Summary
Den compartmentalization av proteiner enten innenfor plasmamembranen eller i intracellulære steder er en regulerende mekanisme som i stor grad kan påvirke signal utfall, derfor, å forstå signaliserer det er viktig å studere den romlige og tidsmessige oppførsel av proteiner som er involvert. Vi beskriver her en TIRF mikroskopi basert system for å studere signaltransduksjon i T-celler, men er stort sett aktuelt.
Abstract
Signalisering er initiert gjennom T celle reseptor (TCR) når den er engasjert av antigene peptidfragmenter bundet av Major Histocompatability Complex (pMHC) proteiner uttrykt på overflaten av antigenpresenterende celler (APC). Den TCR komplekset består av ligand binding TCRαβ heterodimer som knytter ikke-kovalent med CD3 dimer (de εδ og εγ heterodimerer og ζζ homodimer) 1. Ved engasjement av reseptoren, er CD3 ζ kjedene fosforylert av Src familien kinase, LCK. Dette fører til rekruttering av Syk familien kinase, Zap70, som deretter fosforylert og aktivert av LCK. Etter at phosphorylates Zap70 adapteren proteiner LAT og SLP76, initiere dannelsen av den proksimale signalering kompleks som inneholder et stort antall forskjellige signalmolekyler 2.
Dannelsen av dette komplekset til slutt resulterer i kalsium og Ras-avhengig transcription faktor aktivering og dermed initiering av en kompleks serie av genuttrykk programmer som gir opphav til T-celle differensiering to. TCR signaler (og den resulterende tilstand av differensiering) er modulert av mange andre faktorer, inklusive antigen potens og crosstalk med co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, og cytokin reseptorer 3-4. Å studere den romlige og tidsmessige organisering av proksimale signalering komplekset under ulike stimulering forhold er derfor nøkkelen til å forstå TCR signalveien samt regulering av andre signalveier.
En svært nyttig modellsystem for å studere signaliserer initiert av TCR på plasmamembranen i T-celler er glass-støttede lipid bilayers, som beskrevet tidligere 5-6. De kan benyttes til å presentere antigene pMHC komplekser, heft, og co-stimulerende molekyler til T celler-tjener som kunstige APC. Ved avbildning T-cellene i samspill medlipid bilayer bruker total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), kan vi begrense eksitasjon til innenfor 100 nm fra rommet mellom glasset og celleoverflaten 7-8. Dette gir oss muligheten til bildet først og fremst signaliserer hendelser på plasmamembranen. Som vi er interessert i bildebehandling rekrutteringen av signalanlegg proteiner til TCR komplekset, beskriver vi en to-kamera TIRF imaging system der den TCR, merket med fluorescerende Fab (fragment antigen binding) fragmenter av H57 antistoff (renset fra hybridoma H57-597 , ATCC, ATCC Antall: kan HB-218) som er spesifikk for TCRβ, og signalsystemer proteiner, merket med GFP, bli fotografert samtidig og i sanntid. Denne strategien er nødvendig på grunn av svært dynamisk karakter av både T-celler og i signalanlegget hendelser som skjer på TCR. Dette imaging modalitet har tillatt forskere å avbilde enkelt ligander 9-11 samt rekruttering av signalmolekyler til aktiverte reseptorer oger en utmerket system for å studere biokjemi in-situ 12-16.
Protocol
Eksperimentell Fremgangsmåte:
1. Transfeksjon bruker Amaxa Mouse T Cell Nucleofector Kit
Vi beskriver her transfeksjon av enten naive eller i-vitro aktivert primære T-celler med uttrykket plasmider som koder signalmolekyler tagget av GFP, bruke Amaxa Mouse T Cell Nucleofector Kit. In-vitro aktivering av T-celler ved hjelp av peptid-lastet splenic APC utføres som beskrevet før 7. Alle T-celler som brukes i våre studier uttrykke OG TCR som gjenkjenner MCC peptid (88-103) bundet til MHC molekyl IE k. Transfeksjon utføres i hovedsak i henhold til produsentens anbefalinger, men presenterer vi noen tips som fremmer levedyktighet av T celler etter transfeksjon. Både levedyktighet og transfeksjon effektivitet er mye høyere i in-vitro aktiverte T celler enn i naive celler.
- Før du starter, utarbeide 2 mL supplert T-celle medium ved å legge 20 mL avbegge middels komponenter A og B og 100 mL av fosterets storfe serum (5%) for hver transfeksjon skal utføres. Stabilisere mediet i en 12-brønns plate i en fuktet 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i minst en time. Alternativt alikvoter av medium supplert med 5% serum og Komponent A kan utarbeides og oppbevares frosset. Hvis dette er tilfelle, tine det nødvendige antall alikvoter, legge Komponent B, og utføre likevekt.
- Pre-likevekt av mediet er svært viktig, ettersom celledød vil resultere fra re-suspensjon av cellene etter transfeksjon i medium som er enten kald eller har en pH enn 7,2.
- Deretter forberede transfeksjon blandingen. Kombiner 82 mL av Mouse T Cell Nucleofector Solution med 18 mL av Supplement 2 og 5μg av plasmid DNA (konsentrasjon ikke lavere enn 0,5 mikrogram / mL). Bland grundig ved å peke på tube eller med bruk av mikro pipette.
-Det er viktig å utføre en titrering av plasmid dose for et fast antall celler for hver konstruksjon som skal brukes til transfeksjon. For noen større konstruksjoner, kan flere DNA være nødvendig. DNA skal være fri for endotoksiner.
- Overføring 5 til 10 millioner celler til en 15 mL sentrifugerør. Sentrifuger ved 600 rpm i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern så mye av supernatanten som mulig med et vakuum aspirator.
- Produsentene anbefaler å spinne cellene ved mindre enn 90 ganger g; i vårt tilfelle, tilsvarer dette hastighet til 75x g. Den valgte relative sentrifugalkraften (RCF) for å få en celle pellet er kanskje den mest avgjørende variabelen, som sentrifugering på lav RCF utelukker skade på cellemembranen.
- Re-suspendere cellepelleten i transfeksjon blanding av forsiktig og sakte pipeting cellepelleten til det ikke er store klumper av celler gjenværende. Dette kan vanligvis oppnås ved fullstendig å aspirere cellene through pipettespissen ikke mer enn 3-4 ganger.
- Ved hjelp av en pipette, forsiktig overføre suspensjonen i en sertifisert Amaxa kyvette, slik at det ikke er bobler tilstede. Cap kyvetten.
- Velg Nucleofector program X-001 på Nucleofector enheten. Sett kyvetten inn i Nucleofector kyvetteholderen og bruke valgte programmet.
- Etter electroporating cellene, er det best å umiddelbart overføre dem til pre-likevekt kultur medium. Produsentene anbefaler at cellene holdes i nucleofector medium for ikke lenger enn 15 minutter.
- Ta kyvetten og pre-likevekt, fullt supplert kultur medium til panseret. Bruk den medfølgende plast pipette legge ca 500 mL av medium til kyvetten og overføre cellesuspensjonen til medium i platen dråpe for dråpe.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 4 timer før bildebehandling. Naive celler er incubated ved 30 ° C i stedet for 37 ° C. Dette bidrar til å opprettholde sin reaktivitet til antigen.
- Tre til fire timer inkubering er generelt tilstrekkelig for T-cellene til påvisbar uttrykke GFP merkede proteiner. Vi valgte å bildet celler på dette tidspunktet fordi nivået av uttrykket er lav og gjenstander av over-uttrykk bør minimaliseres. Hvis over-uttrykk for en bestemt protein er ønskelig, men bør T-cellene fjernes fra Amaxa medium etter 4 timer. Dette gjøres ved igjen pelletting cellene ved lav RCF og resuspending i pre-likevekt T-celle kultur medium supplert med 50 U / mL Interleukin 2 (IL-2) ved en tetthet på 2 millioner celler / ml.
2. TIRF Mikroskopi
Beskrivelse av TIRF mikroskop:
- Generelle konfigurasjon: Optiske komponenter ble bygget rundt en Olympus IX71 fluorescens mikroskop som opprinnelig ble utstyrt med en Olympus TIRF modul. Snart discovered kromatiske effekter i denne modulen når en enkelt justering stat ikke oppnå sammenfallende kollimasjon for laserlinjene av ulike bølgelengder. Denne modulen derfor ikke ville tillate samtidig TIRF avbildning ved hjelp av ulike eksitasjonsbølgelengdene, og vi dro ut for å konstruere en tilpasset TIRF apparat som minimerer kromatisk effekter i systemet, som vi diskuterer i detalj i de følgende avsnittene. Metoden er beskrevet her ble utviklet for 150 X forstørrelse, fungerer 1,45 numerisk apertur (NA) TIRFM objektiv (Olympus), men like bra for den 60 x forstørrelse, 1.45 NA versjoner. For bredt felt belysning, er mikroskop koblet til en metall halogen Lambda-XL lyskilde og en eksitasjon filter hjul (Sutter Instruments) utstyrt med eksitasjon filtre. For automatisert posisjonering av prøven scenen med hensyn til målet, er mikroskop utstyrt med en motorisert XY oversettelse, piezo-kontrollert Z scenen (ASI). Bildene er tatt med to identiske QuantEM elektron multiplisere (EM) CCD-kameraer (fotometriske). Den pikselstørrelse på disse kameraene matcher veldig godt med forstørrelse som tilbys av 150 X TIRF objektiv, som gir en endelig oppløsning på 0,1 mikrometer per piksel. De EMCCD kameraene tilbyr også følsomheten til å visualisere GFP transfectants har lavt uttrykk nivå.
- Lasere: For TIRF belysning, et system av 5 lasere levere en totalt 6 laserlinjer (405, 440, 488, 514, 561 og 640 nm) er koplet inn i en single-modus fiber (Solamere Technologies). Den Argon laser og 561 nm diode pumpet solid state (DPSS) laser (linjene 488, 514 og 561) føres gjennom en acousto-optisk tunbare fiber (AOTF) for intensitet kontroll mens intensiteten av diode lasere (405, 440 og 640 nm) er kontrollert av modulerende spenningen av sine strømforsyninger. Spenningen på AOTF og strømforsyningene til diode lasere styres gjennom en datainnsamling kort (DAC) bord (Måling Computing) med MetaMorph programvare (MolecuLar Devices). Den koblingen effektivitet for diode lasere er 30%, mens de av argon og DPSS lasere er ca 60% på grunn av deres mindre stråle diameter.
- TIRF modul: For å samtidig avbilde TCR og tilhørende signalmolekyler, som beskrevet tidligere, var det avgjørende å ha TIRF belysning som ble kromatisk korrigert og det ville ikke kreve omstilling eller omstilling når anskaffe fluorescens utslipp av ulike bølgelengder. TIRFM ble oppnådd ved hjelp gjennom-the-målet belysning, som beskrevet før 17. Den fiberoptiske kabelen som leverer laserlys til mikroskopet ble sikret i en fiber lansering utstyrt med en XY fiber holder montert på toppen av en mikrometer-drevet optisk rail for Z justering (Thorlabs). For å oppnå TIRF belysning, er laserstrålen fokusert på baksiden fokalplanet av målet ved hjelp av et system av to objektiver (L1 (collimating linse) og L2 (med fokus linse) i figur 1), slik at bEAM kommer kollimert ut av målet. Dette sikrer at alle stråler av lys som kommer ut av mål vil ha samme vinkel i forhold til prøven flyet. Tuppen av optisk fiber er plassert i fokus for den collimating objektivet. Ved å flytte mikrometer langs den optiske skinnen med hensyn til collimating objektiv (Z retning) er det mulig å justere fokus av strålen og flytte bjelken i X og Y posisjon bruke XY justeringsknottene. På grunn av svært liten tilbake blenderåpning på 150 X målet, fant vi at for å oppnå TIRF, størrelsen på laser spot bak fokusplanet for å være liten. For å oppnå fokus er nødvendig for å produsere den lille flekken, var objektiver med korte brennvidder nødvendig (Keir Neumann, personlig meddelelse), derfor brukte vi en fokus objektiv med en brennvidde på ca 108 mm som ble plassert i dichroic kuben direkte forut målet. Den collimating linse ble plassert nærmere bjelken splitter som brakte i TIRF belysning. For å minimere uønskede kromatiske effekter, brukte vi akromatisk dubletter (kromatisk korrigert linse laget ved å fusjonere to linseelementer laget av materialer av forskjellige refraktiv indekser) med antireflection belegg for både collimating og fokusere objektiver (JML optisk). Fokuset kan verifiseres ved å sjekke at strålen kommer kollimert ut av målet da plassert i sentrum av ryggen blenderåpning og bør danne et stramt spot på rommet taket. Plasseringen av fokusert spot er flyttet deretter mot kanten av åpningen (i Y retning) som fører til at strålen til konvergerer på bildeplanet i store vinkler, og til slutt, er kritisk vinkel for total intern refleksjon oppnådd. Ved hjelp av disse optiske komponenter, oppnådde vi samtidig kollimasjon for alle bølgelengder fra 442 til 640 nm på samme justering. En enkel optisk justering, derfor tillot oss å utføre TIRFM samtidig på tvers av flere bølgelengder.
- Dual kamera tilsynelatendeatus: Samtidig oppkjøpet av den distinkte fluorescens utslipp som følge av to forskjellige fluorophores ble oppnådd ved å bygge en to kamera system som deler utslipp i to bølgelengdeområdene gjennom bruk av dichroic speil (figur 2). Lyset reflekteres fra målet ut av høyre side porten av mikroskopet. Som de fleste målene er uendelig korrigert (med bilder som dannes på uendelig), en tube linse er nødvendig for å fokusere bildet. For å manipulere to Emisjons bølgelengder samtidig, ble røret linsen på høyre side porten fjernet. En tilpasset adapter som inneholder c-mount tråder (Sutter Instruments) ble festet og knyttet til en dichroic speil holder (Edmund Optics). Dichroic speil som skiller GFP utslipp fra det av organiske fargestoffer som brukes til å merke TCR (Alexa546, Alexa647, etc.) ble installert i denne holderen. Denne modulen ble fulgt i både lyse stier med en tube objektiv innehaver, en emisjon filterholder og forlengelsesrør. Dettube linser (TL1 og TL2 (figur 2)) har en brennvidde på 180 mm. Hull i forlengelsesrørene fører til EM CCD-kameraer var dekket med svart papir å skjerme kameraene fra strølys. For å gi rom for justering av de to kanalene, ble kameraene montert på to egendefinerte XYZ oversettelse stands (Holmarc Produkter).
Nedenfor vil vi beskrive hvordan du justere mikroskop for to kanaler samtidig avbildning. Trinnene som er involvert samkjøre TIRF belysning, justere laser makt, og samkjøre de to output bildene ved hjelp av sub-oppløsning microbeads.
- Før du starter, er alle komponenter i mikroskopet slått på. Datamaskinen og programvaren deretter startet, og det sikres at alle maskinvarekomponenter er anerkjent av programvaren.
- For bruk som en samlokalisering standard, fortynne 1 mL av sub-oppløsning (0,2 mikrometer) Fluoresbrite Multi-fluorescerende Mikrokuler til 2 mL PBS og legge 0,25 mL av mikrosfæresuspensjon til hver brønn av en Lab-Tek II 8-brønnen kammer coverglass system (Nunc). Plasser kammeret lysbildet systemet på plattformen over målet. Perler som er adsorbert til glasset blir deretter brakt i fokus.
- Bruke Y justeringen av XYZ fiber lanseringen, er plasseringen av laserstrålen flyttet til midten av ryggen blenderåpningen på objektivet. Det er viktig å gjøre dette når målet er i den posisjonen hvor glasset flyet er i fokus. Hvis strålen ikke er kollimert, er Z mikrometer justert for å oppnå full kollimasjon. Kollimasjon testes individuelt for alle laserlinjene som skal brukes i forsøket. På dette stadiet, laser kraft for hver linje målt ved hjelp av en laser strømmåleren og justeres til 20-30 μW i hver kanal.
-T-celler er svært følsomme for laserstråling, og belysningen er begrenset til totalt 50 μW.
- Bilder av perlene er kjøpt ved hjelp TIRF illumination i live modus. Snu Y-justering mikrometer på fiber lanseringen slik at strålen begynner å bevege seg bort fra taket til sin vinkel i forhold til målsetningen optiske aksen tilnærminger 90 grader. Til slutt, når den kritiske vinkelen for TIR er nådd, vil laserlys ikke lenger gå ut målet. TIRF justering er da dømt ved å fokusere opp og ned gjennom planet av coverglass. Hvis perler som er flytende i løsning kan være visualisert, så vinkelen på strålen med hensyn til de objektive normale behov økes ytterligere. Ved riktig TIRF justeringen, vil bare en optisk flyet være i fokus (dvs. bare de perlene som er adsorbert til dekkglass). En finere test av TIRF innretting kan iverksettes når avbildning T-celler farget med en overflate fargestoff som har spredt på en overflate. (Se punkt 3.4).
- Etter TIRF belysning er oppnådd, kan de to kanalene bli justert med hensyn til hverandre. Fokus på perlene og sammenligne stilling identifiable funksjoner i bildene produsert i begge kanaler. Bruke X-og Y mikrometer skruer på ett kamera stativ, bringe den relative plasseringen av perlene i så nær tilknytning som mulig. Lagre bildene fra begge kanaler. Disse bildene vil bli brukt som en samlokalisering standard for å justere de to kanalene.
- Kameraene må også justeres slik at de er parfocal med hensyn til en annen. Dette oppnås ved å kjøpe et sett med bilder av de sub-oppløsning perler som er skilt fra hverandre i Z retning ved 100 nm. Dersom den maksimale intensitet pixel for perlene ligger i samme plan for begge kameraene, da de er parfocal.
3. Imaging
Når mikroskop er satt opp, er neste oppgave å forberede flyt kamre som inneholder glass støttede lipid bilayers presenterer antigen og adhesjonsmolekyler som tidligere beskrevet seks og deretter utføre TIRFM av transfekterte T-celler i samspill medsubstrat. Den publiserte bilayer protokollen 5-6 ble etterfulgt som publiseres, bortsett fra at de liposomer ikke ble inkubert i 20 minutter på coverglass etter flyten kammeret ble montert. I stedet ble HBS-BSA buffer fløt i strømningscellen umiddelbart etter montering.
- Sett sammen en flyt kammer med planar lipid bilayers dannet på glassdekselet slip inneholder Ni-NTA lipider. Adhesjonsmolekyler, er ICAM-1 (100 molekyler / mikrometer 2), og peptid-MHC komplekser, MCC lastet IE k (5-10 molekyler / mikrometer 2), innlemmet i bilayer via sine histidin tags. Den costimulatory molekylet CD80 er lagt med en GPI anker (100 molekyler / mikrometer 2).
- Plasser strømningscellen på scenen av mikroskopet og stabilisere den. Fest produsenten levert varme element på strømningscellen å kontrollere temperaturen. Plasser målet på en bilayer og bringe bilayer flyet i å fokusere. Aktiver oppvarming av objektiv og flytencellen til å stabilisere temperaturen i kammeret ved 37 ° C.
- Transfekterte T-celler er pelletert etter 4 timers inkubasjon med en hastighet på 80x g og re-suspendert i HBS-BSA buffer og supplert med 10 mikrogram / ml av H57 Fab eller 20 mg / ml H57 enkelt kjede variabel fragment (scFv) til merke TCR. Cellene blir deretter injisert i flyten cellene. Imaging gjøres i den kontinuerlige nærvær av Fab eller scFv grunn av sin høye dissosiasjonskonstant. Deres tilstedeværelse i mediet ikke signifikant øke bakgrunnen som TIRF feltet er svært tynn.
- Imaging vilkår er satt opp slik at dual channel levende oppkjøpet viser en levende forhåndsvisning av TCR og GFP kanaler som bidrar i å søke etter transfekterte celler. TIRF belysning bekreftes ved å fokusere opp glasset flyet å oppdage eventuelle lateral farging av membranen. Hvis laterale membraner ikke kommer i fokus da TIRF justeringen er bra. Transfekterte cellene blir deretter fotografert en gang eller i en bildesekvens å produsere vidEOS.
4. Bildebehandling og dataanalyse
Programvaren sender bilder fra de to kameraene i én ramme. Utgangen av hvert kamera er 512 x 512 piksler, derfor er det utgang bildet 1024 x 512 piksler i størrelse. Bildene må først deles inn i individuelle rammer tilsvarende de to kameraene. Bildene av sub-oppløsning perler fra de to kanalene er overlappet og justering parametere bestemmes. En funksjon som er spesifikk for systemet vårt er en 1 graders rotasjon av en kanal med hensyn til den andre (se figur 3). Den mest sannsynlige kilden til denne rotasjonen er kameraet stands. Etter denne rotasjonen ytterligere relative lineære transformasjoner i X og Y må utføres for å perfekt tilpasse perlene med hensyn til hverandre. Bilder av perler er innhentet i hvert eksperiment for å finne de presise parametere for å justere de to kanalene. Disse lineære og roterende transformasjoner blir deretter brukt til allebilder og da er de utsatt for segmentering algoritmer og samlokalisering analyse.
5. Representative Resultater
Systemet er beskrevet her kan tilpasses for å studere signalmolekyler nedstrøms av noe inngangen på plasmamembranen. Det er spesielt informativ i å studere TCR-signalering fordi signalering skjer i optisk løst klynger kalt TCR microclusters eller i endosomes som nylig beskrevet 18. Hvis signalering skjedde i sub-oppløsning klynger av reseptorer eller i FN-grupperte reseptorer flere eksperimenter måtte gjøres for å tolke dataene. Som nevnt før, CD3 kjeder av den TCR komplekset gjennomgå fosforylering av Src familien kinase LCK ved engasjement av TCR ved peptid-MHC komplekser. Den fosforylert CD3ζ kjeden rekrutterer deretter Syk familien kinase Zap70. Visualisering rekruttering av ZaP70 rapporterer således om fosforylering status CD3ζ kjeden. Styrken i TCR stimulering kan endres ved hjelp av peptider muterte på TCR kontakt rester. Slike peptider kalles endrede peptid ligander (APLs). En representant eksperimentet er vist i figur 4 der agonist peptider robust rekrutterer Zap70 til TCR microclusters mens den nedre potens peptid T102L unnlater å rekruttere Zap70 til TCR microclusters, viser at CD3ζ kjedet ikke er fosforylert i dette tilfellet. Vi kunne trekke denne konklusjonen fordi vi måtte bare observere rekrutteringen av Zap70 til TCR klynger som ble lett oppdaget av TIRFM. En automatisert segmentering algoritme ble brukt til å telle antall Zap70 microclusters per celle. Også vist i supplerende filmen er samtidig avbildning av TCR og Zap70 tilhørende fluorescens. Merk av dynamikken i lamelipodium.
<br /> Figur 1. Bilde og skjematisk av skikken TIRF lanseringen. Panel A viser fotografiet av TIRF lanseringen som er installert på mikroskopet, og Panel B er en skjematisk av TIRF lanseringen demonstrere lyset banen. Skjematisk og bilde som viser plasseringen av solfangeren objektivet, strålen splitter, fiber lanseringen med X, Y og Z justeringer, den collimating linse L1, og fokusere linsen L2 installert i dichroic kuben og TIRF målet. Det innfelte viser fokusere linsen installert i dichroic kuben.
Figur 2. Bilde og skjematisk av to kamera system. Panel A viser fotografiet av de to kamera system som er festet til mikroskopet, og Panel B er en skjematisk av det samme. Skjematisk og bilde viser posisjonen til målet, speil, dichroic, tube linser TL1 og TL2, utslipp filtre F1 og F2, de to kameraene C1 og C2 på tarving står med sine respektive X, Y og Z justeringer.
Figur 3. Bruk av sub-oppløsning perler å justere de to kanalene. Paneler A og B viser overlegg av sub-oppløsning perler før (panel A) og etter (Panel B) justering. Panel A viser at en av kanalene er rotert med hensyn til andre. Paneler C og D er en sub del av bildene i A og B. Panel E viser en tokanals overleggsbildet av celler uten behandling. Justering parametere som inngår i panelet D ble brukt til bildet vises i panelet F. Legg merke til hvordan lamelipodium fra de to kanalene er perfekt justert i panel F og ikke i panelet E. Scale bar 4 mikrometer for alle panelene.
Figur 4. Zap70 rekrutteringen til TCR microclusters som svar på ulike APLs. In-vitro aktivert og T celler ble tilført med en plasmid koding Zap70 smeltet til GFP og ble inkubert på glass støttede Ni-NTA bilayers inneholder 6 molekyler / mikrometer 2 av peptid lastet Hans-merket-IE k, 100 molekyler / mikrometer 2 av Alexa647 konjugert Hans-merket ICAM- 1 og 100 molekyler / mikrometer 2 av GPI-forankret CD80. Peptider lastet er angitt i den lille. ICAM-1 refererer til celler på bilayers inneholder 100 molekyler / mikrometer 2 av Alexa-647 konjugert Hans-merket ICAM-1. Dual Channel samtidig oppkjøpet TIRF mikroskopi ble utført i kontinuerlig tilstedeværelse av Alexa546 konjugert H57 Fab fragment (ikke-blokkerende) å farge den TCR. Celler ble fotografert opptil en time etter første kontakt med bilayer. Antall Zap70 klynger per celle ble analysert ved hjelp av en automatisert klynge telling programvare. Minst 40 celler ble analysert i hvert enkelt tilfelle. Skala bar 2 mikrometer for alle bildene.
92/3892fig5.jpg "/>
Figur 5. Justering av to kamera system med to forskjellige typer kameraer. Dette panelet viser justert overlegg av sub-oppløsning perler avbildes ved hjelp av to kamera system der de to kameraene har forskjellige piksel størrelser (Grønn: 6,45 mikrometer pixel størrelse avbildes på 2x2 Binning og Red: 16 mikrometer pixel størrelse avbildes uten Binning). Inset viser forstørret bilde av den firkantede boksen i midten av feltet. Skala bar 5 mikrometer.
Utfyllende Movie. Zap70 rekrutteringen til TCR microclusters som svar på agonist peptid. In-vitro aktivert og T-celler ble tilført med en plasmid koding Zap70 smeltet til GFP og ble inkubert på glass støttede Ni-NTA bilayers inneholder 6 molekyler / mikrometer 2 av peptid lastet Hans-merket-IE k, 100 molekyler / mikrometer 2 av Alexa647 konjugert Hans-merket ICAM-1 og 100 molekyler / mikrometer 2 av GPI-forankret CD80. Dual Channel samtidig encquisition TIRF mikroskopi ble utført i kontinuerlig tilstedeværelse av Alexa546 konjugert H57 Fab fragment (ikke-blokkerende) å farge den TCR. Et felt av transfekterte celler ble gjentatte ganger avbildes 40 ganger med en tidsoppløsning på 10 sekunder per bilde. Skala Bar 2 mikrometer. Klikk her for å vise supplerende film .
Discussion
Vi beskriver her et system for å studere signalering i antigen-spesifikke primære mus T-celler ved hjelp TIRFM og glass støttede lipid bilayers som kunstige APC. Teknikken baserer seg på hell uttrykker GFP merket proteiner i disse cellene. Transfecting T-celler er alltid en utfordrende oppgave. Vanligvis er electroporation eller genet levering med retrovirus eller lentiviruses brukt. En teknikk er ikke overlegen over den andre, begge har sine begrensninger og fortrinn. Vi finner at electroporation har følgende fordeler: 1) Det er ikke nødvendig at cellene skal aktivt å dele som er nødvendig for retrovirus, men ikke lentiviruses, og 2) Uttrykket nivået kan kontrolleres ved å variere tiden cellene inkuberes før bildebehandling. Den største ulempen er at vi finner det svært vanskelig å uttrykke proteiner som er store i størrelsen i primære celler. Vi har presentert en metode som gir oss meget god celleviabilitet etter electroporation. Som et resultat er det applicable til å bruke den til å oppnå siRNA-mediert genet Silencing.
Vi har også beskriver her en tilpasset to kanal samtidig oppkjøpet TIRF mikroskop som er kromatisk korrigert og krever ikke separat justering for ulike bølgelengder. Disse evnene, men er tilgjengelig kommersielt. Vårt system er basert på prinsippene om TIRF mikroskopi publisert av eksperter på området og er billigere enn kommersielle alternativer. En mulig kritikk av vårt design er at vi bruker den samme innfallsvinkelen for de ulike eksitasjonsbølgelengdene. Dette vil resultere i en annen TIRF inntrengningsdybde for ulike eksitasjonsbølgelengdene. Vi tror at disse effektene er små fordi evanescent bølgen er en eksponentielt forfallent felt og dybden av TIRF feltet er en lineær funksjon av bølgelengde. Fluorophores nær glassoverflaten vil oppleve noen forskjell i laser intensiteter mellom de to bølgelengder. For fluorophores nær penetration dybde, vil intensiteten forskjellen være 1,3 ganger for de to bølgelengdene 488 og 640 nm, og 1,15 ganger for de to bølgelengdene 488 og 561 nm. Det samme systemet kan brukes sammen med super oppløsning teknikker som gjør bruk av TIRF belysning.
Vi har også beskrevet en to kamera system som er spesialbygget. I likhet med TIRF system, lignende apparater er også kommersielt tilgjengelig. Vårt system gir fleksibilitet til å endre filtre og dichroics, slik at bruken med ulike kombinasjoner av bølgelengder. Ulempen med systemet vårt er det en viss rotasjon for å justere de to bildene. Dette problemet kan løses ved hjelp av kamera stands som er piezo drevet og tilbyr rotasjons grader av justeringen. Vi har også implementert en to kamera system på dette mikroskop, der kameraene er forskjellige og har forskjellige piksel størrelser. Et system som dette ville være nyttig hvis man trengte følsomhet i en kanal og en stor dydynamisk rekkevidde i en annen, som begge er sjelden tilgjengelig i samme kamera. Vi brukte fotometriske HQ-2 kamera på 2x2 Binning gi oss en effektiv pikselstørrelse på 12,9 mikrometer med fotometriske Quant-EM kamera som har en pikselstørrelse på 16 mikrometer. En 180 mm brennvidde tube linse ble brukt til Quant-EM og en 145 mm brennvidde tube linse ble brukt til HQ-2 kamera. HQ-2 ble kontrollert ved hjelp Metamorph programvare og Quant-EM ble styrt via micro-manager programvare på en egen datamaskin i ekstern utløser modus. Den eksterne trigger ble gitt til Quant-EM kamera med en digital utgang av målingen databehandling DAC styret, som ble gjennomført som en ekstra lukker i Konfigurer belysning innstillingene Metamorph. Forholdet mellom de brennvidder på Tube objektivene matcher forholdet mellom de effektive pixel størrelser. En representant justering er vist i figur 5.
Disclosures
Alle dyr som brukes i disse forsøkene ble opprettholdt i en bestemt patogen-fritt miljø, og forsøkene ble godkjent av National Institutes of Health Animal Care og bruk komité.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Seksjon for egenutført forskning fra National Institute for Allergy og smittsomme sykdommer, National Institutes of Health. Vi er takknemlige til Johannes Huppa og Mark Davis for å gi oss med det scFv av H57 brukt i disse studiene. RV vil takke Keir Neumann for nyttig diskusjon under utviklingen av denne teknikken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells | Lonza Inc. | VPA-1006 | |
| PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit | Life Technologies | K2100-05 | For endotoxin free DNA preps |
| Amaxa Nucleofector Device | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Recombinant Murine IL-2 | PeproTech Inc | 212-12 | |
| Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm | Polysciences, Inc. | 24050-5 | |
| Lab-Tek II 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155409 |
References
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function. Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S.T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).
- Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways. Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).
- Fraser, I. D., Germain, R. N. Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells. Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Yokosuka, T. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).
- Huppa, J. B. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Tolar, P., Pierce, S. K. A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).
- Treanor, B. The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor. Immunity. 32, 187-199 (2010).
- Treanor, B., Batista, F. D. Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling. Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).
- Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses. Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).
- Purbhoo, M. A. Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse. Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).
- Lasserre, R. Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse. EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Williamson, D. J. Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events. Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).
