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Immunology and Infection

Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

Published: February 21, 2012 doi: 10.3791/3894
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Microbiology and Pathogenesis Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 2Tick-Borne Diseases Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Summary

감염된 진드기의 hemolymph, 침샘, 그리고 타액의 컬렉션 병원균이 질병을 일으킬 방법 진드기 매개로 공부하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는 먹이로부터 hemolymph과 침샘을 수집하는 방법을 보여줍니다

Abstract

진드기는 전세계 찾은 많은 진드기 매개로 질병으로 인간을 괴롭히다하고 있습니다. 진드기 라임 병 및 진드기 매개로 회귀열 (Borrelia SPP.), 록키 마운틴 뇌척수 막염 (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis와 E 동등), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), 뇌염 (똑딱똑딱의 원인 병원체에 대한 벡터입니다 매개 뇌염 바이러스), babesiosis (Babesia SPP.), 콜로라도 진드기 열 (Coltivirus) 및 tularemia (Francisella tularensis) 1-8. 제대로 호스트로 전송하기 위해서는 이러한 전염성 요원들은 differentially, 유전자 발현을 조절 진드기 단백질과 상호 작용하고, 진드기 3,9-13을 통해 마이 그 레이션. 예를 들어, 라임 병 에이전트, Borrelia burgdorferi는 진드기의 enzootic 사이클 14,15의 향연과 기근 단계로 차등 유전자 발현을 통해 적응. 또한, Ixodes의 진드기와 같은가를 소비bloodmeal Borrelia은 복제 및 midgut에서 그들이 침샘을 여행하고 퇴학 타액 9,16-19있는 호스트로 전송될 hemocoel,로 마이 그 레이션.

진드기는 피드로서 호스트는 일반적으로 강한 hemostatic와 타고난 면역 반응 11,13,20-22로 응답합니다. 이러한 호스트 반응에도 불구하고, 전 진드기의 타액은 3,11,20,21,23 먹이 진드기들을위한 immunomodulatory있는 단백질, lytic 대리인, anticoagulants 및 fibrinolysins가 포함되어 있기 때문에 scapularis는 몇 일 동안 먹을 수 있습니다. 진드기의 타액이나 침샘 추출물 (SGE)에 의해 점령 immunomodulatory 활동이 많은 진드기 매개로 병원균 3,20,24-27의 전염, 확산 및 보급을 촉진. 더 이상 그것이 진드기 먹이 적극적으로 해부하고 진드기의 타액을 수집하는 데 필수적이며 전염성 요원들이 질병을 일으킬 방법 진드기 매개로 이해하기 위해서. 이 비디오 프로토콜에 대한 해부 기술을 보여줍니다hemolymph의 수집 및 적극적 나도 먹이로부터 침샘의 제거 scapularis nymphs 48 후 72 시간 포스트 마우스 배치. 우리는 또한 성인 여성 I.에서 타액 수집을 보여줍니다 scapularis 눈금.

Protocol

1. 슬라이드 준비 Hemolymph 컬렉션

(동영​​상 1)

  1. 부드럽게 표면이 멸균을 위해 10 분간 70 % 에탄올에 나서 5 분 3퍼센트 국소 과산화수소의 동물과 장소에서 적극적으로 먹이 진드기를 제거합니다.
  2. 자궁 펜은 실란 코팅 현미경 슬라이드에 동그라미를 그려와 자궁 펜 서클 내에서 움직이게 장소.
    1. 실란 코팅 슬라이드는 현미경 슬라이드에 hemolymph 최고의 준수를 위해 사용됩니다.
  3. 해부 현미경 (1X 목적, 10X 접안 렌즈, 3.5X 배율)에서 진드기를 볼 수 있습니다.
  4. 부드럽게 진드기의 다리를 넓히다하고 움직이게 고정하기 위해 집게로 진드​​기의 dorsum 아래로 밀어.

참고 :이 midgut 또는 주사를 움직이게 방해하고 hemolymph을 오염시킬 수 있기를 움직이게 immobilizing가 너무 열심히 누르지 때.

  1. 일시 진드기의 다리 또는 다리를 절단일회용 메스 벌금 포인트와 전자 말초 관절. 감염을 확인하려면 hemolymph 통해 불과 1 다리는 절단해야합니다. 슬라이드에 hemolymph를 수집 몇 다리를 잘라야 수 있습니다.

참고 :이 hemolymph의 midgut 오염을 일으킬 수 있기 때문에 몸 가까이에 다리를 절단하지 마십시오.

  1. 다리 또는 다리가 절단되고 나면 부드럽게 슬라이드를 향해 다리를 밖으로 분비하는 hemolymph 위해 진드기의 dorsum에 압력을 적용하는 것을 계속한다. 부드럽게 hemolymph을 확산하기 위해 슬라이드에 주위를 움직이게 이동합니다.

2. 침샘 제거

(영화 2 및 3)

  1. 인산염의 명소 몇 25 μl 수영장 현미경 슬라이드 위에 식염수 (PBS)를 버퍼와 PBS의 수영장 중 하나에 진드기를 놓습니다.
  2. 해부 현미경 (1X 목적, 10X 접안 렌즈, 3.5X 배율)에서 진드기를 볼 수 있습니다.
  3. 미세 스쳐 forcep과 진드기를 안정화기준 capitulum (입 부분)이나 진드기의 후면을 개최하여의.
  4. 진드기의 후면에 벌금 스쳐 포셉를 삽입하고 진드기가 장기를 노출 dorsum있어 최대 썰어. 원하는 경우 midgut이 시간에 제거하고 현미경 슬라이드에 PBS의 신선한 수영장 또는 PBS를 포함 microfuge 튜브로 전송할 수 있습니다.
  5. 양자 진드기의 다리 옆에 위치한 침샘 (포도 같은 클러스터)의 쌍을 찾아보십시오. 침샘은 진드기의 잔해가 침샘의 파괴와 손실을 줄이기 위해 PBS의 신선한 풀에 여전히 침샘을 포함하는, 주요 진드기 부분을 이동 사이에서 볼 수없는 경우.

참고 : 이전 먹이에 침샘에 오신 것을 나중에 먹이의에 비해 그들로 개발되지 않았기 때문에 찾을 어렵습니다.

  1. 미세 스쳐 포셉와 PBS의 신선한 수영장에서 장소와 진드기의 침샘을 제거합니다.
  2. 무선좋은 일은 포셉 어떤 외부 미생물과 진드기의 부스러기를 제거하려면이 세차 스텝에게 3-4 번 이상을 반복, 또 다른 깨끗한 25 μl PBS 수영장으로 침샘을 전송 줬지.

참고 : 각각의 침샘의 손실과 혼란을 줄이기 위해 부드럽게 침샘 클러스터를 씻으십시오.

  1. 실란 코팅 슬라이드에 PBS의 깨끗한 수영장으로 또는 PBS를 포함 microfuge 관의 분비를 놓습니다.

3. 침이 수집

(영화 4)

  1. 부드럽게 토끼 또는 완전히 부풀어 오른 그들이 내려준 직전 벌금 스쳐 포셉, 약 5~7일 후 첨부 파일을 사용하여 다른 호스트에서 성인 여성의 진드기를 제거합니다.
  2. 스카치 테이프와 현미경 슬라이드의 한쪽 끝을 향해 거의 부풀어 오른 무슨일을 준수합니다. 테이프는 대략 위치해야 일정한 머리쪽으로 진드기의 dorsum까지 방식 때문에, 진드기의 기준 capitulum (입 부분)가 노출 떠난다.
  3. 테이프가 5 % pilocarpine 솔루션의 진드기 등 부분의 표면 pipet 5 μl (메탄올에서)의 앞부분은 가장자리를 만나는 곳. 테이프가 pilocarpine은 진드기의 기준 capitulum 접촉 수없이 진드기의 dorsum 이상 pilocarpine을 심하도록 허용합니다.
  4. 현미경 슬라이드를 향해 무독성 모델링 찰흙 조각 진드기의 mouthparts에서 약 1 인치를 탑재합니다.
  5. 좋은 스쳐 포셉 원하는 직경으로 뽑았 모세관 28 팁을 끊다 사용합니다.
  6. 해부 현미경 진드기의 기준 capitulum를 볼 수 있습니다.
  7. 부드럽게 상악 palps는 모세관 튜브의 외부에있는 수 있도록 뽑아 모세관으로 진드기의 hypostome 맞네요.
  8. 모세관 장소에서 잡고 모델링 찰흙으로 모세관 튜브의 반대쪽 끝을 누르십시오.
  9. 높은 습도 (예, 젖은 아빠 줄지어 lidded 스티로폼 상자와 어두운 챔버 내부에 탑재된 침 진드기를 배치 어 수건). 중력이 타액 수집을 도울 수 있도록 hypostome 점 때문에 컨테이너의 하단에 슬라이드를 기울이십시오.
  10. 상온에서 컨테이너를 배치합니다.
  11. 밀접하게 1 시간 침 진드기를 모니터링하고, 그것이 파스퇴르의 pipet 벌브와 모세관 튜브 밖으로 추방에 의해 생성되기 때문에 타액을 수집합니다. 첫 번째 시간 후 최소 4 시간 동안 축적 매 시간을 확인합니다. 그것이 생성되기 때문에 타액을 수집하기 위해 계속합니다.

참고 : 충분한 타액이 수행되고있는 연구를 위해 수집되면 타액 수집이 중지됩니다.

  1. 진드기 침되지 않는 이상 타액이 필요할 경우, 타액의 분비는 가끔 hypostome 마사지하는 모세관 튜브를 사용하여 유도된 수있다면.
  2. 필요한 ° C까지 -80시 타액과 저장소에 테아제 억제제 칵테일의 0.1 볼륨을 추가합니다.

4. 대표 결과

e_content은 "> 영화 1은 부분적으로 싫증이 난 scapularis 요정을 보유하고 현미경 슬라이드에 hemolymph를 수집하기 위해 다리를 절단하는 방법을 보여줍니다. 다리 또는 다리가 맑은 액체가 (그림 1A와 1B) 분비되어 절단되면. 경우 midgut hemolymph 그것이 그대로 흐린 나타나는 절단 다리 (들) (그림 1C 및 1D)로 나오는 파열된다.

요정 48 또는 72 시간 동안 수유 후에도 침샘의 추출이 영화는 2와 3에서 증명된다. 진드기가 파편이 많이 일반적으로이 구멍되면 (기관, malpighian tubules, 혈액 구성되어, 결합 조직 등) 침샘의 손실이나 파괴를 방지하기는 PBS의 신선한 풀에 진드기 이동합니다. 요정이 오픈 컷 후 침샘이있는 그림 2A와 2B 쇼와 그림 2C는 PBS의 수영장에 침샘 클러스터를 제거 보여줍니다.

침이 컬렉션 전에서 설정 scapularis 성인 여성 전 s의 영화 4 그림 3. 모세관 튜브에 침 진드기가 영화 5에서 관찰된다. 타액의 분비를 자극하고, 성인 여성 진드기 당 타액의 20 μl를 통해 얻을 수있는 pilocarpine를 사용한 타액 수집이 메서드는.

1 그림.
그림 1. I.의 scapularis의 요정의 라벨 구조.

영화 1. Ixodes scapularis hemolymph 컬렉션은. 영화를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2.
그림 2. 오염 (& B)와 요정의 다리에서 exuding (C & D) hemolymph를 오염.

48시간 먹이기 전의 영화 2. 침샘 추출 scapularis 요정.pload/3894/3894movie2.avi은 "> 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.

72시간 먹이기 전의 영화 3. 침샘 추출 scapularis 요정. 영화를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3.
그림 3. Ixodes scapularis 요정 침샘. (& B)를 사전에 추출에 72시간 수사관 요정의 침샘의 예. (C) 침샘 클러스터를 삭제했습니다.

영화 4. 침이 컬렉션은 성인 전에서 설정 scapularis 여성 눈금. 영화를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .

4 그림.
성인 전에서 그림 4. 타액 수집 scapularis여 ticks. (& B) 모델링 클레이 주최 모세관 튜브의 unpulled 끝에있는 모세관 튜브 뽑아 결국 그 hypostome있는 슬라이드 마운트 틱. (C & D) 침 성인 전을 포함한 Humidified 챔버 scapularis 여성 가고 있습니다.

영화 5. 모세관 튜브에 침 scapularis 여성 무슨일을 Ixodes. 영화를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

진드기의 hemolymph, 침샘, 그리고 타액의 컬렉션 진드기 매개로 병원체 전송 연구에 중요하다, 유행, 보급, 확산, 그리고 진드기 및 호스트 6,11-13,20,23,29 모두에서 끈기. 진드기 30,31 해부하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 그러나 침샘을 수집했을 때 제대로 때문에 침샘이 파열이나 진드기의 유골이 안되는 진드기를 해부하는 것이 중요합니다. 침샘들이 midgut 오염을 제거하고 침샘 추출물 (SGE)을 구하는 PBS의 염색법이나 그라운드에 대한 슬라이드로 해결할 수 있습니다 여러 번 씻어해야 진드기 제거하고 나면. SGE는 타액보다 수집하는 것이 더 쉽습니다 그리고 타액과 비슷한 특성을 가지고 있으므로, 그것은 타액 대안으로 사용할 수 있습니다. 그러나, SGE은 진드기의 타액에 존재하지 않습니다 침샘 세포에서 발생하는 추가적인 단백질이 포함되어 있습니다. SGE CAN B의 여분의 단백질뿐만 아니라E 장점이나 수행중인 연구에 따라 단점이 있지만,이 연구는 SGE 작업 때 알고 있어야 하는거에요. SGE는 pilocarpine은 침샘의 수집 중에 사용되지 않는 장점을 지니고 있습니다. Pilocarpine, 구원의 작용제 역할 muscarinic cholinomimetic 요원이 B에 대한 세포 독성 효과를 보여왔다 타액 수집 32,33 동안 burgdorferi. 도파민은 타액의 분비의 또 다른 작용제이지만 빠르게 hemolymph 및 기타 진드기의 체액에 의해 파괴되는 등 지속적인 효과 33 가지고 pilocarpine에 비해. 기타 stimulatory 기술은 타액 수집에 대해 살펴되었으며 모두 침의 성분 34에 영향을 표시했다.

진드기가 이사하고 midgut을 rupturing 않고 그들을 고정하는 문제가 될 수 있기 때문에 Hemolymph 컬렉션은 어려울 수 있습니다. 이중 양면 테이프를 움직이게 Immobilizing 택할 수 있지만, hemo입니다진드기가 제거되지 않은 경우 림프가 테이프에 손실될 수 있습니다. 다른 연구는 말초 관절에 진드기의 다리를 절단하고 hemolymph에게 16,35를 수집하는 원심 분리를 사용하여 여러 진드기로부터 hemolymph를 수집 하였다. hemolymph 모음 hemolymph이 진드기의 감염을 결정하는 데 사용할 수있는 마스터되면, 병원체 상호 작용에 틱, 그리고 침샘에 midgut에서 병원균의 마이 그 레이션.

저희 연구실의 초점은 B에있다지만 burgdorferi과 나 scapularis 진드기,이 프로토콜에 언급된 기술은 다른 틱을 매개로 감염 에이전트를 연구하고 종족을 체크하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 기술은 상대적으로 쉽게 nymphs 또는 성인에서도 사용할 수 있습니다. 애벌레와 함께 이러한 기술을 사용하면 자신의 크기에 의해 도전받을 수 있습니다. 절개 기법을 마스터 때까지 그것은 감​​염되지 않은 진드기를 사용하도록 권장합니다. infec을 해부 때 적절한 biosafety 조치를 발휘하는 것도 중요하다테드이나 필드는 진드기를 수집했습니다. 이 비디오 프로토콜의 방식은 진드기의 해부과 이러한 기술을 수행할 때 살펴봐야 할 사항을 수행하는 방법에 대한 지침으로 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

우리는 공개 할게 없다.

Acknowledgments

저자는 벡터 매개로 질환 동물 리소스 지점 부문 감사드립니다, 특히 안드레아 피터슨, 리사 Massoudi, Verna 오브라이언, 그리고 생쥐와 토끼들의 관심과 유지 보수를위한 존 Liddell. 우리는 또한이 원고 향한 그들의 공헌에 대해 에이미 Ullmann, 테레사 러셀, 그리고 바바라 J. 존슨 감사드립니다. 마지막으로, 우리는이 원고의 촬영과 관련된 모든 위법를 찍는 동안 그래픽 삽화와 주디 Lavelle를 생산 CDC에서 커뮤니케이 션을위한 준회원 이사의 사무실에 Alissa Eckert을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H312-500
Ethanol Acros Organics 61509-5000
PBS Boston Bioproducts BM-2205
Dumont Fine forceps (3C) Fisher Scientific NC9906085
Silane treated microscope slides Bioworld 42763007-1
Pap pen Bioworld 21750008-1
Super frost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-18
Pilocarpine Sigma-Aldrich P6503-5G
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714
#11 disposable scalpel Feather Safety Razor Co, Ltd. 2975#11
Nontoxic modeling clay Fisher Scientific S17307
Capillary tubes Chase Scientific Glass, Inc. 40A502

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References

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Patton, T. G., Dietrich, G., Brandt, K., Dolan, M. C., Piesman, J., Gilmore Jr., R. D. Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks. J. Vis. Exp. (60), e3894, doi:10.3791/3894 (2012).

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