Summary
המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.
Abstract
איתות הוא יזם באמצעות קולטן תא T (TCR) כאשר היא עוסקת באמצעות פפטיד אנטיגני שברי מחויב קומפלקס Histocompatibility רס"ן (pMHC) חלבונים לידי ביטוי על פני השטח של תאים מציגי אנטיגן (נגמ"שים). הקומפלקס TCR מורכב heterodimer TCRαβ מחייב ליגנד המשייך לא קוולנטית עם CD3 הדימרים (את εδ ו εγ heterodimers ו ζζ homodimer) 1. על האירוסין של הקולטן, שרשראות ζ CD3 הם פוספורילציה ע"י קינאז Src המשפחה, Lck. זה מוביל לגיוס של קינאז המשפחה Syk, Zap70, אשר פוספורילציה אז מופעל על ידי Lck. לאחר מכן, Zap70 phosphorylates חלבונים מתאם LAT ו SLP76, שיזם את הקמת מתחם איתות הפרוקסימלי המכיל מספר רב של מולקולות איתות שונות 2.
היווצרות של זה בסופו של דבר התוצאות מורכבות בסידן ראס תלוי traגורם nscription הפעלה חניכה הסוגר של הסדרה מורכבת הביטוי תוכניות גנים שיוצרים בידול תא T 2. אותות (TCR לבין המדינה כתוצאה של בידול) הם מווסתת על ידי גורמים רבים אחרים, כולל עוצמה אנטיגן ו crosstalk עם co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, ואת קולטני ציטוקינים 3-4. לימוד הארגון במרחב ובזמן של המתחם איתות הפרוקסימלי בתנאי גירוי שונים היא, אם כן, המפתח להבנת מסלול איתות TCR כמו גם רגולציה על ידי במעברי האותות אחרים.
מערכת אחת מודל שימושי מאוד ללמוד איתות ביוזמת TCR על הממברנה בתאי ה-T הוא הנתמכות זכוכית השומנים bilayers, כפי שתואר קודם לכן 5-6. הם יכולים להיות מנוצל כדי להציג pMHC אנטיגני קומפלקסים, הדבקה, ושיתוף גירוי מולקולות בתאי T-משמש נגמ"שים מלאכותיים. על ידי הדמיה של תאים T אינטראקציה עםbilayer השומנים באמצעות הקרינה הכוללת פנימית השתקפות מיקרוסקופ (TIRFM), נוכל להגביל את עירור עד למרחק של 100 מייל ימי של שטח בין זכוכית לבין שטח פני התא 7-8. זה מאפשר לנו תמונה בעיקר את האירועים המתרחשים איתות קרום הפלזמה. כפי שאנו מעוניינים הדמיה לגיוס של איתות חלבונים מורכבים TCR, אנו מתארים מערכת של שתי המצלמה TIRF הדמיה שבה TCR, הנקרא Fab עם ניאון (אנטיגן שבר מחייב) שברי נוגדנים H57 (מטוהרים מן hybridoma H57-597 , ATCC, מספר ATCC: HB-218) שהוא ספציפי עבור TCRβ, ו איתות חלבונים, מתויג עם GFP, ניתן צילמו בו זמנית ובזמן אמת. אסטרטגיה זו הכרחית בשל האופי הדינמי ביותר של שני תאים T ו האירועים איתות שמתרחשים ב TCR. שיטת הדמיה זו אפשרה לחוקרים ligands תמונה יחידה 9-11, כמו גם גיוס של מולקולות איתות לקולטנים מופעלהיא מערכת מצוינת ללמוד ביוכימיה באתרו 12-16.
Protocol
נוהל ניסיוני:
1. Transfection באמצעות Amaxa עכבר T Cell Nucleofector Kit
המתואר כאן transfection של תאים משני נאיבי או חוץ גופית העיקריים המופעלים T עם פלסמידים ביטוי המקודדים מולקולות איתות מתוייגים על ידי ה-GFP, באמצעות העכבר Amaxa T ערכת Nucleofector Cell. חוץ גופית ההפעלה של תאים T באמצעות פפטידים טעונים נגמ"שים הטחול מבוצעת כפי שתואר קודם לכן 7. כל ותאי T השתמשו במחקרים שלנו לבטא ו TCR המכירה MCC פפטיד (88-103) חייב מולקולת MHC-IE k. Transfection מתבצע בעיקר על פי המלצות היצרן, עם זאת, אנו מציגים כמה טיפים לקידום יכולת הקיום של תאים T לאחר transfection. הן כדאיות ויעילות transfection הוא גבוה הרבה יותר ב-תאים במבחנה הופעל טי מאשר תאים תמימים.
- לפני שמתחילים, להכין 2 מ"ל של מדיום בתוספת תא T על ידי הוספת 20 μL שלשני הרכיבים בינוני A ו-B ו 100 μL של בסרום שור עוברית (5%) עבור כל transfection שיש לבצע. לאזן את המדיום בצלחת 12 גם ב 37 humidified מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה לפחות. לחלופין, aliquots של המדיום השלימו עם סרום 5% ורכיב עשוי להיות מוכן ומאוחסן קפוא. אם זה המקרה, להפשיר את המספר הדרוש של aliquots, להוסיף רכיב ב ', ולבצע איזון.
- Pre-איזון של המדיום הוא חשוב מאוד, כמו מוות של תאים תגרום מן ההשעיה מחדש של תאים לאחר transfection במדיום זה קרה או יש pH מלבד 7.2.
- לאחר מכן, להכין את התערובת transfection. שלב 82 μL הפתרון עכבר T Nucleofector נייד עם μL 18 של מוסף 2 ו 5μg של ה-DNA פלסמיד (לא ריכוז נמוך מ -0.5 מיקרוגרם / μl). מערבבים היטב על ידי הקשה על צינור או עם שימוש של מיקרו פיפטה.
-חשוב לבצע טיטרציה של המינון פלסמיד עבור מספר קבוע של תאים עבור כל מבנה שישמש transfection. כמה מבנים גדולים יותר, ה-DNA יותר על פי הצורך. ה-DNA צריך להיות חופשי של אנדוטוקסינים.
- העברת 5 עד 10 מיליון תאים לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל. סרכזת בסל"ד 600 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר גם של supernatant ככל האפשר עם aspirator ואקום.
- היצרנים ממליצים ספינינג התאים פחות מ 90x גרם, במקרה שלנו, מהירות זו תואמת את 75x גרם. כוח צנטריפוגלי נבחר יחסית (RCF) להשיג תא גלולה היא אולי המשתנה החשוב ביותר, כמו צנטריפוגה ב RCF נמוך מונע נזק קרום התא.
- שוב להשעות את התא גלולה בתערובת transfection ידי בעדינות ולאט לאט pipeting תא גלולה עד שאין גושים גדולים של התאים הנותרים. זה בדרך כלל ניתן להשיג על ידי לחלוטין aspirating התאים לאדרך עינית עצה פיפטה יותר מ 3-4 פעמים לא.
- בעזרת פיפטה, בזהירות להעביר את ההשעיה תוך Amaxa מוסמך קובט, להבטיח כי אין בועות בהווה. שווי קובט.
- בחר תוכנית Nucleofector X-001 במכשיר Nucleofector. הכנס את קובט לתוך מחזיק קובט Nucleofector וליישם את התוכנית שנבחרה.
- לאחר electroporating התאים, עדיף מיד להעביר אותם עד בינוני מראש equilibrated התרבות. היצרנים ממליצים התאים להיות כל הזמן למדיום nucleofector לא יותר מ -15 דקות.
- להביא את קובט ו מראש equilibrated, בינוני התרבות מלא בתוספת מכסה המנוע. בעזרת פיפטה פלסטיק בתנאי, להוסיף כ 500 μL של המדיום כדי קובט ולהעביר את ההשעיה התא עד בינוני לירידה צלחת אחר טיפה.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני הדמיה. התאים הנאיביים הם incubatאד ב 30 ° C במקום 37 ° C. זה עוזר לשמור על תגובתיות שלהם אנטיגן.
- שלוש עד ארבע שעות של דגירה מספיקים בדרך כלל בתאי T כדי במובחן לבטא את ה-GFP החלבונים המתויגים. בחרנו תאים התמונה בנקודה זו בזמן, כי רמת הביטוי הוא נמוך חפצים של ביטוי מעל צריך להיות ממוזער. אם יתר ביטוי של חלבון מסוים הוא הרצוי, לעומת זאת, בתאי T יש להסיר בינוני Amaxa לאחר 4 שעות. מטרה זו מושגת על ידי pelletting שוב את התאים ב RCF נמוך resuspending שלפני equilibrated בינוני תא T התרבות השלימו עם 50 U / mL של אינטרלויקין -2 (IL-2) בצפיפות של 2 מיליון תאים למ"ל.
2. TIRF מיקרוסקופית
תיאור של המיקרוסקופ TIRF:
- כללי תצורה: רכיבים אופטיים נבנו סביב מיקרוסקופ פלואורסצנטי אולימפוס IX71 כי היה מצויד במקור עם מודול אולימפוס TIRF. אנחנו די בקרובההשפעות כרומטית scovered במודול זה כאשר המדינה יישור אחת לא השיג collimation החופף על קווי לייזר של אורכי גל שונים. מודול זה, אם כן, לא לאפשר הדמיה TIRF בו זמנית באמצעות עירור באורכי גל שונים, יצאנו לבנות מנגנון מותאם אישית TIRF שימזער השפעות כרומטית במערכת, כפי שנדון בהרחבה בסעיפים הבאים. השיטה המתוארת כאן פותחה עבור ההגדלה 150 X, 1.45 צמצם המספרי (NA) TIRFM אובייקטיבי (אולימפוס), אבל עובד בדיוק כמו גם על הגדלה X 60, 1.45 גרסאות NA. תאורה בתחום רחב, המיקרוסקופ מחובר מקור אור הליד מתכת למבדה ו-XL מסנן עירור הגלגל (מכשירים סאטר) מצויד עם מסנני עירור. על מיקום אוטומטי של שלב המדגם ביחס אובייקטיבי, מיקרוסקופ המצויד תרגום ממונע XY, piezo שבשליטת Z הבמה (אסי). תמונות נלכדים באמצעות 2 Qu זההantEM אלקטרונים המתרבים (EM) CCD מצלמות (Photometrics). גודל פיקסל של המצלמות האלה תואם היטב עם ההגדלה המוצעים על ידי המטרה TIRF 150 X, מתן החלטה סופית של 0.1 מיקרומטר לפיקסל. המצלמות EMCCD מציעים גם את הרגישות לדמיין transfectants GFP בעלי רמת ביטוי נמוכה.
- לייזרים: עבור TIRF תאורה, מערכת של 5 לייזרים אספקת סך של 6 קווי לייזר (ננומטר 405, 440, 488, 514, 561 ו - 640) הוא יחד לתוך סיב מצב יחיד (טכנולוגיות Solamere). לייזר ארגון ו 561 ננומטר דיודה שאוב מצב מוצק (DPSS) לייזר (קווים 488, 514 ו 561) מנותבות דרך סיב אופטי acousto מתכונן (AOTF) עבור עוצמת בעוד עוצמת לייזר דיודה (405, 440 ו 640 ננומטר) נשלטת על ידי המתח ויסות של אספקת החשמל שלהם. מתח על AOTF ואת ספקי כוח של לייזר דיודה נשלטת באמצעות כרטיס רכישת נתונים (DAC) הלוח (מדידה מחשוב), תוך שימוש MetaMorph תוכנה (MolecuLAR התקנים). יעילות צימוד עבור לייזרים דיודה הוא 30% בעוד אלה של לייזר ארגון ו DPSS הם כ 60% בשל בקטרים קטנים שלהם הקורה.
- TIRF מודול: על מנת התמונה בו זמנית TCR לבין מולקולות איתות הכרוכים בה, כפי שתואר קודם לכן, היה זה חיוני יש תאורה TIRF כי תוקנה chromatically וכי לא יהיה צורך ההתכנסות או refocusing בעת רכישת פליטת הקרינה של אורכי גל שונים. TIRFM הושג באמצעות באמצעות ה-אובייקטיבי תאורה, כפי שתואר קודם לכן 17. כבל סיב אופטי המעביר אור לייזר מיקרוסקופ היה מאובטח על השקת סיבים מצויד בעל סיבים XY רכוב על גבי המעקה מיקרומטר מונחה אופטי Z הסתגלות (Thorlabs). כדי להשיג TIRF תאורה, קרן לייזר ממוקדת על המטוס מוקד האחורי של המטרה באמצעות מערכת של שתי עדשות (L1 (collimating העדשה) ו-L2 (עדשה תוך התמקדות) באיור 1), כך ב 'EAM collimated מגיחה מתוך מטרה. הדבר מבטיח כי כל קרני האור יוצא המטרה תהיה זווית זהה לגבי מטוס מדגם. קצה של סיבים אופטיים ממוקם במוקד של העדשה collimating. על ידי העברת מיקרומטר לאורך המעקה אופטי לגבי העדשה collimating (בכיוון Z) ניתן לכוון את המיקוד של הקרן ולהעביר את קרן בתפקיד X ו-Y באמצעות כפתורים התאמה XY. בשל זמן חזרה קטנה מאוד של המטרה x 150, מצאנו כי על מנת להשיג TIRF, גודל נקודה לייזר המטוס מוקד חזרה צריך להיות קטן. כדי להשיג את המיקוד הדרוש כדי לייצר נקודה קטנה, עדשות בעלות אורך מוקד קצר היו נחוצים (קיאר נוימן, תקשורת אישית), ולכן, השתמשנו עדשה תוך התמקדות עם אורך מוקד של 108 מ"מ כ שהונח קוביית dichroic ישירות הקודמת המטרה. העדשה collimating הוצב קרוב יותר מפצל קרן שהביא ב TIRF תאורה. כדי למזער תופעות לא רצויות כרומטית, השתמשנו כפילויות achromatic (העדשה לתקן chromatically שנעשו על ידי שני מרכיבים עדשות פיוזינג מחומרים של מדדי השבירה שונים) עם ציפוי antireflection הן collimating ומיקוד עדשות JML (אופטי). המוקד ניתן לאמת על ידי סימון כי קרן collimated מגיחה מתוך מטרה כשהוא מוצב במרכז צמצם לאחור צריך להקים במקום חזק על תקרת החדר. המיקום של נקודה ממוקד מכן מועבר אל קצה הצמצם (בכיוון Y) אשר גורם קרן להתכנס במטוס התמונה בזוויות גדולות, ובסופו של דבר, את זווית קריטית השתקפות פנימית מוחלטת מושגת. באמצעות אלה רכיבים אופטיים, השגנו collimation סימולטני לכל אורכי גל מ 442 עד 640 ננומטר על יישור אותו דבר. יישור אופטי יחיד, אם כן, אפשרה לנו לבצע TIRFM בו זמנית על פני מספר רב של אורכי גל.
- מצלמה Dual apparatus: רכישת סימולטני של פליטת הקרינה ברורים הנובעים שני fluorophores שונים הושגה על ידי בניית מערכת המצלמה כפולה אשר מפצל את פליטת לשני טווחי אורך גל באמצעות מראות dichroic (איור 2). האור הנפלט מן המטרה משתקפת מתוך הנמל את הצד הימני של המיקרוסקופ. כמו רוב היעדים הם אינסוף תיקן (עם תמונות נוצרו אינסוף), העדשה צינור נדרש למקד את התמונה. כדי לתפעל שני אורכי גל הפליטה בעת ובעונה אחת, העדשה צינור ביציאה צד ימין הוסר. מתאם מותאם אישית המכיל C-mount האשכולות (סאטר מכשירים) היה קשור ומקושר לבעל מראה dichroic (אדמונד אופטיקה). מראות Dichroic המפרידים את פליטת ה-GFP מזו של צבעים אורגניים המשמשים לתייג TCR (Alexa546, Alexa647 וכו ') הותקנו נושא זה. מודול זאת בעקבות בשני נתיבים אור על ידי בעל צינור העדשה, בעל מסנן פליטה צינורות הארכה.עדשות צינור (TL1 ו TL2 (איור 2)) יש אורך מוקד של 180 מ"מ. פערים צינורות הארכה המובילות מצלמות CCD מהם היו מכוסים בנייר שחור להגן על המצלמות של אור תועה. כדי לאפשר יישור של שני ערוצים, המצלמות היו רכוב על שתי עמדות מותאמות אישית XYZ תרגום (מוצרים Holmarc).
להלן נתאר כיצד ליישר את המיקרוסקופ הדמיה 2 ערוצים בו זמנית. השלבים הכרוכים הם יישור TIRF תאורה, התאמת כוח לייזר, והתאמת שתי תמונות באמצעות פלט ברזולוציה משנה microbeads.
- לפני שמתחילים, כל הרכיבים של מיקרוסקופ הם מופעל על. המחשב ותוכנות מופעלים אז הוא הבטיח כי כל רכיבי החומרה מוכרים על ידי התוכנה.
- לשימוש כסטנדרט שיתוף לוקליזציה, לדלל 1 μL של משנה רזולוציה (0.2 מיקרומטר) Fluoresbrite רב ניאון microspheres אל מ"ל 2 של PBS ולהוסיף 0.25 מ"ל של microsphereההשעיה היטב כל אחד ב Lab-8-Tek גם מחולק לתאים במערכת coverglass (Nunc). מניחים את מערכת שקופיות קאמרית אל הרציף מעל המטרה. חרוזים כי הם ספוחים לסחף נחלי לכוס מובאים אז אל המוקד.
- באמצעות יישור Y ההשקה סיבים XYZ, המיקום של קרן לייזר הוא עבר למרכז צמצם את החלק האחורי של המטרה. חשוב לעשות זאת כאשר המטרה היא במצב שבו המטוס זכוכית היא בפוקוס. אם הקרן לא collimated, מיקרומטר Z מותאם להשיג collimation מלא. Collimation נבדק באופן פרטני עבור כל קווי לייזר על מנת להשתמש בהם בניסוי. בשלב זה, כוח לייזר עבור כל שורה נמדד באמצעות מד הכוח לייזר מותאם μW 20-30 על כל ערוץ.
-T תאים רגישים במיוחד לקרינה לייזר, תאורה מוגבלת לסך של 50 μW.
- תמונות של החרוזים נרכשים באמצעות TIRF illuminatיון במצב חי. הפעל מיקרומטר Y-יישור בהפעלה סיבים כך הקורה מתחיל מתרחק מן התקרה עד הזווית שלו ביחס גישות אופטיות של אובייקטיביות ציר 90 מעלות. בסופו של דבר, כאשר זווית קריטית TIR הוא הגיע, אור הלייזר כבר לא לצאת אובייקטיבי. יישור TIRF נשפטת לאחר מכן על ידי התמקדות מעלה ומטה באמצעות מטוס של coverglass. אם חרוזים כי הם צפים הפתרון יכול להיות חזותי, ואז זווית הקורה בכל הנוגע לצרכים רגילים אובייקטיביים יש להגדיל עוד יותר. על יישור TIRF נכונה, רק מטוס אחד אופטי יהיה בפוקוס (כלומר, רק את החרוזים, כי הם ספוחים לסחף נחלי כדי coverslip). המבחן מדויק יותר של יישור TIRF יכול להיות מיושם כאשר הדמיה ותאי T מוכתמות צבע משטח התפשטו על פני השטח. (ראה נקודה 3.4).
- לאחר ההארה TIRF הושגה, שני הערוצים עשוי להיות מתואם עם כבוד אחד לשני. דגש על החרוזים ולהשוות את מיקום אניתכונות dentifiable בתמונות מיוצר בשני הערוצים. באמצעות X ו-Y ברגים מיקרומטר על דוכן מצלמה אחת, להביא את המיקום היחסי של החרוזים לתוך כמו בסמיכות ככל האפשר. שמור את תמונות שני הערוצים. תמונות אלו ישמשו כסטנדרט שיתוף לוקליזציה כדי ליישר את שני הערוצים.
- המצלמות גם צריך להיות מתואם, כך הם parfocal לגבי השני. זו מושגת על ידי השגת סדרה של תמונות של חרוזים ברזולוציה משנה כי הם מופרדים זה מזה בכיוון Z של 100 ננומטר. אם פיקסל בעוצמה המרבית החרוזים נמצאת באותו המטוס הן המצלמות, אז הם parfocal.
3. הדמיה
לאחר מיקרוסקופ מוגדר, המשימה הבאה היא להכין חדרי זרימה המכילים הנתמכים זכוכית השומנים bilayers המציגים אנטיגן מולקולות הדבקה כמתואר לעיל 6 ולאחר מכן לבצע TIRFM של תאים T transfected אינטראקציה עםהמצע. Bilayer פורסם פרוטוקול 5-6 לאחר מכן כפי שפורסם אלא את ליפוזומים לא מודגרות למשך 20 דקות על coverglass לאחר הקאמרית זרימת הורכב. במקום זאת, בהרוורד-BSA חיץ היה זרם בתא זרימת מיד לאחר ההרכבה.
- הרכב חדר לזרום עם bilayers השומנים מישוריים שנוצרו על פיסת זכוכית המכסה המכיל Ni-נ.ת. ע שומנים. מולקולות הדבקה, ICAM-1 (100 מיקרומטר מולקולות / 2), ו-MHC-חלבון פפטיד קומפלקסים, MCC טעון IE K (מולקולות 5-10 מיקרומטר / 2), המעוגנים bilayer באמצעות תגי היסטידין שלהם. מולקולה costimulatory CD80 נוסף באמצעות עוגן GPI (100 מיקרומטר מולקולות / 2).
- מניחים את התא זרימה על הבמה של המיקרוסקופ ולייצב אותה. צרף היצרן סיפק אלמנט חימום על התא זרימה לשלוט בטמפרטורה שלו. מקם את המטרה על bilayer ולהביא את המטוס bilayer כדי להתמקד. לאפשר חימום של המטרה ואת זרימתהתא כדי לייצב את הטמפרטורה של החדר על 37 ° C.
- בתאי T Transfected הם pelleted לאחר 4 שעות של דגירה במהירות של 80x גרם מחדש תלויה חיץ בהרוורד-BSA שיושלם עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של Fab H57 או 20 מיקרוגרם / מ"ל של H57 שבר משתנה אחת בשרשרת (scFv) כדי תווית TCR. התאים מוזרקים לאחר מכן בתאי הזרימה. ההדמיה נעשית בנוכחות רציפה של Fab או scFv בשל הניתוק שלהם גבוהה מתמיד. נוכחותם בינוני לא להגדיל באופן משמעותי את הרקע כמו שדה TIRF הוא דק מאוד.
- התנאים הדמיה מוגדרים כך רכישת ערוץ כפול חי מציג תצוגה מקדימה חיה של ערוצי TCR ו-GFP המסייעת בחיפוש אחר תאים transfected. TIRF תאורה תאושר על ידי התמקדות על המטוס זכוכית לזהות כל מכתים הקרום לרוחב. אם ממברנות צדדיים לא באים בפוקוס אז יישור TIRF טוב. תאים Transfected הם צילמו אז פעם או ברצף תמונה לייצר vidEOS.
4. תמונה עיבוד וניתוח נתונים
התוכנה מדפיסה תמונות משתי מצלמות בתוך מסגרת אחת. התפוקה של כל מצלמה הוא 512 x 512 פיקסלים, ולכן, את התמונה פלט ברזולוציה של 1024 x 512 פיקסלים בגודל. התמונות 1 צריך להיות מחולק מסגרות נפרדות המתאימות לשתי מצלמות. התמונות של רזולוציה משנה חרוזים משני הערוצים הם כיסו ופרמטרים יישור נחושים. תכונה מסוימת למערכת שלנו הוא סיבוב 1 מידת ערוץ 1 ביחס אחר (ראה איור 3). המקור הסביר ביותר של סיבוב זה הדוכנים המצלמה. לאחר סיבוב זה טרנספורמציות ליניאריות יחסית יותר ב X ו-Y צריך להתבצע בצורה מושלמת כדי ליישר את החרוזים בכבוד זה לזה. תמונות של חרוזים מתקבלים בכל ניסוי על מנת לקבוע את הפרמטרים המדויקים כדי ליישר את שני הערוצים. השינויים הללו ליניאריות הסיבוב מוחלים אז לכלתמונות ולאחר מכן הם חשופים אלגוריתמים פילוח ושיתוף לוקליזציה ניתוח.
5. נציג תוצאות
המערכת המתוארת כאן ניתן להתאים ללמוד במורד איתות של קולטן כלשהו קרום הפלזמה. זה אינפורמטיבי במיוחד בלימוד TCR איתות איתות כי מתרחשת בקבוצות לפתור אופטית בשם TCR microclusters או endosomes כמתואר לאחרונה 18. אם איתות התרחש ברזולוציה תת קבוצות של קולטנים או בהחלטת באשכול קולטנים ניסויים נוספים יצטרכו לעשות כדי לפרש את הנתונים. כפי שהוזכר קודם לכן, את CD3 שרשראות של מורכבות TCR עוברים זירחון על ידי קינאז Src המשפחה Lck על האירוסין של TCR ידי-MHC-חלבון פפטיד קומפלקסים. שרשרת CD3ζ phosphorylated ואז מגייס קינאז המשפחה Syk Zap70. לדמיין את גיוס Zap70 ובכך מדווח על מצב זרחון שרשרת CD3ζ. עוצמת הגירוי TCR ניתן לשנות באמצעות פפטידים מוטציה על שאריות מגע TCR. פפטידים אלו נקראים ligands פפטיד שינו (APLs). הניסוי נציג מוצג באיור 4 שבו פפטידים אגוניסט וחסונה מגייס Zap70 כדי microclusters TCR תוך עוצמה נמוכה יותר פפטיד T102L מצליח לגייס Zap70 ל TCR microclusters, הוכחת כי את שרשרת CD3ζ לא פוספורילציה במקרה זה. אנחנו יכולים להסיק את המסקנה, כי היינו צריכים רק להתבונן גיוס Zap70 לאשכולות TCR שהיו לאתר בקלות על ידי TIRFM. אלגוריתם סגמנטציה אוטומטית שימש לספור את מספר Zap70 microclusters לכל תא. מוצג גם סרט נוסף הוא הדמיה בו זמנית של TCR ו Zap70 הקשורים פלואורסצנטי. הערה באופי הדינאמי של lamelipodium.
<br /> באיור 1. תמונה סכימטי של ההשקה TIRF מותאם אישית. לוח מראה את התמונה של שיגור TIRF כמו מותקן על המיקרוסקופ, ואת לוח B הוא סכימטי של ההשקה TIRF הוכחת נתיב האור. סכמטית ותמונה המראה את המיקום של העדשה אספן, קרן splitter, על השקת סיבים עם X, Y ו-Z התאמות, L1 העדשה collimating, ואת העדשה L2 התמקדות מותקן קוביית dichroic לבין המטרה TIRF. הבלעה מראה את העדשה להתמקד מותקן קוביית dichroic.
איור 2. תמונה סכימטי של מערכת 2 את המצלמה. לוח מראה את התמונה של המערכת 2 המצלמה מחוברת למיקרוסקופ, ואת לוח B הוא סכימטי של אותו דבר. סכמטית ותמונה להראות את המיקום של המטרה, מראה, dichroic, עדשות צינור TL1 ו TL2, מסנני פליטה F1 ו F2, שתי מצלמות C1 ו-C2 על tהיורש עומד עם X שלהם, Y ו-Z התאמות.
איור 3. השימוש תת ברזולוציה חרוזים כדי ליישר את שני הערוצים. לוחות ושכבות ב 'מופע של רזולוציה משנה חרוזים לפני (לוח) ואחרי (לוח ב') היישור. לוח מראה כי אחד הערוצים הוא הסתובב עם כבוד לצד השני. לוחות C ו-D הם סעיף קטן של התמונות ב א 'וב' לוח ה מראה ערוץ 2 שכבת התמונה של תאים ללא עיבוד. פרמטרים יישור בשימוש בלוח D יושמו התמונה המוצגת בהודעה פ לוח כיצד lamelipodium משני הערוצים מיושר בצורה מושלמת בפה פאנל ולא בלוח מיקרומטר א 'סולם בר 4 לכל הלוחות.
איור 4. Zap70 לגיוס TCR microclusters בתגובה APLs שונים. In-vitro פעיל ו-T התאים היו transfected עם קידוד פלסמיד Zap70 קיבע את ה-GFP והיו מודגרות על זכוכית נתמך Ni-נ.ת. ע bilayers המכילים מולקולות 6/2 מיקרומטר של הפפטיד טעון שלו מתויג, כלומר K, 100 מולקולות / 2 מיקרומטר של Alexa647 מצומדות מתויג שלו ICAM למוצרי 1 ו - 100 מולקולות / 2 מיקרומטר של GPI-מעוגנת CD80. פפטידים העמיסו מצוינים הבלעה. ICAM-1 מתייחס לתאים על bilayers המכילים 100 מולקולות / 2 מיקרומטר של Alexa-647 מצומדות מתויג שלו ICAM-1. ערוץ כפול בו זמנית רכישת מיקרוסקופ TIRF בוצע בנוכחות רציפה של Alexa546 שבר מצומדות Fab H57 (ללא חסימה) להכתים TCR. התאים היו צילמו עד שעה לאחר יצירת הקשר הראשוני עם bilayer. מספר Zap70 אשכולות לכל תא נותחו באמצעות תוכנה אוטומטית ספירת אשכול. לפחות 40 תאים נותחו בכל מקרה ומקרה. בקנה מידה 2 בר מיקרומטר עבור כל התמונות.
92/3892fig5.jpg "/>
איור 5. המערך של מערכת 2 את המצלמה באמצעות שני סוגים שונים של מצלמות. לוח זה מציג את כיסוי מיושר ההחלטה המשנה חרוזים צילמו באמצעות מערכת 2 המצלמה שבה שתי מצלמות יש גדלים שונים (ירוק פיקסל: 6.45 מיקרומטר פיקסל גודל צילמו ב binning 2x2 ו-Red: 16 גודל פיקסל מיקרומטר צילמו ב binning לא). הבלעה מראה תצוגה מוגדלת של תיבת בכיכר במרכז השדה. בקנה מידה 5 בר מיקרומטר.
סרט משלים. Zap70 לגיוס microclusters TCR בתגובה פפטיד אגוניסט. חוץ גופית פעיל ותאי T היו transfected עם קידוד פלסמיד Zap70 קיבע את ה-GFP והיו מודגרות על זכוכית נתמך Ni-נ.ת. ע bilayers המכילים מולקולות 6/2 מיקרומטר של הפפטיד טעון שלו מתויג, כלומר K, 100 מולקולות / 2 מיקרומטר של Alexa647 מצומדות שלו מתויג ICAM-1 ו - 100 מולקולות / 2 מיקרומטר של GPI-מעוגנת CD80. ערוץ כפול בו זמניתמיקרוסקופיה cquisition TIRF בוצע בנוכחות רציפה של Alexa546 שבר מצומדות Fab H57 (ללא חסימה) להכתים TCR. בתחום של תאים transfected היה צילמו שוב ושוב 40 פעמים עם רזולוציה זמן של 10 שניות לכל מסגרת. בקנה מידה 2 בר מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בסרט משלים .
Discussion
המתואר כאן מערכת ללמוד איתות אנטיגן ספציפי העיקריים טי תאים העכבר באמצעות TIRFM ותמך זכוכית השומנים bilayers כמו נגמ"שים מלאכותיים. הטכניקה מתבססת על בהצלחה לבטא חלבונים GFP מתוייגים בתאים אלה. Transfecting ותאי T היא תמיד משימה מאתגרת. בדרך כלל, electroporation או הגן משלוח באמצעות רטרווירוסים lentiviruses או משמשים. אחת הטכניקות היא לא עדיפה על פני האחר, גם יש מגבלות ויתרונות שלהם. אנו מוצאים electroporation כי יש את היתרונות הבאים: 1) זה לא נדרש כי התאים להיות פעיל חלוקת כנדרש על רטרווירוסים אך לא lentiviruses, ו 2) רמת הביטוי יכול להיות נשלט על ידי שינוי זמן התאים מודגרת לפני הדמיה. החיסרון הגדול ביותר הוא שאנחנו מתקשים מאוד לבטא חלבונים כי הם גדולים בגודל של תאים ראשוניים. הצגנו שיטה נותן לנו כדאיות התא טוב מאוד אחרי electroporation. כתוצאה מכך הוא applicabלה להשתמש בו כדי להשיג בתיווך siRNA להשתקת גנים.
כמו כן, אנו מתארים כאן מותאם אישית בו זמנית בערוץ 2 רכישת TIRF מיקרוסקופ, כי הוא תיקן chromatically ואינו דורש יישור נפרד עבור אורכי גל שונים. יכולות אלה, אך הם זמינים מסחרית. המערכת שלנו מבוססת על עקרונות של מיקרוסקופיה TIRF שפורסם על ידי מומחים בתחום, והוא זול יותר מאשר חלופות מסחריות. אחת הביקורת האפשרית של העיצוב שלנו הוא שאנחנו משתמשים באותה זווית של שכיחות עבור אורכי גל עירור שונים. הדבר יביא עומק החדירה TIRF שונה עבור אורכי גל עירור שונים. אנו סבורים כי תופעות אלה הן קטנות בגלל גל חולף הוא שדה מתפורר אקספוננציאלית ואת עומק השדה TIRF היא פונקציה ליניארית של אורך הגל. Fluorophores קרובים לפני השטח זכוכית יחוו הבדל בעוצמות לייזר בין שני אורכי גל. עבור fluorophores ליד PEעומק netration, ההבדל יהיה בעוצמה 1.3 לקפל את שני אורכי גל 488 ו 640 ננומטר 1.15 לקפל עבור שני אורכי גל 488 ו 561 ננומטר. אותה מערכת יכולה לשמש בשילוב עם טכניקות ברזולוציה סופר העושים שימוש בתאורה TIRF.
תיארנו גם מערכת 2 המצלמה בנוי מותאם אישית. כמו מערכת TIRF, מנגנונים דומים זמינים גם מבחינה מסחרית. המערכת שלנו מציעה גמישות לשנות את המסננים ואת dichroics, המאפשר את השימוש בו עם שילובים שונים של אורכי גל. החיסרון של המערכת שלנו הוא מידת סיבוב אחד צריך ליישר את שתי התמונות. בעיה זו ניתן לפתור באמצעות עמדות מצלמה כי הם מונעים piezo ולהציע מעלות הסיבוב של יישור. יש לנו גם ליישם בהצלחה מערכת 2 המצלמה על מיקרוסקופ זה, שבו המצלמות הם שונים ויש להם גדלים שונים פיקסל. מערכת כזו תהיה יעילה אם היה צורך ברגישות בערוץ 1 ו dy גדולמגוון namic אחר, הן אלו לעתים נדירות זמין המצלמה זהה. השתמשנו במצלמה HQ-2 Photometrics ב binning 2x2 נותן לנו גודל פיקסל אפקטיבי של 12.9 מיקרומטר עם המצלמה Photometrics קוואנט-EM בעלת גודל פיקסל של 16 מיקרומטר. 180 מ"מ אורך מוקד העדשה הצינור שימש קוואנט-EM ו 145 מ"מ צינור מוקד העדשה אורך שימש המצלמה HQ-2. HQ-2 נשלט באמצעות Metamorph תוכנה קוואנט-EM נשלט באמצעות תוכנת מנהל מיקרו במחשב נפרד במצב טריגר חיצוני. טריגר חיצוני נמסר המצלמה קוואנט-EM באמצעות הפלט הדיגיטלי של לוח מחשוב DAC מדידה, אשר יושמה כמו תריס נוסף על קביעת תצורה של הגדרות תאורה Metamorph. היחס בין אורכי מוקד של עדשות צינור תואם את היחס בין הגדלים פיקסל אפקטיביים. יישור נציג מוצג באיור 5.
Disclosures
כל בעלי החיים המשמשים בניסויים אלה נשמרו בסביבה הפתוגן ללא ספציפי, ואת הניסויים אושרו על ידי המכון הלאומי לבריאות בעלי חיים טיפול ועדת שימוש.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המחלקה למחקר המיפוי של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים יוהנס החופה ומארק דיוויס לתת לנו scFv של H57 שימוש במחקרים אלה. RV רוצה להודות קיאר נוימן לדיון מועיל במהלך הפיתוח של טכניקה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells | Lonza Inc. | VPA-1006 | |
| PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit | Life Technologies | K2100-05 | For endotoxin free DNA preps |
| Amaxa Nucleofector Device | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Recombinant Murine IL-2 | PeproTech Inc | 212-12 | |
| Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm | Polysciences, Inc. | 24050-5 | |
| Lab-Tek II 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155409 |
References
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function. Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S.T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).
- Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways. Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).
- Fraser, I. D., Germain, R. N. Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells. Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Yokosuka, T. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).
- Huppa, J. B. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Tolar, P., Pierce, S. K. A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).
- Treanor, B. The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor. Immunity. 32, 187-199 (2010).
- Treanor, B., Batista, F. D. Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling. Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).
- Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses. Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).
- Purbhoo, M. A. Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse. Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).
- Lasserre, R. Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse. EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Williamson, D. J. Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events. Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).
