Summary
Seksuelle kors og isolering av rekombinant avkom er viktige forskningsverktøy for trådformede sopp,
Abstract
Fusarium graminearum har blitt en modell for studier i utvikling og patogenitet av filamentøse sopp. F. graminearum lettest produserer fruiting organer, kalt perithecia, på gulrot agar. Perithecia inneholde mange typer vev, produsert på bestemte stadier av perithecium utvikling. Disse omfatter (i rekkefølgen) dannelse av perithecium initialer (som gir opphav til ascogenous hyfer), den ytre vegg, paraphyses (sterilt mycelia som okkuperer midten av perithecium til ASCI utvikle), den ASCI, og ascospores innenfor ASCI 14. Utviklingen av hver av disse vev er atskilt med ca 24 timer, og har vært grunnlaget for transcriptomic studier ved seksuell utvikling 12,8. Referer til Hallen et al. (2007) for en mer grundig beskrivelse av utviklingen, herunder fotografier av hver etappe. Her presenterer vi de metoder for generering og høsting synkronly utvikling plener perithecia for timelige studier av genregulering, utvikling og fysiologiske prosesser. Selv om disse metodene er skrevet spesielt for å brukes med F. graminearum, kan teknikkene brukes til en rekke andre sopp, forutsatt at fruiting kan induseres i kultur og det er litt synkronisering til utvikling. Vi har nylig tilpasset denne protokollen for å studere seksuell utvikling av F. verticillioides. Selv om enkelte perithecia må håndplukket i denne arten, fordi en plen for å utvikle perithecia ikke kunne induseres, fungerte den prosessen godt for å studere utvikling (Sikhakolli og Trail, upublisert).
Den viktigste funksjonen av sopp fruiting kropper er spredning av sporer. I mange av de artene av Ascomycota (ascus produserer sopp), er sporer høyrebenet fra ascus, på grunn av produksjon av turgor trykk i ascus, kjøring utskyting av sporer (og epiplasmic væske) gjennompore i ascus spissen 2,7. Våre studier av tvungen ascospore utslipp har resultert i utviklingen av en "Spore utslipp assay", som vi bruker for å skjerme for mutasjoner i prosessen. Her presenterer vi de detaljene i denne analysen.
F. graminearum er homothallic, og dermed kan danne fruiting organer i fravær av en kompatibel partner. Fordelen med homothallism er at krysset ikke er nødvendig å generere avkom homozygot for en bestemt egenskap, en fasett som har muliggjort studier av seksuell utvikling i denne arten 14,7. Imidlertid har heterothallic stammer blitt generert som kan brukes for kryssing 5,9. Det er også mulig å krysse homothallic stammer å få mutantene til flere gener i en stamme en. Dette gjøres ved coinoculating en petriskål med 2 stammer. Langs møtested, vil flertallet av perithecia være rekombinant (forutsatt en mutasjon i ett av de overordnede stammer ikke hemmeroutcrossing). Som perithecia alder, utstråler de ascospores hopetall i stedet for med makt å fjerne dem. Den resulterende spore sårvæske (kalt en cirrhus) sitter på tuppen av perithecium og kan enkelt fjernes for gjenvinning av enkelte sporer. Her presenterer vi en protokoll for å lette identifiseringen av rekombinant perithecia og utvinning av rekombinant avkom.
Protocol
1. Produsere Perithecia
- Senter Inokuler gulrot agar 10 i en 6,0 cm diam petriskål med en fruktbar stamme av F. graminearum (anbefaler PH-1).
- Place inokulert retter i sterkt fluorescerende lys ved romtemperatur (18-24 ° C) og la vokse frem mycelet har nådd ytterkanten av petriskål (3-5 dager). Kommersielle husholdningenes lysrør fungerer fint for å stimulere fruiting kropp dannelse og utslipp.
- Fjern forsiktig antennen mycelia med en steril tannpirker.
- Fordel 1,0 ml 2,5% Tween 60 AQ til overflaten med en steril glass hockeystick eller avrundet enden av en steril glasstav.
- Tilbake plater til lys. Ikke legg Parafilm til plater.
- Etter 24 timer, bør overflaten av platene har en skinnende utseende. Hvis mycelia vises igjen, skrape overflaten og søke på nytt Tween-60-løsning.
- Observer utvikling av perithecia over neste uke. De mellomliggende stadier avperithecium utvikling kan høstes ved forsiktig å skrape overflaten av agar og flash frosset for RNA ekstraksjon (figur 1).
- Eldre sporer vil samle på lokket av platen etter dag 7. I første omgang vil disse kun være synlig under en dissekere mikroskop, men etter dag 9, vil de ha opparbeidet tilstrekkelig tetthet slik at de er synlige for det blotte øye.
2. Ascospore Discharge Assay
- På dag 6 etter påføring av Tween løsning, klippe en 1 cm diam sirkel ut av agar med en tre pinnen. Alternativt kan en skalpell brukes til å fjerne en tilsvarende størrelse segment. Sirkelen kan skiver i to og hver halvdel plassert på en glass objektglass.
- Orient bitene slik at overflaten inneholder fruiting organer er vinkelrett på overflaten av raset, og sporene blir avfyrt ned lengden av lysbildet.
- Plasser lysbilde i en fuktighet kammer over natten etter lys. Sporer vil samle seg pålysbildet og være synlig for det blotte øye neste morgen (figur 2).
- Akkumulerte sporer kan vaskes av lysbildet med vann og kvantifiseres hvis ønskelig.
- Potensielle ascospore utladning hemmere kan analyseres ved å legge dem til baksiden av agar blokk ved montering av analysen. Noen ionekanal hemmere som reduserer utslippet tidligere har blitt analysert med denne teknikken 15.
3. Generering av Rekombinant familie
- Initiere krysse av inokulere gulrot agar med to stammer av F. graminearum (en Nit + og en nit-), plassere inokulasjon punktene på hver sin side av petriskål.
- Når hyfer har fylt overflaten, skrape av antenne del og gjelder Tween-60-løsning som beskrevet ovenfor. Bruk en markør for å merke på siden av petriskål der hyfer møtes.
- Tilbake kulturer til lys og inkuber inntil perithecia har utviklet, og cirrhi har væregun å danne fra perithecia langs skjæringspunktet mellom de to kulturene.
- Under dissekere mikroskop, bringe inn se perithecia langs skjæringspunktet mellom de to kulturene. Bruke et insekt pin, sterilisert og dyppes i sterilt vann, ta på en cirrhus langs denne grensen lett med tuppen av pinnen. Fuktigheten på pinnen bør tillate cirrhus å holde seg til pinnen.
- Skyll tuppen av pinnen med de cirrhus på det i 200 mL sterilt vann i en Eppendorf rør å vaske sporene av.
- Flame pinnen, fukte den igjen og velg et annet cirrhus. Plukk 10-15 cirrhi, og plasser i hver sin tube vann.
- Kort vortex rør som inneholder suspendert cirrhi.
- Ta 60 mL av sporeoppløsning med en pipette og sted på MMTS medium 1 i en 9 cm petriskål. Spre med en steril hockey stick. De resterende sporeoppløsning kan oppbevares ved 4 ° C i opptil en uke og replated om nødvendig.
- IncubaTe ved romtemperatur (lys ikke nødvendig) for 3-5 dager før svært små kolonier vises (figur 3). Det vil være to typer fenotyper blant koloniene. De nit-koloniene har sparser hyfer enn de nit + koloniene. Cirrhi fra rekombinant perithecia vil vise både kolonistimulerende fenotyper i omtrent lik andel. Kast platene med kolonier av bare en enkelt fenotype på dem. Merk at noen ganger mer enn to fenotyper resultere grunn til segregering av andre faktorer.
- Flytt kolonier til V8 eller gulrot agar for lagring. Test kolonier på Czapek s Dox Agar (de nit-stammene vil ikke vokse på Czapek sin Dox) og på PDA med chlorate (0,5 M kaliumklorat, de nit + stammene vil ikke vokse på PDA med chlorate) for å bekrefte riktig fenotypen. Undersøk disse koloniene for de ønskede egenskaper.
4. Representative Resultater
Produsere perithecia
Målet er å ha en plen avperithecia uten mycelia eller sporer åpenbare. Overflaten på kultur vil ligne på svart fløyel (figur 1). På 24 timers etter påføring av Tween overflaten av agar bør ha en svak glans. Hvis mycelia igjen, da platen ikke kan ha blitt skrapet nok til å indusere perithecium utvikling.
Ascospore utslipp
Alltid oppgir i analysen flere blokker av agar fra vill-type belastning. Hvis de ikke gjør det brann, så enten du perithecia er for ung eller for gammel. Hvis de er for gamle, så tallrik hyfer vises over overflaten av kulturen å gi det en hvitaktig farge. Hvis dette ikke er tilfelle, kan de være for ung, og analysen bør prøves på nytt i 24 timer. Noen ganger trenger kulturer ikke ledes godt, og forsøket må gjentas. Pass på at du utfører analysen under de riktige lysforhold.
Rekombinant avkom
Figur 1. Stadier av perithecium utvikling på gulrot agar. Venstre, 72 timer etter påføring av Tween. Merk rødt pigment og veldig ung perithecia synlig som en svart korn på overflaten. Høyre, på 144 h, har modne perithecia dannet. Note nær komplett fravær av overflatisk mycelia i begge kulturer.
Figur 2. Discharge analysen. Den oransje gulrot agar plugg er orientert så that sporer tvang utskrevet fra modne perithecia på overflaten kan akkumulere på overflaten av glass-slide. 15 timer opphopning tid.
Figur 3. Forskjeller i vekst mellom Nit + og nit-kolonier på selektivt MMTS medium. De NIT-koloniene (pilspisser) er mindre. De nit + kolonier (piler) viser kraftig vekst. Fotografi tatt etter 7 dager.
Discussion
F. graminearum er spesielt godt tilpasset studiet av fruiting kroppen utvikling på grunn av tilgjengeligheten av et godt annotert genom ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , 4), og tilgjengeligheten av en Affymetrix- basert microarray 6. Dette har bidratt til evnen til å identifisere gener som er viktige for ascospore utslipp 7,11,3. Metodene som presenteres her vil tillate forskeren å fokusere på et avgrenset sett av utviklingsstadier og funksjoner for genetisk analyse av fruiting likene av F. graminearum. Metodene er også lett tilpasses relaterte sopp som kan induseres til frukt i kultur, og kan brukes som en standard for utvikling i en rekke andre sopp fruiting typer kroppen.
Evnen til å vurdere en spore avfyring fenotype kan være subtile i arter der sporer er små og vanskelig å se, for eksempel
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Science Foundation (MCB-0923794 til FT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
References
- Bowden, R. L., Leslie, J. F. Sexual recombination in Gibberella zeae. Phytopathology. 89, 182-188 (1999).
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
