Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Published: February 21, 2012 doi: 10.3791/3894
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Microbiology and Pathogenesis Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 2Tick-Borne Diseases Activity, Bacterial Diseases Branch, Division of Vector-Borne Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Summary

Коллекция инфицированных гемолимфы клещей, слюнные железы, и слюна важно изучить, как клещевой патогенов вызывает болезни. В этом протоколе мы показали, как собирать гемолимфы и слюнных желез от кормления

Abstract

Клещи встречаются по всему миру и страдают люди с большим количеством клещевой болезни. Клещи являются переносчиками возбудителей, которые вызывают болезнь Лайма и клещевого возвратного тифа (Borrelia SPP.), Пятнистая лихорадка Скалистых гор (Rickettsia rickettsii), эрлихиоза (Ehrlichia chaffeensis и Е. рав), анаплазмоза (Anaplasma phagocytophilum), энцефалит (клещевой вируса клещевого энцефалита), бабезиоз (Babesia sрр.), штат Колорадо, тик лихорадка (Coltivirus) и туляремии (Francisella tularensis) 1-8. Чтобы быть правильно переданы в принимающих эти инфекционные агенты дифференциально регулируют экспрессию генов взаимодействуют с белками тик, и мигрируют через клещей 3,9-13. Например, агент болезни Лайма, Borrelia burgdorferi, адаптируется через дифференциальное выражение гена на праздник и голод этапах энзоотический цикл клеща 14,15. Кроме того, как тик Ixodes потребляетbloodmeal Borrelia копировать и переносить из кишки в hemocoel, где они путешествуют в слюнных железах и передаются на хост с изгнанным слюны 9,16-19.

Как галочку кормит хозяин обычно реагирует с сильными кровоостанавливающее и врожденного иммунного ответа 11,13,20-22. Несмотря на это множество ответов, I. scapularis может питаться в течение нескольких дней, потому что тик слюна содержит белки, иммуномодулирующее, литические средства, антикоагулянты, и fibrinolysins помочь клеща кормления 3,11,20,21,23. Иммуномодулирующее деятельности обладает слюна тик или слюнных желез экстракт (ПОС) содействие передаче, распространению и распространение многочисленных клещевых патогенов 3,20,24-27. Чтобы еще больше понимаю, как клещевой инфекционные агенты вызывают заболевания важно анализировать активно кормятся и собирают клещей тик слюны. Это видео демонстрирует протокол вскрытия методыКоллекция гемолимфы и удаления слюнных желез от активного кормления I. scapularis нимф после 48 и 72 часов после размещения мыши. Мы также продемонстрировать коллекцию слюны из взрослой самки I. scapularis тик.

Protocol

1. Гемолимфы коллекцию слайдов подготовки

(Фильм 1)

  1. Аккуратно снимите активно кормятся клещей от животных и места в 3% перекиси водорода актуально в течение 5 минут, а затем в 70% этаноле в течение 10 минут, чтобы поверхность стерилизуют.
  2. С мазок перо нарисуйте круг на силана покрытием предметное стекло и поместите клеща в кругу перо бум.
    1. Силан покрытием слайды служат для лучшего сцепления гемолимфы на предметное стекло микроскопа.
  3. Просмотр клеща под микроскопом рассечения (1X цель, 10X окуляр, 3.5X увеличение).
  4. Аккуратно надавите на спинку клеща пинцетом, чтобы вывихнуть ноги клеща и парализовать клеща.

Примечание: При иммобилизации клеща не нажимайте слишком сильно, поскольку это может нарушить кишки или проколоть клеща и загрязнять гемолимфы.

  1. Ампутировать ногу клеща или ноги в гоэлектронной дистального с тонкой точке одноразовых скальпеля. Для определения инфекционной через гемолимфы только 1 нога должна быть ампутирована. Для сбора гемолимфы на слайде несколько ног может быть ампутирована.

Примечание: Не обрезайте ноги слишком близко к телу, потому что это может привести к кишки загрязнения гемолимфы.

  1. После того, как нога или ноги сократить продолжать мягко надавите на спинку клеща для гемолимфы выделять из ног на слайде. Осторожно двигаться вокруг клеща на слайде для распространения гемолимфы.

2. Слюнные железы удаление

(Фильмы 2 и 3)

  1. Пятно несколько 25 мкл пула фосфатным буферным раствором (PBS) на предметном стекле микроскопа и поставьте галочку в одном из бассейнов PBS.
  2. Просмотр клеща под микроскопом рассечения (1X цель, 10X окуляр, 3.5X увеличение).
  3. Стабилизация клеща с прекрасным наконечником forcepс путем проведения основе головка (рот части) или задней части клеща.
  4. Вставьте тонкий пинцет наконечником в задней части клеща и нарезать клеща спинку, чтобы разоблачить органов. При желании кишки могут быть удалены в это время и переданы в бассейн с пресной ФСБ на предметном стекле микроскопа или микроцентрифужную трубки, содержащей PBS.
  5. Найти пару слюнных желез (виноградных, как кластеры), расположенный рядом с двусторонней ноги клеща. Если слюнные железы не видны среди клещей мусора переместить основную часть клеща, еще содержащие слюнные железы, в бассейн с пресной ФСБ уменьшить разрушение и потеря слюнных желез.

Примечание: В начале кормления, слюнных желез труднее найти, потому что они не так развита, по сравнению с позже в питании.

  1. Удалить из слюнных желез клеща с прекрасным наконечником щипцы и место в бассейн с пресной ФСБ.
  2. Wiя прекрасно чаевые пинцет передать слюнных желез в другой чистый бассейн 25 мкл PBS, повторите этот шаг мыть 3-4 раза, чтобы удалить любые внешние микроорганизмов и клещей мусора.

Примечание: Вымойте слюнных желез кластеров осторожно, чтобы уменьшить потери и разрушения отдельных слюнных желез.

  1. Поместите железы в чистый бассейн ФСБ по силана покрытием слайдов или в микроцентрифуге трубки, содержащей PBS.

3. Слюна коллекции

(Movie 4)

  1. Аккуратно снимите взрослой самки клещей из кролика или другому хосту с использованием тонких наконечником щипцы просто, прежде чем они уходят полностью набухают, примерно через 5-7 дней после вложения.
  2. Придерживайтесь почти наполненный тик на одном конце предметное стекло микроскопа скотчем. Ленты должны быть размещены примерно три четверти пути до спинки клеща к голове, оставляя основу головка клеща (рот части) подвергается.
  3. Если лента отвечает передний край клещей спинной поверхности пипеткой 5 мкл 5% пилокарпин раствор (в метаноле). Дайте ленты для отвода пилокарпин за клеща спины, не позволяя пилокарпин войти в контакт с основой головка клеща.
  4. Установить часть нетоксичных пластилина на предметном стекле микроскопа около одного дюйма от ротового клеща.
  5. Использование тонкой наконечником щипцы разорвать кончиком вытащил капиллярной трубке 28 до желаемого диаметра.
  6. Просмотр основе головка клеща под микроскопом рассечения.
  7. Осторожно подходить гипостомы клеща в потянул капиллярная трубка позволяет челюстных щупальцах находиться на внешней стороне капилляра.
  8. Нажмите на противоположном конце капилляра в пластилин провести капиллярная трубка на месте.
  9. Поместите установлен слюнотечение тик в темной комнате с повышенной влажностью (например, крышкой ящик из пенопласта выложены мокрый пап э полотенца). Наклоните слайд так гипостомы указывает на дно контейнера, позволяя гравитации, чтобы помочь в слюне коллекции.
  10. Поместите контейнер при комнатной температуре.
  11. Внимательно следите за слюны клещей в течение первого часа, и собрать слюну, как она порождается исключение его из капилляров с лампочкой пипетки Пастера. После первого часа, проверить накопления каждый час в течение по крайней мере 4 часа. Продолжайте собирать слюну, как она создается.

Примечание: слюна приобретения могут быть прекращены достаточно слюны, собранных для исследования может быть исполнено.

  1. Если клещи не слюнотечение или, если больше слюны необходимо, слюнотечение иногда могут быть вызваны с помощью капиллярной трубки для массажа гипостомы.
  2. Добавить 0,1 объемы протеазы коктейль ингибиторов слюны и хранить при температуре -80 ° C до необходимости.

4. Представитель Результаты

e_content "> Фильм 1 показано, как провести частично подается I. scapularis нимфы и ампутировать ноги для сбора гемолимфы на предметное стекло микроскопа. Как только нога или ноги ампутировали прозрачная жидкость выделяется (рис. 1А и 1В). Если кишки разрывается гемолимфы появляется облачно, поскольку это выходит из ампутировали ногу (ы) (1С фигуры и 1D).

Добыча слюнных желез после нимфа была кормление в течение 48 или 72 часов показана в фильмах 2 и 3. После того, как клещ проколот там, как правило, много мусора (состоящий из трахеи, мальпигиевых сосудов, крови, соединительной ткани и др.), для предотвращения потери или нарушения в слюнных железах клеща двигаться в бассейн с пресной ФСБ. Цифры 2А и 2В шоу, где слюнных желез расположены после нимфа была разрезать и фигура 2С показывает удалить слюнные железы кластеров в бассейне ФСБ.

Слюна коллекция создана из I. scapularis взрослых самок я Показано, в фильме 4 и на рисунке 3. Тик слюнотечение в капиллярной трубке наблюдается в кино 5. Этот метод слюны коллекции использованы пилокарпин, чтобы стимулировать слюноотделение и может дать более 20 мкл слюны на взрослой самки клеща.

Рисунок 1.
Рисунок 1. Маркированный структур нимфы I. scapularis.

Фильм 1. Ixodes scapularis коллекции гемолимфы. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Рисунок 2.
Рисунок 2. Незагрязненные (и B) и загрязненных (C & D) гемолимфы источая из ног нимфы.

Фильм 2. Слюнных желез с добычей 48 часов кормили I. scapularis нимфы.pload/3894/3894movie2.avi "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 3. Слюнных желез с добычей 72 часа кормили I. scapularis нимфы. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Рисунок 3.
Рисунок 3. Ixodes scapularis нимфа слюнных желез. (& B) Примеры слюнных желез в 72 часа кормили нимфы, до добычи. (C) Удален слюнных желез кластера.

Фильм 4. Слюна коллекция создана из взрослых I. scapularis женский тик. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Рисунок 4.
Рисунок 4. Слюна коллекции от взрослых I. scapularis женский тicks. (& B) установлен флажок на слайде с гипостомы в потянул конец капилляра с unpulled конце капилляра проводимых пластилина. (C и D) влажной камере содержащие слюну взрослого I. scapularis женщина клещей.

Фильм 5. Ixodes scapularis женский тик слюнотечение в капиллярной трубке. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сбор клещей гемолимфы, слюнные железы, и слюна играет важную роль в изучении клещевого возбудителя передачи, распространения, распространение оружия, и сохранение как клещ и принимающей 6,11-13,20,23,29. Есть несколько способов, чтобы вскрыть галочку 30,31. Тем не менее, при сборе слюнных желез очень важно анализировать клеща собственно слюнных желез не разрывается или теряется в остатки клеща. После того, слюнные железы удаляются из тика их необходимо несколько раз промывают, чтобы удалить загрязнения кишки и могут быть установлены на слайде для окрашивания или землю в ФСБ для получения экстракта слюнной железы (ПОС). SGE легче собирать, чем слюна и обладает атрибутами похожа на слюну, поэтому он может быть использован как альтернатива слюны. Тем не менее, SGE содержит дополнительные белки, происходящих из клеток слюнных желез, которые не присутствуют в слюне тик. Помимо дополнительных белков в SGE банку бэлектронной преимущество или недостаток в зависимости от исследования выполняются, но это то, исследователь должен знать при работе с ПОС. SGE имеет то преимущество, что пилокарпин не используется во время сбора слюнных желез. Пилокарпин, мускариновые холиномиметическое агент, который действует как агонист спасения, было показано, что цитотоксический эффект на B. burgdorferi в слюне коллекции 32,33. Допамин является другой агонист слюноотделение, но быстро разрушаются гемолимфы и других жидкостей, клещей, по сравнению с пилокарпин, которая имеет устойчивый эффект 33. Другие методы, стимулирующие были изучены в слюне, и все коллекции были показаны, чтобы повлиять на состав слюны 34.

Гемолимфы коллекции может быть затруднено, так как клещи двигаются, и это может быть проблематично для иммобилизации их без разрыва кишки. Иммобилизации клеща с помощью двухсторонней ленты вариант, но гемолимфатических может быть потеряна на ленту, если клещ не снимается. Другие исследования собрали из нескольких гемолимфы клещей путем разрезания ноги клеща в дистальных суставах и центрифугированием для сбора гемолимфы 16,35. После гемолимфы коллекции освоили гемолимфы может быть использована для определения инфекционной тик, тик, чтобы возбудитель взаимодействия и миграции патогенов из кишки в слюнных железах.

Хотя основное внимание наша лаборатория находится на B. burgdorferi и I. scapularis клещей, методы, упомянутые в этом протоколе может быть использована для изучения других клещевого инфекционных агентов и отметьте вид. Кроме того, эти методы могут быть использованы на нимф и взрослых с относительной легкостью. Используя эти методы с личинка может быть сложным из-за их размера. До вскрытия технику освоили предлагается использовать незараженных клещей. Важно также осуществлять надлежащие меры биобезопасности при вскрытии инфекцииТед или области собрано клещей. Методы в этом видео протокол может быть использован в качестве руководящих принципов о том, как проводить тик вскрытия и на что обращать внимание при выполнении этих методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить отдел трансмиссивных болезней животных отделения ресурсов, в частности Андреа Петерсон, Лиза Massoudi, Verna О'Брайен и Джон Лидделл их ухода и содержания мышей и кроликов. Мы также хотели бы поблагодарить Эми Ульман, Тереза ​​Расселл, и Барбара Дж. Джонсон за их вклад к этой рукописи. Наконец, мы хотели бы отметить Алиса Эккерта в канцелярии заместителя директора по вопросам коммуникации в CDC для создания графических иллюстраций и Джуди Lavelle для направления всей законность связана с Съемки этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H312-500
Ethanol Acros Organics 61509-5000
PBS Boston Bioproducts BM-2205
Dumont Fine forceps (3C) Fisher Scientific NC9906085
Silane treated microscope slides Bioworld 42763007-1
Pap pen Bioworld 21750008-1
Super frost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-18
Pilocarpine Sigma-Aldrich P6503-5G
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714
#11 disposable scalpel Feather Safety Razor Co, Ltd. 2975#11
Nontoxic modeling clay Fisher Scientific S17307
Capillary tubes Chase Scientific Glass, Inc. 40A502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
  2. Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
  3. Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. Vector-host interactions in disease transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).
  4. Estrada-Pena, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).
  5. Nuttall, P. A. Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus. Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).
  6. Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. Enhancement of virus transmission by tick salivary glands. J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).
  7. Labuda, M., Nuttall, P. A. Tick-borne viruses. Parasitol. 129, 221-245 (2004).
  8. Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. Update on tick-borne bacterial diseases in Europe. Parasite. 16, 259-273 (2009).
  9. Zhang, L., et al. Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph. PLoS Pathog. 7, e1002079 (2011).
  10. Piesman, J., Schneider, B. S. Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks. Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).
  11. Brossard, M., Wikel, S. K. Tick immunobiology. Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).
  12. Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo. Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).
  13. Nuttall, P. A., Labuda, M. Tick-host interactions: saliva-activated transmission. Parasitol. 129, 177-189 (2004).
  14. Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host. FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).
  15. Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis. Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).
  16. Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).
  17. Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).
  18. Piesman, J. Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi. Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).
  19. De Silva, A. M., Fikrig, E. Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).
  20. Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).
  21. Brossard, M., Wikel, S. K. Immunology of interactions between ticks and hosts. Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).
  22. Wikel, S. K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).
  23. Binnington, K. C., Kemp, D. H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).
  24. Guo, X., et al. Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).
  25. Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils. Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).
  26. Lima, C. M., et al. Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut. J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).
  27. Severinova, J., et al. Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice. Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).
  28. How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM (2009).
  29. Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts. Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).
  30. Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544 (2011).
  31. Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide. Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).
  32. Ledin, K. E., et al. Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum. Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).
  33. Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva? Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).
  34. Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods. J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).
  35. Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).

Tags

Иммунологии выпуск 60, Болезнь Лайма, Слюнных желез гемолимфы тик рассечение слюна тик
Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patton, T. G., Dietrich, G., Brandt, … More

Patton, T. G., Dietrich, G., Brandt, K., Dolan, M. C., Piesman, J., Gilmore Jr., R. D. Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks. J. Vis. Exp. (60), e3894, doi:10.3791/3894 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter