية الدوليةRF الإضاءة. للتقليل من الآثار لوني غير مرغوب فيه، وكنا الحلل الوني (عدسة تصحيح لونيا التي أدلى بها عناصر التفجير 2 عدسة مصنوعة من مواد مختلفة من معاملات الانكسار) مع الطلاء antireflection لcollimating على حد سواء، والتركيز عدسات (JML الضوئية). يمكن التحقق من التركيز عن طريق التحقق من أن يخرج موازى شعاع من هدف عند وضعه في وسط فتحة الظهر وينبغي أن تشكل بقعة ضيقة في سقف الغرفة. ومن ثم انتقل لموقف بقعة تركز نحو حافة فتحة (في اتجاه Y) الذي يسبب شعاع للتجمع في صورة طائرة في زوايا واسعة، وفي نهاية المطاف، ويتحقق في زاوية حرجة للتفكير الداخلي الإجمالي. باستخدام هذه المكونات البصرية، وحققنا إيزاء في وقت واحد لجميع موجات 442 حتي 640 نيوتن متر عند محاذاة نفسه. محاذاة واحدة بصري، لذلك، سمح لنا لأداء TIRFM في وقت واحد عبر موجات متعددة.
  4. مزدوج كاميرا apparآتوس: تم تحقيقه في وقت واحد من اكتساب الانبعاثات في مضان مميزة نابعة من 2 fluorophores المختلفة من خلال بناء نظام الكاميرا المزدوجة الذي يقسم إلى انبعاث يتراوح الطول الموجي 2 من خلال استخدام المرايا مزدوج اللون (الشكل 2). وينعكس الضوء المنبعث من الهدف خارج الميناء الجانب الأيمن من المجهر. لأن معظم الأهداف هي اللانهاية تصحيح (مع الصور التي شكلت في ما لا نهاية)، لا بد من عدسة أنبوب إلى التركيز على الصورة. لمعالجة موجات الانبعاثات في نفس الوقت، تم إزالة العدسة أنبوب على المنفذ الجانب الأيمن. وعلقت محول مخصصة التي تحتوي على C-جبل المواضيع (سوتر الآلات) وربطها صاحب مرآة مزدوج اللون (إدموند البصريات). تم تركيب المرايا مزدوج اللون التي تفصل بين الانبعاثات GFP من أن من الأصباغ العضوية المستخدمة لتسمية TCR (Alexa546، Alexa647، الخ) في هذا حائز. وأعقب هذه الوحدة في كل من مسارات الضوء بواسطة أنبوب حامل العدسة، وهو حائز مرشح الانبعاثات وأنابيب التمديد. والعدسات أنبوب (TL1 وTL2 (الشكل 2)) يكون طول التنسيق من 180 ملم. تمت تغطية الثغرات في تمديد أنابيب مما أدى إلى كاميرات CCD EM مع ورقة سوداء لحماية الكاميرات من ضوء شارد. للسماح لمحاذاة القناتين، ووضعت الكاميرات على اثنين من المدرجات المخصصة ترجمة XYZ (منتجات Holmarc).

أدناه ونحن تصف كيفية محاذاة مجهر لتصوير القناة الثانية في وقت واحد. الخطوات المتبعة يتم التوفيق بين إضاءة TIRF، وتعديل قوة الليزر، ومواءمة انتاج الصور 2 باستخدام شبه قرار microbeads.

  1. قبل البدء، تعمل بالطاقة جميع مكونات المجهر في. وبعد ذلك بدأ جهاز الكمبيوتر والبرمجيات ويتم التأكد من أن يتم التعرف على جميع مكونات الجهاز من قبل البرنامج.
  2. لاستخدامها كمعيار شارك في الترجمة، وتمييع 1 ميكرولتر من قرار الفرعي (0.2 ميكرومتر) Fluoresbrite موضوع متعدد فلوري المجهرية إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 0.25 مل من microsphereتعليق على كل بئر من الثاني مختبر تيك 8-جيدا نظام ساترة حجرات (نونك). وضع نظام الشرائح غرفة على منصة فوق الهدف. ثم يتم إحضارها الخرز التي كثف على الزجاج في التركيز.
  3. باستخدام المحاذاة Y لإطلاق الألياف XYZ، يتم نقل موقف شعاع الليزر على مركز الفتحة الخلفية للهدف. من المهم أن تفعل ذلك عندما يكون الهدف من ذلك هو في موقف حيث ان الطائرة من الزجاج هو في التركيز. إذا لم يتم موازى للشعاع، يتم ضبط ميكرومتر Z لتحقيق إيزاء كامل. يتم اختبار إيزاء فردي لجميع خطوط الليزر التي ستستخدم في هذه التجربة. في هذه المرحلة، يتم قياس قوة الليزر لكل خط باستخدام السلطة متر الليزر ويتم تعديلها ل20-30 μW في كل قناة.

-T خلايا حساسة للغاية لأشعة الليزر، ويقتصر على إضاءة ما مجموعه 50 μW.

  1. يتم الحصول على الصور من الخرز باستخدام TIRF illuminatايون في وضع الحي. تحويل ميكرومتر Y-محاذاة على إطلاق الألياف بحيث شعاع يبدأ التحرك بعيدا من السقف حتى زاوية في ما يخص المناهج الهدف والمحور البصري 90 درجة. في نهاية المطاف، عندما يتم التوصل الى الزاوية الحرجة لالنقل البري الدولي، فإن ضوء الليزر لم يعد الخروج من هدف. ثم يتم الحكم من خلال التركيز TIRF محاذاة صعودا وهبوطا من خلال الطائرة من ساترة. إذا الخرز التي تطفو في حل قد يكون تصور، ثم إلى زيادة زاوية شعاع مع الاحترام لاحتياجات العادية هدف آخر. في محاذاة TIRF الصحيح، لن يؤدي إلا إلى طائرة واحدة بصري يكون في التركيز (على سبيل المثال، فقط حبات التي كثف إلى ساترة). ويمكن تنفيذ اختبار أدق من محاذاة TIRF عندما التصوير الخلايا التائية ملطخة صبغة السطحية التي انتشرت على سطح. (انظر النقطة 3.4).
  2. بعد تحقق TIRF الإضاءة، يمكن محاذاة القناتين فيما يتعلق بعضها البعض. التركيز على الخرز وقارن بين الموقف من أناأنتجت ملامح dentifiable في الصور في كلتا القناتين. باستخدام X و Y مسامير ميكرومتر على حامل الكاميرا واحد، جعل الوضع النسبي للالخرز في مثل مقربة قدر الإمكان. حفظ الصور من كلتا القناتين. وسيتم استخدام هذه الصور كمعيار شارك في التعريب لتحقيق المواءمة بين القناتين.
  3. الكاميرات أيضا بحاجة إلى أن تكون محاذاة بحيث تكون مستتب البؤرتين فيما يتعلق الآخر. ويتحقق هذا من خلال الحصول على مجموعة من الصور من الخرز شبه قرار أن يتم فصلها عن بعضها البعض في الاتجاه Z بواسطة 100 نانومتر. إذا كان الحد الأقصى لكثافة بكسل حبات يكمن في نفس الطائرة للكاميرات على حد سواء، ثم هم مستتب البؤرتين.

3. التصوير

مرة واحدة يتم تعيين ما يصل المجهر، فإن المهمة التالية هي إعداد الغرف التي تحتوي على طبقات ثنائية تدفق زجاج دهن يؤيد تقديم المستضد والتصاق جزيئات كما هو موضح سابقا (6) وبعد ذلك نفذ TIRFM من خلايا تي transfected التفاعل معالركيزة. وأعقب على طبقة ثنائية نشرت بروتوكول 5-6 كما نشرت إلا أنه لم يتم تحضين على الليبوزومات لمدة 20 دقيقة على ساترة بعد أن تم تجميعها في غرفة تدفق. بدلا من ذلك، وتدفقت HBS-BSA عازلة في خلية تدفق على الفور بعد التجميع.

  1. تجميع غرفة تدفق مع طبقات ثنائية الدهون مستو شكلت على الزجاج زلة غطاء تحتوي على النيكل وNTA الدهون. جزيئات الالتصاق، وتدمج ICAM-1 (100 جزيئات / ميكرون 2)، والمجمعات الببتيد، MHC، MCC تحميل IE ك (الجزيئات 5-10 / ميكرون 2)، في طبقة ثنائية خاصة به الحامض الاميني بهم. يضاف costimulatory جزيء CD80 باستخدام مرساة GPI (100 جزيئات / ميكرون 2).
  2. وضع خلية تدفق على مسرح المجهر والاستقرار فيه. ترفق الشركة المصنعة زودت تسخين عنصر في خلية تدفق للسيطرة على درجة حرارته. وضع هدف على طبقة ثنائية وتقريب وطائرة طبقة ثنائية في التركيز. تمكين التدفئة للهدف وتدفق للخلية لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة الغرفة عند 37 درجة مئوية.
  3. الخلايا التائية Transfected هي مكعبات بعد 4 ساعات من حضانة بسرعة 80x ز وإعادة علقت في HBS-BSA العازلة وتستكمل مع 10 ميكروغرام / مل من H57 فاب أو 20 ميكروغرام / مل من H57 واحد سلسلة جزء متغير (scFv) إلى تسمية TCR. ثم يتم حقن الخلايا في تدفق الخلايا. ويتم التصوير في وجود مستمر لفاب أو scFv بسبب ارتفاع مستمر من التفكك. وجودها في المتوسط ​​لا تزيد كثيرا على خلفية كحقل TIRF رقيقة جدا.
  4. وترد شروط التصوير حتى أن اكتساب قناة مزدوجة حية تظهر المعاينة المباشرة للقنوات TCR وGFP التي تساعد في البحث عن خلايا transfected. ويؤكد TIRF الإضاءة من خلال التركيز تصل الطائرة زجاج للكشف عن أي تلطيخ غشاء الجانبي. إذا الأغشية الجانبية لا تأتي في التركيز ثم محاذاة TIRF جيدة. يتم تصوير الخلايا Transfected ثم مرة واحدة أو في صورة تسلسل لإنتاج VIDEOS.

4. ومعالجة الصور وتحليل البيانات

البرنامج إخراج الصور من اثنين من كاميرات في إطار واحد. إخراج كل الكاميرا هي 512 × 512 بكسل، وبالتالي، فإن الناتج صورة 1024 × 512 بكسل في الحجم. الصور التي تحتاج أولا إلى أن تنقسم إلى الإطارات الفردية المقابلة لاثنين من كاميرات. هذه الصور من دون قرار من الخرز القنوات هما متراكبة، ونحن مصممون المعلمات المحاذاة. وثمة سمة محددة لنظامنا هو تناوب درجة 1 من قناة واحدة فيما يتعلق أخرى (انظر الشكل 3). المصدر الأكثر احتمالا لهذا التناوب هو مواقف الكاميرا. بعد هذه التحولات التناوب خطي مزيد من النسبية في X و Y تحتاج إلى القيام بها لمحاذاة تماما حبات مع الاحترام لبعضهما البعض. ويتم الحصول على الصور من الخرز في كل تجربة لتحديد معايير دقيقة لتحقيق المواءمة بين القناتين. بعد ذلك يتم تطبيق هذه التحولات الخطية والتناوب على جميعصور ومن ثم فإنها تخضع للتقسيم وتحليل الخوارزميات شارك في التعريب.

5. ممثل النتائج

ويمكن تكييف النظام الموصوف هنا لدراسة مجرى النهر مما يشير إلى أي مستقبلات في غشاء البلازما. فإنه من المفيد بشكل خاص في دراسة TCR إشارات بسبب إشارات يحدث في مجموعات حل بصريا ودعا TCR microclusters أو في الإندوسومات كما هو موضح في الآونة الأخيرة 18. إذا وقعت في اشارة شبه قرار مجموعات من المستقبلات أو في الأمم المتحدة عنقودية المستقبلات ومزيد من التجارب التي ينبغي القيام به لتفسير البيانات. كما ذكر من قبل، والسلاسل CD3 للمجمع TCR الخضوع الفسفرة بواسطة كيناز عائلة SRC LCK على إشراك TCR بواسطة الببتيد-MHC المجمعات. سلسلة CD3ζ فسفرته تجند ثم كيناز عائلة SYK Zap70. تصور تجنيد زاP70 تقارير وبالتالي عن حالة الفسفرة من سلسلة CD3ζ. ويمكن تغيير قوة التحفيز TCR باستخدام الببتيدات تحور في بقايا الاتصال TCR. وتسمى هذه الببتيدات يغاندس الببتيد تغيير للأفراد. ويرد تجربة ممثل في الشكل (4) حيث تجند الببتيدات ناهض بقوة Zap70 إلى microclusters TCR في حين انخفضت قدرة الببتيد T102L يفشل في تجنيد Zap70 إلى microclusters TCR، مما يدل على أن لا يتم فسفرته سلسلة CD3ζ في هذه القضية. يمكننا استخلاص هذه النتيجة لأنه كان علينا أن نلاحظ فقط تجنيد Zap70 إلى مجموعات TCR التي تم الكشف عنها بسهولة من قبل TIRFM. تم استخدام خوارزمية تقسيم الآلي لحساب عدد من Zap70 microclusters لكل خلية. يظهر أيضا في فيلم التكميلية هو التصوير في وقت واحد من TCR وZap70 مضان المرتبطة بها. لاحظ الطبيعة الديناميكية لlamelipodium.

الشكل 1 <ر /> الشكل 1. صورة والتخطيطي لإطلاق TIRF المخصصة. لوحة ويظهر صورة لإطلاق TIRF وتثبيتها على المجهر، والفريق (ب) هو التخطيطي لإطلاق TIRF مما يدل على مسار الضوء. التخطيطي والصور التي تبين موقف للعدسة الجمع، وشاطر الحزمة، وإطلاق الألياف مع X، Y Z والتسويات، وL1 عدسة collimating، وتركيز عدسة L2 المثبتة في المكعب مزدوج اللون والهدف TIRF. وأقحم يظهر عدسة التركيز المثبتة في المكعب مزدوج اللون.

الشكل 2
الشكل 2. صورة والتخطيطي لنظام كاميرا 2. لوحة ويظهر صورة لنظام الكاميرا اثنين كما تعلق على المجهر، والفريق (ب) هو التخطيطي لنفسه. التخطيطي وتظهر صورة لموقف موضوعي، مرآة، مزدوج اللون، أنبوب العدسات TL1 وtl2، الانبعاثات المرشحات F1 و F2، اثنين من كاميرات C1 و C2 في تيولي العهد يقف مع كل منهما X، Y Z والتسويات.

الشكل (3)
الشكل 3. استخدم من دون قرار الخرز لتحقيق المواءمة بين القناتين. لوحات المعرض ألف وباء من تراكب شبه الخرز قبل قرار (A لوحة) وبعد (لوحة ب) المحاذاة. وتبين أن لوحة واحدة من القنوات هو تناوب فيما يتعلق من جهة أخرى. لوحات جيم ودال هي قسم فرعي من الصور في ألف وباء لوحة E يظهر تراكب القناة الثانية صورة من الخلايا دون معالجة. وطبقت معايير المواءمة المستخدمة في مد لوحة لصورة تظهر في لوحة لاحظ F. كيفية محاذاة تماما lamelipodium من القناتين في F لوحة وليس في لوحة مقياس ميكرومتر E. 4 بار لوحات للجميع.

الشكل 4
الشكل 4. Zap70 التوظيف لTCR microclusters ردا على الألغام المضادة للأفراد مختلفة. في المختبر المنشط وT تم تحميل transfected الخلايا مع ترميز البلازميد Zap70 تنصهر إلى GFP وحضنت على طبقات ثنائية زجاج ني NTA المدعومة التي تحتوي على جزيئات 6 / ميكرون 2 من الببتيد صاحب الموسومة-IE ك، و 100 جزيئات / ميكرون 2 من Alexa647 صاحب الموسومة مترافق ICAM- 1 و 100 جزيئات / ميكرون 2 من GPI-الراسية CD80. يشار إلى أن الببتيدات التي تم تحميلها في أقحم. ICAM-1 يشير إلى الخلايا في طبقات ثنائية الجزيئات التي تحتوي على 100 ​​/ ميكرون 2 من اليكسا-647 مترافق صاحب الموسومة ICAM-1. تم تنفيذ قناة في وقت واحد مزدوج المجهري TIRF الاستحواذ في استمرار وجود Alexa546 مترافق جزء فاب H57 (غير تسد) إلى وصمة عار في TCR. تم تصوير الخلايا يصل إلى ساعة واحدة بعد الاتصال الأولي مع طبقة ثنائية. وقد تم تحليل عدد من Zap70 مجموعات في كل خلية باستخدام الفرز الآلي كتلة البرمجيات. وقد تم تحليل ما لا يقل عن 40 زنزانة في كل حالة على حدة. مقياس شريط 2 ميكرومتر لجميع الصور.

92/3892fig5.jpg "/>
الشكل 5. محاذاة للنظام كاميرا 2 باستخدام نوعين مختلفين من الكاميرات. هذه اللوحة يظهر تراكب الانحياز من دون قرار الخرز تصويرها باستخدام نظام كاميرا 2 حيث اثنين من كاميرات ذات أحجام مختلفة بكسل (الأخضر: 6.45 ميكرون حجم بيكسل تصوير في binning 2X2 والأحمر: بكسل حجم 16 ميكرومتر في تصوير أي binning). أقحم يبين وجهة النظر تضخيم من مربع مربع في وسط الميدان. مقياس شريط 5 ميكرون.

فيلم التكميلية. Zap70 التوظيف لmicroclusters TCR ردا على الببتيد ناهض. تم تحميل transfected في المختبر المنشط والخلايا التائية مع ترميز البلازميد Zap70 تنصهر إلى GFP وحضنت على طبقات ثنائية زجاج ني NTA المدعومة التي تحتوي على جزيئات 6 / ميكرون 2 من الببتيد صاحب الموسومة-IE ك، و 100 جزيئات / ميكرون 2 من Alexa647 مترافق، صاحب الموسومة ICAM-1 و 100 جزيئات / ميكرون 2 من GPI-الراسية CD80. مزدوجة القناة في وقت واحد 1تم تنفيذ cquisition TIRF المجهري في استمرار وجود Alexa546 مترافق جزء فاب H57 (غير تسد) إلى وصمة عار في TCR. تم تصوير مرارا حقل من الخلايا transfected 40 مرة مع قرار وقت من 10 ثانية لكل إطار. مقياس شريط 2 ميكرومتر. انقر هنا لعرض فيلم التكميلية .

Discussion

نحن هنا وصف نظام لدراسة الإشارات في مستضد محدد أساسي خلايا تي فأر باستخدام TIRFM وطبقات ثنائية زجاج الدهون كما دعمت ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعي. هذا الاسلوب يعتمد على التعبير عن البروتينات بنجاح GFP المفتاحية في هذه الخلايا. Transfecting الخلايا التائية هي دائما مهمة صعبة. عادة، يتم استخدام electroporation أو الجينات تسليم باستخدام الفيروسات أو lentiviruses. أسلوب واحد ليست متفوقة على الآخر، وكلاهما يكون لها حدود ومزاياها. نجد أن electroporation والمزايا التالية: 1) لا يشترط أن يتم تقسيم خلايا نشطة كما هو مطلوب من أجل الفيروسات ولكن ليس lentiviruses، و 2) يمكن التحكم في مستوى التعبير من خلال تغيير وقت يتم تحضين الخلايا قبل التصوير. والعائق الاكبر هو أننا نجد صعوبة بالغة في التعبير عن البروتينات التي تكون كبيرة في الحجم في خلايا أولية. لقد قدمنا ​​الأسلوب الذي يعطينا جيد جدا بقاء الخلية بعد electroporation. ونتيجة لذلك فمن applicabجنيه إلى استخدامه لتحقيق إسكات الجينات بوساطة سيرنا.

وصفنا أيضا هنا مخصصة 2 قناة TIRF اكتساب المجهر في وقت واحد الذي تم تصحيحه لونيا ولا يتطلب المواءمة منفصلة لأطوال موجية مختلفة. هذه القدرات، ومع ذلك، متوفرة تجاريا. ويستند نظامنا على مبادئ الفحص المجهري TIRF نشرت من قبل خبراء في الميدان، وأرخص من البدائل التجارية. واحد من انتقاد ممكن تصميم لدينا هو اننا نستخدم نفس الزاوية من حدوث موجات لإثارة مختلف. هذا من شأنه أن يؤدي إلى عمق تغلغل مختلف TIRF لإثارة موجات مختلفة. ونحن نعتقد أن هذه الآثار هي صغيرة لأن موجة زائل هو حقل تدهور بشكل كبير وعمق الميدان TIRF هي وظيفة خطية من الطول الموجي. وسوف Fluorophores على مقربة من سطح الزجاج تجربة لا فرق في شدة الليزر بين موجات اثنين. لfluorophores بالقرب من البولي ايثيلينعمق netration، فإن اختلاف كثافة يقدر بحوالي 1.3 أضعاف لموجات 2 488 و 640 نانومتر، وأضعاف 1.15 لموجات 2 488 و 561 نانومتر. ويمكن استخدام نفس النظام جنبا إلى جنب مع تقنيات فائقة أن قرار الاستفادة من الإضاءة TIRF.

وقد وصفت نحن أيضا نظام كاميرا 2 التي بنيت العرف. مثل نظام TIRF، أجهزة مماثلة كما تتوفر تجاريا. نظامنا يوفر مرونة لتغيير الفلاتر وdichroics، مما يتيح استخدامه مع مجموعات مختلفة من الموجات. العيب في نظامنا هو درجة واحدة من دوران اللازمة لتحقيق المواءمة بين الصورتين. يمكن حل هذه المشكلة باستخدام كاميرا المدرجات التي يقودها بيزو وتقدم درجة التناوب المحاذاة. لدينا أيضا بنجاح تنفيذ نظام الكاميرا اثنين على هذا المجهر، الذي الكاميرات مختلفة ولها أحجام مختلفة بكسل. ومن شأن مثل هذا النظام أن يكون مفيدا إذا كان أحد يحتاج الأمر إلى حساسية في قناة واحدة ودى كبيرمجموعة namic في بلد آخر، وكلاهما نادرا ما تتوفر في نفس الكاميرا. استخدمنا HQ-2 Photometrics كاميرا في binning 2X2 تعطينا حجم بكسل فعالة من 12.9 ميكرون مع الكاميرا كوانت-EM Photometrics التي لديها حجم بكسل من 16 ميكرون. تم استخدام أنبوب 180 مم البعد البؤري للعدسة EM-كوانت وتم استخدام أنبوب 145 ملم طول بؤري عدسة للكاميرا HQ-2. تمت السيطرة على HQ-2 باستخدام Metamorph البرمجيات وتمت السيطرة كوانت-EM عبر الصغرى مدير البرنامج على جهاز كمبيوتر مستقل في وضع الزناد الخارجية. وقدمت على الزناد خارجي الى الكاميرا كوانت-EM باستخدام الإخراج الرقمي من لجنة المساعدة الإنمائية مجلس قياس والحوسبة، والذي تم تنفيذه باعتباره مصراع إضافية في إعدادات الإضاءة من تكوين Metamorph. نسبة أطوال البؤرية من العدسات أنبوب يطابق نسبة من أحجام بكسل فعالة. ويرد محاذاة ممثل في الشكل 5.

Disclosures

تمت المحافظة على جميع الحيوانات المستخدمة في هذه التجارب في بيئة خالية من العوامل المسببة للأمراض محددة، وتمت الموافقة على هذه التجارب من قبل المعاهد الوطنية للصحة ورعاية الحيوان لجنة الاستخدام.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل شعبة البحوث ضمن الجدران من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعاهد الوطنية للصحة. ونحن ممتنون لHuppa يوهانس ومارك ديفيس لتزويدنا scFv من H57 المستخدمة في هذه الدراسات. وأود أن أشكر RV كير نيومان للمناقشة مفيدة خلال تطوير هذه التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells Lonza Inc. VPA-1006
PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit Life Technologies K2100-05 For endotoxin free DNA preps
Amaxa Nucleofector Device Lonza Inc. AAD-1001
Recombinant Murine IL-2 PeproTech Inc 212-12
Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm Polysciences, Inc. 24050-5
Lab-Tek II 8-well chambered coverglass Thermo Fisher Scientific, Inc. 155409

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function. Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).
  2. Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S.T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).
  3. Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways. Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).
  4. Fraser, I. D., Germain, R. N. Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells. Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).
  5. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).
  6. Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
  7. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
  8. Yokosuka, T. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).
  9. Huppa, J. B. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
  10. Tolar, P., Pierce, S. K. A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).
  11. Treanor, B. The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor. Immunity. 32, 187-199 (2010).
  12. Treanor, B., Batista, F. D. Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling. Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).
  13. Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses. Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).
  14. Purbhoo, M. A. Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse. Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).
  15. Lasserre, R. Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse. EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).
  16. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  17. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  18. Williamson, D. J. Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events. Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).
تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins. J. Vis. Exp. (61), e3892, doi:10.3791/3892 (2012).More

Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins. J. Vis. Exp. (61), e3892, doi:10.3791/3892 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter