Summary
La raccolta di emolinfa zecca infetta, ghiandole salivari, e la saliva è importante studiare come zecche patogeni causare la malattia. In questo protocollo si dimostra come raccogliere emolinfa ghiandole salivari e di nutrirsi
Abstract
Le zecche sono presenti in tutto il mondo e di affliggere gli esseri umani con molte malattie trasmesse da zecche. Le zecche sono vettori di agenti patogeni che causano la malattia di Lyme e zecche febbre ricorrente (Borrelia spp.), Febbre delle Montagne Rocciose (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosi (Ehrlichia chaffeensis e E. equi), anaplasmosi (Anaplasma phagocytophilum), encefalite (tick- virus dell'encefalite Borne), babesiosi (Babesia spp.), febbre tick Colorado (Coltivirus), e la tularemia (Francisella tularensis) 1-8. Per essere correttamente trasmessi nell'ospite questi agenti infettivi differenziale regolare l'espressione genica, interagiscono con le proteine zecca, e migrano attraverso il segno di spunta 3,9-13. Ad esempio, l'agente della malattia di Lyme, Borrelia burgdorferi, si adatta attraverso l'espressione genica differenziale alle fasi festa e la carestia del ciclo di leucosi della zecca 14,15. Inoltre, come una zecca Ixodes consumafarina di sangue Borrelia replicarsi e migrare dal midgut nel hemocoel, dove si spostano per le ghiandole salivari e vengono trasmessi nell'ospite con la saliva espulsi 9,16-19.
Come un segno di spunta alimenta l'host risponde in genere con una forte risposta immunitaria innata emostatico e 11,13,20-22. Nonostante queste risposte di accoglienza, I. scapularis può alimentare per diversi giorni, perché la saliva tick contiene proteine che sono immunomodulatori, agenti litici, anticoagulanti e fibrinolysins per aiutare il segno di spunta di alimentazione 3,11,20,21,23. Le attività immunomodulanti possedute dal saliva tick o estratti di ghiandola salivare (SGE) facilitare la trasmissione, la proliferazione e la diffusione di numerose zecche patogeni 3,20,24-27. Per capire meglio come zecche agenti infettivi causare la malattia è indispensabile analizzare attivamente l'alimentazione zecche e raccogliere la saliva tick. Questo protocollo video mostra tecniche di dissezione perla raccolta di emolinfa e la rimozione delle ghiandole salivari da attivamente alimentazione I. ninfe scapularis dopo 48 e 72 ore dopo il posizionamento del mouse. Dimostriamo anche il prelievo della saliva da una femmina adulta I. scapularis tick.
Protocol
1. Raccolta emolinfa per preparazione del vetrino
(Movie 1)
- Delicatamente rimuovere attivamente zecche alimentazione da un animale e posto in 3% di perossido di idrogeno topico per 5 minuti e poi in etanolo 70% per 10 minuti per sterilizzare superficie.
- Con una penna pap disegnare un cerchio su un vetrino da microscopio silano rivestito e mettere il segno di spunta all'interno del cerchio penna pap.
- Silano vetrini rivestiti vengono utilizzati per la migliore aderenza del emolinfa al vetrino da microscopio.
- Mostra il segno di spunta sotto un microscopio da dissezione (1X obiettivo, oculare 10X, ingrandimento 3,5 x).
- Premere delicatamente sul dorso della zecca con una pinzetta per le gambe splay della zecca e immobilizzare il segno di spunta.
Nota: Quando immobilizzare il segno di spunta non premere troppo forte perché questo può disturbare la midgut o forare il segno di spunta e contaminare l'emolinfa.
- Amputare la gamba della zecca o gambe °e giunto distale con una punta sottile bisturi monouso. Per determinare l'infettività via emolinfa solo 1 gamba deve essere amputata. Per la raccolta di emolinfa su un vetrino da più segmenti possono essere amputata.
Nota: Non tagliare la gamba troppo vicino al corpo, poiché ciò potrebbe causare la contaminazione del midgut emolinfa.
- Dopo la tappa o le gambe sono tagliate continuare ad applicare delicatamente pressione dorso della zecca per la emolinfa di secernere fuori le gambe sul vetrino. Muovete il segno di spunta intorno sulla diapositiva per diffondere la emolinfa.
2. La rimozione della ghiandola salivare
(Film 2 & 3)
- Spot più 25 piscine microlitri di tampone fosfato (PBS) su un vetrino da microscopio e mettere un segno di spunta in una delle piscine PBS.
- Mostra il segno di spunta sotto un microscopio da dissezione (1X obiettivo, oculare 10X, ingrandimento 3,5 x).
- Stabilizzare la zecca con pinza a punta sottiles tenendo la base capitulum (apparato boccale) o la parte posteriore della zecca.
- Inserire le pinze belle punte nella parte posteriore della zecca e tagliare la zecca dorso per esporre gli organi. Se desiderato il midgut può essere rimosso in questo momento e trasferito a un pool di PBS fresco su un vetrino da microscopio o una provetta da microcentrifuga contenente PBS.
- Trova la coppia di ghiandole salivari (grappoli) situati bilateralmente lungo le gambe della zecca. Se le ghiandole salivari non sono visibili tra le macerie spunta spostare la parte principale segno di spunta, contenente ancora le ghiandole salivari, a un pool fresco di PBS per ridurre la rottura e la perdita delle ghiandole salivari.
Nota: precedenti in una alimentazione, le ghiandole salivari sono più difficili da individuare perché non sono come sviluppato rispetto a seguito in alimentazione.
- Rimuovere le ghiandole salivari della zecca con una pinza a punta fine e posto in una piscina fresca di PBS.
- With bella mancia pinza trasferire le ghiandole salivari a un altro pulito piscina di 25 microlitri di PBS, ripetere questo passaggio di lavaggio 3-4 volte di più per eliminare eventuali microrganismi esterni e detriti tick.
Nota: Lavare i grappoli delle ghiandole salivari delicatamente per ridurre la perdita e la rottura delle singole ghiandole salivari.
- Mettere le ghiandole in una piscina pulita di PBS in una diapositiva silano rivestito o in una provetta da microcentrifuga contenente PBS.
3. Saliva di raccolta
(Movie 4)
- Rimuovere delicatamente le zecche femmine adulte dal coniglio o di un altro host utilizzando una pinza a punta fine poco prima di cadere completamente off ingorgati, i giorni circa 5-7 post-attacco.
- Rispettare il segno di spunta quasi engorged su un'estremità di un vetrino da microscopio con lo scotch. Il nastro deve essere posizionato a circa ¾ della salita dorso della zecca verso la testa, lasciando capitulum base della zecca (apparato boccale) esposta.
- Quando il nastro incontra il bordo anteriore della superficie dorsale pipetta zecche 5 pl di soluzione di pilocarpina 5% (in metanolo). Lasciare che il nastro stoppino della pilocarpina sul dorso di zecca, senza che il pilocarpina a venire in contatto con capitulum base della zecca.
- Montare un pezzo di non-tossico plastilina sul vetrino di circa un pollice dal boccale della zecca.
- Utilizzando belle pinze punta rompere la punta di un tubo capillare tirato 28 al diametro desiderato.
- Visualizza capitulum base della zecca sotto un microscopio da dissezione.
- Inserire delicatamente ipostoma della zecca nel tubo capillare tirato permettendo ai palpi mascellari di risiedere al di fuori del tubo capillare.
- Premere l'estremità opposta del tubo capillare nel plastilina per tenere il tubo capillare in posizione.
- Mettere il segno di spunta montato la salivazione all'interno di una camera oscura con umidità elevata (ad esempio, una scatola con coperchio di polistirolo rivestiti con pap bagnato asciugamani er). Inclinare il vetrino in modo i punti ipostoma al fondo del contenitore, permettendo la gravità per aiutare nella saliva raccolta.
- Posizionare il recipiente a temperatura ambiente.
- Monitorare attentamente le zecche acquolina in bocca per la prima ora, e raccogliere la saliva in quanto è generato da espellendo fuori dei tubi capillari con una lampadina pipetta Pasteur. Dopo la prima ora, controllare accumulo ogni ora per almeno 4 ore. Continua a raccogliere la saliva come viene generato.
Nota: l'acquisizione di saliva può essere fermata una volta abbastanza saliva viene raccolto per lo studio in corso di esecuzione.
- Se le zecche non sono la salivazione o se più saliva è necessario, salivazione può occasionalmente essere indotta tramite il tubo capillare per massaggiare il ipostoma.
- Aggiungere 0,1 volumi di cocktail inibitore di proteasi per la saliva e conservare a -80 ° C fino a quando necessario.
4. Risultati rappresentativi
e_content "Movie> 1 dimostra come tenere una ninfa parzialmente alimentato I. scapularis e amputare le gambe per raccogliere emolinfa su un vetrino da microscopio. Una volta che la gamba o gambe amputate un liquido chiaro viene secreto (figura 1A e 1B). Se il midgut si rompe la emolinfa appare torbido come è esce l'arto (s) (figura 1C e 1D).L'estrazione delle ghiandole salivari dopo la ninfa è stata l'alimentazione per 48 o 72 ore è dimostrato nei film 2 e 3. Dopo il segno di spunta viene forato vi è generalmente un sacco di detriti (composto da trachea, Malpighi tubuli, sangue, tessuto connettivo, ecc), per prevenire la perdita o distruzione delle ghiandole salivari spostare il segno di spunta a un pool fresco di PBS. Le figure 2A e 2B mostrano dove si trovano le ghiandole salivari dopo che la ninfa è stato tagliato aperto e la figura 2C mostra rimosso cluster delle ghiandole salivari in una pozza di PBS.
Saliva la raccolta istituito dalla I. femmine adulte scapularis i s mostrato in film 4 e figura 3. Un segno di spunta la salivazione in un tubo capillare si osserva nel film 5. Questo metodo di raccolta saliva pilocarpina utilizzato per stimolare la salivazione e può produrre più di 20 pl di saliva per adulto tick femmina.
Figura 1. Strutture etichetta di una ninfa scapularis I..
Movie 1. Raccolta emolinfa Ixodes scapularis. Clicca qui per guardare film .
Figura 2. Incontaminata (A & B) e contaminati (C & D) emolinfa che trasuda dalla gamba della ninfa.
Movie 2. L'estrazione della ghiandola salivare da una 48 ore Fed I. ninfa scapularis.pload/3894/3894movie2.avi "> Clicca qui per guardare film.
Movie 3. L'estrazione della ghiandola salivare di 72 ore da un nutrito I. ninfa scapularis. Clicca qui per guardare film .
Figura 3. Ixodes scapularis ninfa ghiandole salivari. (A & B) Esempi di ghiandole salivari di una 72 ore alimentato ninfa, prima dell'estrazione. (C) Rimosso cluster di ghiandola salivare.
Saliva Movie 4. Di raccolta istituiti a da un adulto I. scapularis tick femminile. Clicca qui per guardare film .
Figura 4. Prelievo della saliva da adulto I. scapularis t femminiliicks. (A e B) Spuntare montato su una slitta con ipostoma alla fine tirato del tubo capillare con l'estremità unpulled del tubo capillare tenuto da plastilina. (C & D) camera umidificata contenente la salivazione adulti I. scapularis zecche femminili.
Movie 5. Scapularis zecche Ixodes femminile acquolina in bocca in un tubo capillare. Clicca qui per guardare film .
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Discussion
La raccolta di emolinfa tick, ghiandole salivari, e la saliva è importante nello studio delle zecche trasmissione dei patogeni, la prevalenza, la diffusione, la proliferazione, e la persistenza sia il segno di spunta e l'host 6,11-13,20,23,29. Ci sono diversi modi per sezionare un segno di spunta 30,31. Tuttavia, quando la raccolta delle ghiandole salivari è fondamentale per analizzare correttamente il segno di spunta in modo che le ghiandole salivari non sono rotti o persi nei resti della zecca. Una volta che le ghiandole salivari sono rimossi dal tick hanno bisogno di essere lavati più volte per eliminare la contaminazione midgut e quindi può essere fissato su un vetrino per la colorazione o terreno in PBS per ottenere l'estratto della ghiandola salivare (SGE). SGE è più facile da raccogliere rispetto saliva e possiede caratteristiche simili a saliva, pertanto, può essere usato come alternativa saliva. Tuttavia, SGE contiene proteine addizionali provenienti dalle cellule di ghiandole salivari che non sono presenti nella saliva tick. L'aggiunta di proteine supplementari in SGE can be un vantaggio o uno svantaggio a seconda dello studio in corso di esecuzione, ma è qualcosa che un ricercatore ha bisogno di essere a conoscenza di quando si lavora con SGE. SGE ha il vantaggio che pilocarpina non viene utilizzato durante la raccolta delle ghiandole salivari. Pilocarpina, un agente muscarinico colinomimetico che agisce come un agonista di salvezza, ha dimostrato di avere un effetto citotossico sulle B. burgdorferi durante la raccolta della saliva 32,33. La dopamina è un altro agonista di salivazione ma è rapidamente distrutto dal emolinfa e altri fluidi zecche, rispetto a pilocarpina che ha un effetto prolungato 33. Altre tecniche di stimolazione sono stati esplorati per la raccolta della saliva e tutti hanno dimostrato di influire sulla composizione salivare 34.
Raccolta emolinfa può essere difficile perché le zecche sono in movimento e può essere problematico per immobilizzare senza rottura del midgut. Immobilizzare la zecca con nastro biadesivo è un'opzione, ma il hemolinfa può essere persi sul nastro se la zecca non viene rimossa. Altri studi hanno raccolto emolinfa dalle zecche diverse tagliando le gambe della zecca a livello delle articolazioni distali e l'utilizzo di centrifugazione per raccogliere l'emolinfa 16,35. Una volta raccolta emolinfa è imparato l'emolinfa può essere utilizzato per determinare l'infettività Tick, Tick alle interazioni patogeno, e la migrazione degli agenti patogeni dal midgut alle ghiandole salivari.
Sebbene l'attenzione il nostro laboratorio è in B. burgdorferi e I. scapularis zecche, le tecniche di cui al presente protocollo può essere utilizzato per studiare altri agenti infettivi trasmesse da zecche e barrare la casella specie. Inoltre, queste tecniche possono essere utilizzati anche su ninfe o adulti con relativa facilità. Usando queste tecniche con larva potrebbe essere difficile a causa delle loro dimensioni. Fino a quando la tecnica è padroneggiata dissezione si consiglia di utilizzare le zecche infette. E 'anche importante per esercitare le opportune misure di biosicurezza, quando la dissezione infezioniTed o raccolti sul campo zecche. I metodi in questo protocollo il video possono essere utilizzati come linee guida su come effettuare dissezioni zecche e cosa cercare durante l'esecuzione di queste tecniche.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la Divisione di Vector-Borne Diseases Branch Animal Resources, in particolare Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien e John Liddell per la loro cura e manutenzione dei topi e conigli. Vorremmo anche ringraziare Amy Ullmann, Theresa Russell, e Barbara J. Johnson per il loro contributo verso questo manoscritto. Infine, vorremmo riconoscere Alissa Eckert presso l'Ufficio del Direttore Associato per la Comunicazione presso il CDC per la produzione di illustrazioni grafiche e Judy Lavelle per dirigere tutti gli aspetti legali connessi con le riprese di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
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