Summary
De collectie van besmette teek hemolymfe, speekselklieren, en speeksel is van belang om te onderzoeken hoe door teken overgedragen pathogenen ziekte te veroorzaken. In dit protocol laten we zien hoe hemolymfe en speekselklieren te verzamelen uit de voeding
Abstract
Teken komen wereldwijd voor en treffen mensen met veel tick-borne ziekten. Teken zijn vectoren voor ziekteverwekkers die de ziekte van Lyme en tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis en E. equi), anaplasmose (Anaplasma phagocytophilum), encefalitis (tick-veroorzaken encefalitis-virus), babesiose (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus) en tularemie (Francisella tularensis) 1-8. Om goed te worden overgebracht in de gastheer van deze infectieuze agentia differentieel reguleren van genexpressie, interactie met tik eiwitten en migreren door de teek 3,9-13. Bijvoorbeeld, de ziekte van Lyme agent, Borrelia burgdorferi, past zich door middel van differentiële genexpressie tot het feest en hongersnood stadia van de teek enzoötische cyclus van 14,15. Bovendien, als een Ixodes teek verbruikt eenbloedmeel Borrelia vermenigvuldigen en migreren van de middendarm in de hemocoel, waar ze reizen naar de speekselklieren en worden verzonden naar de host met de verdreven speeksel 9,16-19.
Als een teek voedt de gastheer reageert doorgaans met een sterke hemostatische en aangeboren immuunrespons 11,13,20-22. Ondanks deze gastheer responsen, I. scapularis kan voeden voor meerdere dagen, want teek speeksel bevat eiwitten die zijn immunomodulerende, lytische middelen, anticoagulantia, en fibrinolysins om de teek voeden 3,11,20,21,23 te helpen. De immunomodulerende activiteiten bezeten door teek speeksel of speekselklier extract (SGE) te vergemakkelijken transmissie, proliferatie, en de verspreiding van tal van tick-borne pathogenen 3,20,24-27. Om verder te begrijpen hoe door teken overgedragen ziekteverwekkers ziekte te veroorzaken is het belangrijk om actief te ontleden voeden teken en door teken speeksel op te vangen. Dit protocol video toont ontleding techniekenhet verzamelen van hemolymfe en de verwijdering van speekselklieren van actief voeden I. scapularis nimfen na 48 en 72 uur na de muis plaatsing. We tonen ook aan speeksel collectie van een volwassen vrouwtje I. scapularis teek.
Protocol
1. Hemolymfe collectie voor het prepareren van objectglaasjes
(Film 1)
- Verwijder actief voeden teken van een dier en plaats deze in 3% actuele waterstofperoxide gedurende 5 minuten en dan in 70% ethanol gedurende 10 minuten naar de oppervlakte te steriliseren.
- Met een pap pen teken een cirkel op een silaan gecoate microscoopglaasje en plaats de teek binnen de pap pen cirkel.
- Silane gecoate glaasjes worden gebruikt voor de beste hechting van de hemolymfe de microscoopglaasje.
- Bekijk de teek onder een stereomicroscoop (1X objectief, 10x oculair, 3,5 maal vergroot).
- Druk voorzichtig op dorsale gedeelte van de teek met een pincet om de teek de benen splay en de teek te immobiliseren.
Opmerking: Wanneer immobiliseren van de teek niet te veel druk, want dit kan de middendarm of doorboren de teek verstoren en vervuilen de hemolymfe.
- Amputeren van de teek het been of de benen aan de THe distaal gewricht met een fijne punt wegwerp scalpel. Om te bepalen besmettelijkheid via hemolymfe slechts 1 been moet worden geamputeerd. Voor het verzamelen van hemolymfe op een dia meerdere etappes kan worden geamputeerd.
Let op: Knip niet het been te dicht bij het lichaam, omdat dit kan middendarm verontreiniging van de hemolymfe veroorzaken.
- Nadat het been of de benen worden afgesneden blijven voorzichtig druk uit te oefenen op dorsale gedeelte van de teek voor de hemolymfe uit afscheiden van de benen naar de dia. Beweeg de teek rond op de dia om de hemolymfe verspreiden.
2. Speekselklier verwijdering
(Movies 2 & 3)
- Spot een aantal van 25 pi zwembaden van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op een objectglaasje en plaats een vinkje in een van de PBS zwembaden.
- Bekijk de teek onder een stereomicroscoop (1X objectief, 10x oculair, 3,5 maal vergroot).
- Stabiliseer de teek met fijne tip tangs door te oordelen basis capitulum (monddelen) of de achterkant van de teek.
- Plaats de fijne tip pincet in de achterzijde van de teek en snijd de teek dorsum naar de organen bloot te leggen. Indien gewenst kan de middendarm kan worden verwijderd deze tijd en overgebracht naar een nieuwe groep PBS op een microscoopglaasje of een microfugebuis met PBS.
- Vind de paar speekselklieren (trosjes) gelegen bilateraal naast de benen van de teek. Als de speekselklieren niet zichtbaar zijn onder de teek puin verplaatst u de belangrijkste teek gedeelte, nog steeds met de speekselklieren, een nieuwe pool van PBS om de verstoring en het verlies van de speekselklieren te verminderen.
Opmerking: eerdere een voeding, de speekselklieren moeilijker te vinden, omdat zij niet zo ontwikkeld dat later in de voeding vergeleken.
- Verwijder de speekselklieren van de teek met fijne getipt pincet en plaats deze in een frisse pool van PBS.
- Wie fijne getipt tang de speekselklieren over te dragen aan een ander schoon 25 pi PBS zwembad, herhaalt u deze wasstap 3-4 keer om een externe micro-organismen en teken vuil te verwijderen.
Opmerking: voorzichtig Was de speekselklier clusters om het verlies en de verstoring van de afzonderlijke speekselklieren te verminderen.
- Plaats de klieren in een schone pool van PBS op een silaan gecoate dia of in een microfugebuis met PBS.
3. Speeksel collectie
(Film 4)
- Verwijder volwassen vrouwelijke teken van het konijn of een andere machine met behulp van fijne tip pincet net voor ze af te zetten volledig gezwollen, ongeveer 5-7 dagen na de bevestiging.
- Volg de bijna volgezogen teek op het ene uiteinde van een microscoop glijbaan met plakband. De tape moet ongeveer worden geplaatst ¾ van de weg omhoog dorsum van de teek in de richting van het hoofd, waardoor de teek basis capitulum (monddelen) blootgesteld.
- Wanneer de band het voorste rand van het teken dorsale zijde pipet 5 ul 5% pilocarpine oplossing (methanol) voldoet. Laat de tape om de pilocarpine kous over de teek dorsum, zonder dat de pilocarpine om in contact te komen met basis van de teek capitulum.
- Monteer een stuk van niet-toxische boetseerklei op de microscoopglaasje ongeveer een centimeter van monddelen van de teek.
- Met behulp van fijne getipt tang afbreken van de punt van een getrokken capillair 28 tot en met de gewenste diameter.
- Bekijk de teek de basis capitulum onder een stereomicroscoop.
- Voorzichtig te passen van de teek hypostome in de capillaire buis getrokken waardoor de maxillaire palpen te verblijven aan de buitenzijde van het capillair.
- Druk op de andere uiteinde van de capillaire buis in de boetseerklei van de capillaire buis zijn plaats te houden.
- Plaats de gemonteerde kwijlen teek in een donkere kamer met een hoge luchtvochtigheid (bijvoorbeeld een deksel piepschuim doos met natte pap ER handdoeken). Kantelen, zodat de schuif hypostome wijst op de bodem van de houder, waardoor de zwaartekracht om te helpen bij speeksel collectie.
- Plaats de container bij kamertemperatuur.
- Nauwlettend toezien op de kwijlen teken voor het eerste uur, en het verzamelen van speeksel als het wordt gegenereerd door het verdrijven van het uit de capillaire buizen met een Pasteur pipet lamp. Na de eerste uren, controleert accumulatie elk uur gedurende 4 uur. Blijf het speeksel als het wordt gegenereerd te verzamelen.
Let op: Speeksel overname kan worden gestopt zodra genoeg speeksel wordt verzameld voor de studie wordt uitgevoerd.
- Als de teken niet kwijlen of als er meer speeksel nodig is, speekselvloed kan soms worden opgewekt door gebruik te maken van de capillaire buis naar de hypostome masseren.
- Voeg 0,1 volumes van protease-remmer cocktail om het speeksel en bewaar bij -80 ° C totdat het nodig is.
4. Representatieve resultaten
e_content "> Movie 1 laat zien hoe u een gedeeltelijk gevoed I. scapularis nimf te houden en de benen amputeren om hemolymfe te verzamelen op een objectglaasje. Zodra het been of benen worden geamputeerd een heldere vloeistof wordt uitgescheiden (figuur 1A en 1B). Als de middendarm wordt verbroken de hemolymfe troebel wordt weergegeven zoals het is komt uit de geamputeerde been (s) (figuur 1C en 1D).De winning van speekselklieren na de nimf is voeding voor 48 of 72 uur wordt gedemonstreerd in filmpjes 2 en 3. Nadat de teek wordt aangeprikt is er over het algemeen een hoop puin (bestaande uit luchtpijp, buisjes van Malpighi, bloed, bindweefsel etc.), het verlies of verstoring van de speekselklieren te voorkomen gaan de teek een nieuwe pool van PBS. Figuren 2A en 2B laten zien waar de speekselklieren bevinden zich na de nimf is opengesneden en figuur 2C toont verwijderd speekselklier clusters in een pool van PBS.
Speeksel collectie opzetten van I. scapularis volwassen vrouwen i s getoond in film 4 en figuur 3. Een teek kwijlen in een capillaire buis wordt waargenomen in de film 5. Deze methode van speeksel collectie gebruikt pilocarpine om speekselvloed te stimuleren en kunnen oplevert ten opzichte van 20 ul van speeksel per volwassen vrouwelijke teek.
Figuur 1. Etiket structuren van een I. scapularis nimf.
Movie 1. Ixodes scapularis hemolymfe collectie. Klik hier om film te kijken .
Figuur 2. Niet-gecontamineerde (A & B) en verontreinigd (C & D) hemolymfe exsuderende uit het been van de nimf's.
Movie 2. Speeksel klier extractie uit een 48 uur na de maaltijd I. scapularis nimf.pload/3894/3894movie2.avi "> Klik hier om film te kijken.
Movie 3. Speeksel klier extractie uit een 72 uur na de maaltijd I. scapularis nimf. Klik hier om film te kijken .
Figuur 3. Ixodes scapularis nimf speekselklieren. (A & B) Voorbeelden van speekselklieren in een 72 uur na de maaltijd nimf, voorafgaand aan de extractie. (C) verwijderd speekselklier cluster.
Movie 4. Speeksel collectie opzetten van een volwassene I. scapularis vrouwelijke teek. Klik hier om film te kijken .
Figuur 4. Speeksel collectie van volwassen I. scapularis vrouwelijke ticks. (A en B) Kruis gemonteerd op een slede met hypostome in de uitgetrokken uiteinde van de capillair met unpulled uiteinde van de capillaire buis waarover klei. (C & D) bevochtigde kamer met kwijlen voor volwassenen I. scapularis vrouwelijke teken.
Movie 5. Ixodes scapularis vrouwelijke teek kwijlen in een capillair. Klik hier om film te kijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De collectie van teken hemolymfe, speekselklieren, en speeksel is van belang in de studie van door teken overgedragen pathogeen transmissie, prevalentie, verspreiding, proliferatie en persistentie in zowel de teek en de host 6,11-13,20,23,29. Er zijn verschillende manieren om een teek 30,31 ontleden. Echter, bij het verzamelen van de speekselklieren is het van cruciaal belang voor de teek ontleden goed, zodat de speekselklieren zijn niet gescheurd of verloren in overblijfselen van de teek. Als de speekselklieren worden verwijderd uit de teek ze moeten worden gewassen meerdere malen middendarm besmetting te verwijderen en kan worden bevestigd op een dia voor vlekken of grond in PBS om speekselklier-extract (SGE) te verkrijgen. SGE is gemakkelijker te dan speeksel en bezit eigenschappen vergelijkbaar met speeksel, dus kan worden gebruikt als alternatief speeksel. Echter SGE bevat extra eiwitten uit de speekselklieren cellen die niet aanwezig zijn in teken speeksel. De toevoeging van extra eiwitten SGE can be een voordeel of een nadeel, afhankelijk van de studie die wordt uitgevoerd, maar is iets wat een onderzoeker moet zich bewust zijn van bij het werken met SGE. SGE heeft het voordeel dat pilocarpine niet wordt gebruikt tijdens het verzamelen van speekselklieren. Pilocarpine, een muscarine cholinomimetische middel dat werkt als een agonist van de verlossing, is aangetoond dat een cytotoxisch effect op de B. hebben burgdorferi tijdens speeksel verzamelen 32,33. Dopamine is een agonist van speeksel maar wordt snel vernietigd door de hemolymfe en tick vloeistoffen, in vergelijking met pilocarpine dat een blijvende werking 33. Andere stimulerende technieken zijn onderzocht voor speeksel verzamelen en allen werden getoond aan de speeksel samenstelling 34 beïnvloeden.
Hemolymfe collectie kan moeilijk zijn omdat de teken bewegen en het kan problematisch zijn om ze te immobiliseren zonder open te barsten van de middendarm. Immobiliseren van de teek met dubbelzijdig tape is een optie, maar de hemolymfe kunnen verloren gaan op de band als de teek niet wordt verwijderd. Andere studies hebben verzameld hemolymfe van verschillende teken door het snijden van de teek de benen aan het distale gewrichten en het gebruik van centrifugatie om de hemolymfe verzamelen 16,35. Zodra hemolymfe collectie wordt beheerst de hemolymfe kan worden gebruikt om tick besmettelijkheid vast te stellen, schakelt u naar pathogeen interacties, en de migratie van pathogenen uit de middendarm van de speekselklieren.
Hoewel ons laboratorium richt zich op B. burgdorferi en I. scapularis teken, de technieken die in dit protocol kan worden gebruikt om andere door teken overgebrachte ziekteverwekkers te bestuderen en vink soorten. Bovendien kunnen deze technieken ook worden gebruikt op nimfen of volwassenen met relatief gemak. Met behulp van deze technieken met larve kan een uitdaging zijn door hun omvang. Tot de dissectie techniek onder de knie wordt voorgesteld om niet-geïnfecteerde teken te gebruiken. Het is ook belangrijk uit te oefenen de juiste bioveiligheid maatregelen bij het ontleden van infectiesTed of in het veld verzamelde teken. De methoden die in deze video-protocol kan worden gebruikt als richtlijnen voor het uitvoeren van dissecties tik en wat te zoeken bij het uitvoeren van deze technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de afdeling Vector-Borne Diseases Animal Resources Branch bedanken, in het bijzonder Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien, en John Liddell voor hun verzorging en het onderhoud van de muizen en konijnen. We willen ook graag naar Amy Ullmann, Theresa Russell, en Barbara J. Johnson bedanken voor hun bijdragen in de richting van dit manuscript. Tot slot willen we graag Alissa Eckert erkennen in het Bureau van de Associate Director voor Communicatie aan de CDC voor de productie van de grafische illustraties en Judy Lavelle voor het richten van alle wettigheid in verband met het filmen van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
References
- Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
- Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
- Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. Vector-host interactions in disease transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).
- Estrada-Pena, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).
- Nuttall, P. A. Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus. Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).
- Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. Enhancement of virus transmission by tick salivary glands. J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).
- Labuda, M., Nuttall, P. A. Tick-borne viruses. Parasitol. 129, 221-245 (2004).
- Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. Update on tick-borne bacterial diseases in Europe. Parasite. 16, 259-273 (2009).
- Zhang, L., et al. Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph. PLoS Pathog. 7, e1002079 (2011).
- Piesman, J., Schneider, B. S. Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks. Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Tick immunobiology. Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).
- Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo. Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).
- Nuttall, P. A., Labuda, M. Tick-host interactions: saliva-activated transmission. Parasitol. 129, 177-189 (2004).
- Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host. FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).
- Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis. Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).
- Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).
- Piesman, J. Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi. Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).
- De Silva, A. M., Fikrig, E. Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).
- Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Immunology of interactions between ticks and hosts. Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).
- Wikel, S. K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).
- Binnington, K. C., Kemp, D. H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).
- Guo, X., et al. Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).
- Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils. Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).
- Lima, C. M., et al. Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut. J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).
- Severinova, J., et al. Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice. Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).
- How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM (2009).
- Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts. Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).
- Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544 (2011).
- Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide. Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).
- Ledin, K. E., et al. Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum. Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).
- Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva? Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).
- Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods. J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).
- Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).
