Summary
Chirurgisch trauma veroorzaakt een ontstekingsreactie. Cytokines en endogene liganden zijn bekend voor het moduleren van een myocard infarct grootte na ischemie en reperfusie. We presenteren een aangepaste gesloten kist model van muizen ischemie en reperfusie met behulp van gewichten opknoping om de effecten van thoracotomie te minimaliseren.
Abstract
Chirurgisch trauma door thoracotomie in de open-borst-modellen van coronaire ligatie induceert een immuunrespons die verschillende mechanismen betrokken zijn bij ischemie en reperfusie wijzigt. Immuunrespons omvat cytokine-expressie en het vrijkomen of secretie van endogene liganden van aangeboren immuunsysteem receptoren. Activering van het aangeboren immuunsysteem kan in potentie moduleren infarctgrootte. We hebben gewijzigd van een bestaande muis-closed-kist model met behulp van opknoping gewichten die nuttig zouden kunnen zijn voor het bestuderen van myocardiale pre-en postconditioning en de rol van aangeboren immuniteit in myocardiale ischemie en reperfusie. Dit model maakt dieren van chirurgisch trauma te herstellen vóór de start van myocardischemie.
Vluchtige anesthetica zijn intensief bestudeerd en hun voorbehandeling effect voor de ischemische hart is bekend. Echter, dit beschermende effect belet het gebruik ervan in de open borst modellen van coronaire ligatie. Zo zou een voordeel van het gebruik van the goed controleerbaar vluchtige anesthetica voor instrumentatie in een chronische gesloten kist model, omdat hun preconditionering effect duurt tot 72 uur. Chronische hart-en vaatziekten met intermitterende ischemie en meerdere hit-modellen zijn ook andere mogelijke toepassingen van dit model.
Voor de chronische gesloten kist model, geïntubeerde en beademde muizen ondergaan een zijdelingse stompe thoracotomie via de 4e intercostale ruimte. Na identificatie van de left anterior descending een ligatuur wordt doorgegeven onder het schip en beide uiteinden zijn hechtdraad geregen door middel van een occluder. Vervolgens worden beide uiteinden hechtmateriaal doorheen de borstwand, geknoopt een lus en meer in het onderhuidse weefsel. Na sluiting op de borst en herstel gedurende 5 dagen, muizen zijn weer onder narcose gebracht, wordt borsthuid heropend en opknoping gewichten worden aangesloten op de lus onder ECG-controle.
Aan het einde van het ischemie / reperfusie protocol, hart worden gekleurd met TTC voor infarctgrootte van de beoordeling of ondergaan perfusie fixatie op morfometrische studies laten in aanvulling op histologie en immunohistochemie.
Protocol
1. Inductie van anesthesie
- Voor inductie met isofluraan plaatst de muis in een inductie box die aan de damp set verbonden 3,0 vol% en zuurstof van 0,5 l / min.
- Na bewusteloosheid wordt bereikt met tactiele stimulus niet aan een reactie en de voorpoot of achterbeen pedaal terugtrekking reflex afwezig induceren, plaatst u de muis op een temperatuur-gecontroleerde operatietafel in liggende positie. Handhaaf anesthesie over een neus kegel die met de damp via de inductie box. Leunen het hoofd door de vaststelling van de bovenste snijtanden met een 5-0 nylon hechtdraad tot intubatie te vergemakkelijken.
- Plaats de rectale temperatuur probe lichaamstemperatuur temperatuur op 37 ° C. Bevestig de uiteinden met tape. Steek de linker been over het rechter been het openstellen van de linker borst en het hart bloot te beter.
- Breng ontharingscrème aan de hals en de linker borst. Veeg de crème na 1 minuut. Breng povidonjood voor lokale huiddesinfectie. Injecteer buprenorfine 0,05 mg / kg lichaamsgewicht voor verlichting van pijn subcutaan.
- Maak een middellijn nek incisie in de huid met een kleine schaar. Blunt ontleden van de klieren en spieren die de luchtpijp te dekken. Zet de ventilator. Ventilator instellingen moeten worden aangepast aan de fysiologische parameters. We gebruiken een Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Harvard Toestel met een ademfrequentie van 105/min en een ademvolume van 200 ui. Trek de tong met een pincet en leg deze dan zachtjes een 22 G metalen buis. Bevestig intubatie door directe visualisatie van de buis in de luchtpijp en de beweging van de borstkas.
- Bypass de inductie box door over te schakelen op gas slang te verspillen om besmetting van laboratoriumruimte te voorkomen. Stel damp tot 2,0 vol%.
2. Thoracotomie
- Maak een incisie in de huid in de linker midclaviculaire lijn. Blunt ontleden het onderhuidse weefsel naar de oksel. Identificeer de grens van de grote borstspier en bot ontleden het van de kleine pectoralis spieren eronder. Trek de kleine borstspier naar rechts. U krijgt een direct uitzicht op de ribbenkast.
- Identificeer en botweg de 4e intercostale ruimte pentetrate met een tang. Laat de uiteinden van de tang overspannen de intercostale ruimte om jezelf naar de oprolmechanismen die zijn aangepast met elastiekjes aan de operatietafel in te voegen. Je moet een duidelijk beeld van het hart met inbegrip van de linker oorschelp. Deze toegang wordt gewoonlijk bereikt zonder bloedverlies en dus zonder de noodzaak van elektrische coagulatie.
3. Voorbereiding van het Hart
- Trek voorzichtig uit het hartzakje zonder te verwonden het hart.
- Identificeer de left anterior descending arterie (LAD) door het optillen uit de linker atrium oorschelp van de voorste wand van de linker hartkamer. LAD zal blijken alleen over een korte rechte baan met wazig grenzen en rode kleur ten opzichte van de aders.
4. CoronaireInstrumentatie
- Bereid een 8-0 prolene hechtdraad met een taps toelopende top van de naald door de vorming van het in een U-vorm. Steek de naald door het myocard diep genoeg onder de LAD.
- Snijd de naald einde van de hechtdraad tot 1 cm van de draden zullen aan weerskanten.
- Snijd een 1 mm PE-10 buizen gedeelte als een occluder het voorkomen van scherpe hoeken. Laat de occluder om te genieten in alcoholische desinfectie en uit te tikken voor gebruik. Opmerking: De slang moet onderdompelen in 100% ethanol gedurende 24 uur om het te steriliseren juiste 4.
- Discussie zowel hechting eindigt door de occluder.
- Gebruik een maat 3 Kalt hechtnaald te begeleiden zowel hechting uiteinden van de bovenste intercostale ruimte.
5. Borst Sluiting
- Bind de bovenste en onderste rib van de geopende intercostale ruimte met een 6-0 prolene hechting. Voor het sluiten van de kist moet je gaan naar 5.2.
- Hyperinflate de longen voor een paar cycli de luchtwegen te openentot atelectase door het vastklemmen van de expiratoire buis. Deze manoeuvre kan ook afhangen van het type ventilator dat u gebruikt. Stel het ademvolume tot 300 ul tot aan de borst wordt gesloten.
- Stel de ventilator ademvolume terug naar 200 ul.
- Bind beide uiteinden van de hechtdraad 8-0 LAD ligatie te laten een lus vormen.
- Sluit een ECG.
- Sluit de gewichten naar de 8-0 lus en laat de gewichten zorgvuldig te hangen. U ziet een significante ST-elevatie binnen een paar hartslagen. Laat de gewichten. Opmerking: De experimenten gebruikt in totaal 5,5 g gewicht, maar gewicht kan variëren afhankelijk van stam en lichaamsgewicht van de muizen.
- Leg de lus in een subcutane pocket en sluit de huid met 6-0 enkele knoop hechtingen.
- Laat de muis te herstellen na extubatie onder een warming lamp.
6. Myocardiale ischemie en reperfusie
- Na herstel van ten minste 5 dagen induceren anesthesie met een mengsel van ketamine xylazineen atropine (4 ml / kg lichaamsgewicht ketamine 10 mg / ml, xylazine 2 mg / ml, atropine 0,06 mg / ml, 1.
- Intuberen en ventileren met lucht in de ruimte voor ischemie en reperfusie experimenten.
- Open de gehecht huid van de borst. Bereid de 8-0 hechtdraad lus. Sluit een ECG.
- Sluit de gewichten en laat ze hangen. Volg je ischemie protocol. Kijk ECG voor potentiële ontbinding van ST-elevatie 2.
- Laat de gewichten aan het einde van ischemie. Sluit de huid, extuberen de muis en laat het terug te krijgen.
7. Infarctgrootte Beoordeling met Reperfusie Tijd tot 3 dagen
- Verdoven en intuberen de muis aan het einde van de gewenste reperfusie tijd.
- Snijd de borst huid in de middellijn aan de xyphoid. Open de buik en snijd het membraan onder de ribbenkast. Snijd de borst open op beide zijden van de midclaviculaire lijn.
- Bevestig de voorste sloeg borstwand met een hechting om een onbelemmerde toegang tot het hart te krijgen.
- Zorgvuldig voor te bereiden de 8-0 hechtdraad lus. Knip de lus en leg een knoop aan de LAD af te sluiten.
- Injecteer 10% phtalo blauw in de linkerboezem. Om hart-volume overbelasting te voorkomen, injecteren verven langzaam en zuigen van tijd tot tijd.
- Injecteer kaliumchloride in het linker atrium. Dit zal arresteren het hart in diastole voor gelijke infarctgrootte beoordeling.
- Knip het hart, waardoor er zo veel van extracardial weefsel mogelijk te verlichten het snijden van het hart.
- Was het hart in fosfaatbuffer-oplossing.
- Bevries het hart in isopentaan en vloeibare stikstof. Als alternatief kan harten worden geplaatst in een vriezer tot ze licht bevroren.
- Snijd het hart in 1 mm plakjes. We hebben een snijden inrichting bestaande uit scheermesjes naar het hart snijd in gelijke plakjes (figuur 4). Zorg ervoor dat het hart op de juiste wijze afgestemd op loodrecht gesneden om de lange as van het hart.
- Incubeer de plakjes in 1,5% TTC bij 37 ° C gedurende 20 minuten. We maken gebruik van een 96 wells-plaat waarelk segment wordt in een putje op. Dit bespaart TTC en besparen u het gebruik van een Whatman filter om artefacten te voorkomen.
- Bevestig de plakjes met 4% formaldehyde gedurende de nacht. Dit zal krimpen de plakjes maar bevordert contrast van de kleurstof.
- Zet de plak op een microscoopglaasje. Dek af met een andere dia. Gebruik 1 mm metalen afstandhouders aan elk uiteinde van de glijbaan en bij elkaar te houden de dia's met paperclips.
- Maak een digitale foto aan beide zijden van elk segment. Gebruik altijd dezelfde instellingen en niet inzoomen voor kleinere plakjes.
- Gebruik een software voor planimetrie. We maken gebruik van ImageJ door NIH. Gebruik altijd dezelfde criteria voor infarct gebieden zijn bijvoorbeeld alleen witte gebieden geïnfarceerde. Wit roze gebieden zijn niet geïnfarceerde. We hebben verblind onderzoekers voor interventies en planimetrie ook.
8. Alternatieve Hart Voorbereiding voor Histologie
- Volg de stappen 7,1 tot 7,2. en ga door naar 8.2. Betrouwbare infarct beoordeling met TTC kleuring kan worden gedaan binnen 72 uur reperfusie als gevolg van litteken krimp.
- Bereid uit een extracardial weefsel en bot ontleden de thymus voor de aortawortel.
- Pak de aorta ascendens met de tang en knip het hart met zo min extracardiale weefsel mogelijk te maken.
- Was en knijp het hart in cardioplegic oplossing.
- Plaats het hart in een p35 schaal gevuld met cardioplegic oplossing.
- Bereid de opgaande aorta.
- Canule de stijgende aorta met een canule die ingevuld met formaldehyde. We maken gebruik van zink-formaline fixatief en een 24 G iv lijn 3.
- Knip een gat tussen de linker oorschelp en linker atrium.
- Plaats een 26 G katheter in de linker atrium met een 16 cm lange slang die eraan verbonden zijn. U kunt ook gebruik maken van een PE50 leidingen.
- Perfuseren het hart gedurende tien minuten met de formaline fixeermiddel.
- Plaats het hart in een buis gevuld met een fixatief voor een maximum van 24 uur bij 7 ° C.
- Ga verder met prepring, voorbereiding voor histologie / immunohistochemie.
9. Representatieve resultaten
Chronische kransslagader ligatie is een complexe techniek met meerdere valkuilen. Wanneer evenwel wordt beheerst kan worden uitgevoerd met een zeer lage sterfte en betrouwbare resultaten. Optimale positionering van de muizen en de toegang tot het hart zijn van cruciaal belang voor een succesvolle identificatie en instrumentatie van de LAD. De positie van de ligatie uiteraard invloed infarctgrootte er behoefte aan een gestandaardiseerd ligatie site. Ook als septum branches betrokken kan dit leiden tot een bundeltakblok in plaats van ST-elevatie. Bloeden uit epimyocardial aderen of ventrikel, als ligatie te diep is, kunnen optreden en muizen moeten worden uitgesloten als de bloeding te groot is. Pericard moet zo volledig mogelijk verwijderd te worden. Het verlaten van het pericard zal verergeren het indrukken van de naald in het myocard voor ligatie. Ook zal het leiden tot pericarditis, uiteindelijkveroorzaken verklevingen en zal histologisch onderzoek moeilijk. De PE-occluder moet zo kort mogelijk zijn, zonder scherpe hoeken om trauma te minimaliseren myocard. Hyperinflatie van de longen is absoluut noodzakelijk om de spanning pneumothorax te voorkomen na de borst sluiting. Er is geen noodzaak voor een borst drainage. Testen van een juiste positie van het ligatiemengsel in de open borst door aan het hechtmateriaal uiteinden worden weggelaten omdat trekbestendigheid is moeilijk te controleren. Als instrumentatie van de LAD niet lukt, moeten verdere pogingen worden vermeden, omdat dit trauma en oedeem toe te voegen aan het myocard.
Om betrouwbare resultaten te bereiken, dient het protocol parameters worden gestandaardiseerd. Daarom zijn muizen geïntubeerd en geventileerd met lucht in de ruimte en de lichaamstemperatuur wordt streng gecontroleerd met een feedback systeem. Het gebruik van gewichten opknoping is al benadrukt. Andere trekken apparaten hebben het nadeel van spanning verlies en niet-gestandaardiseerde trekken spanning. Ischemischepre-en postconditioning protocollen met meerdere cycli van reperfusie en occlusie worden gemakkelijker uitgevoerd met opknoping gewichten omdat ze alleen maar moeten worden getild en laten hangen (figuur 1).
Infarct gebieden (wit) moet worden onderscheiden van gebieden met een risico (rood) en niet-gebied op risico's (blauw) (Figuur 2A-B). Infarct maten zijn afhankelijk van de duur van de ischemie. Reperfusie tijd moet ten minste 2 uur succesvolle TTC kleuring (figuur 1 en 2) mogelijk. Het belangrijkste is dat cytokine RNA-expressie is laag in schijn geopereerde dieren die alle chirurgische procedures met uitzondering van ischemie en reperfusie hadden ten opzichte van dieren die een myocardinfarct (figuur 3A-C) heeft ondergaan.
Figuur 1. Infarctgrootte in percentage van de oppervlakte in gevaar (IS / AAR%). Muizen onderging 30 minuten ischemie gevolgd door 120 minuten reperfusie (I / R, n = 10). IPC: Ischemisch postconditioning muizen 30 minuten ischemie gevolgd door 3 maal reperfusie / occlusie 20 sec elk ondergaan (n = 6, * duidt p <0,05).
Figuur 2A. Vertegenwoordiger van TTC-gekleurde hart slice. Wit: infarct gebied, Rood: het risicogebied, Blauw: niet-verstopte gebied.
Figuur 2B. Vertegenwoordiger segment van een infarct (wit) gebied. Merk op dat door de kegelvorm van de linker ventrikel nabij de top de epimyocard weergegeven als vlak gebied en mag niet worden geacht voor planimetrische meting (roze / blauw buitengebied). Rood = TTC gekleurd levensvatbaar myocard.
Figuur 3A. Geen significant verschil in mijnocardial TNF-α-mRNA-expressie na 30 minuten ischemie en 120 minuten reperfusie. n = 4-6 per groep.
Figuur 3B. Myocard IL-1β mRNA-expressie na 30 minuten ischemie en 120 minuten reperfusie (I / R). Er is geen significant verschil tussen controle (geen chirurgie) en schijn-geopereerde (geen ischemie / reperfusie) groep. n = 4-6 per groep * geeft p <0,05.
Figuur 3C. Myocard IL-6 mRNA-expressie na 30 minuten ischemie en 120 minuten reperfusie (I / R). Er is geen significant verschil tussen controle (geen chirurgie) en schijn-geopereerde (geen ischemie / reperfusie) groep. n = 4-6 per groep * geeft p <0,05.
Figuur 4A-C. Heart snij-inrichting. A: afgesloten met scheermesjes in snij-positie. B: open, zijaanzicht. C: open, vooraanzicht. Hart zal worden afgestemd in de groef van de witte plastic bed met de lange as loodrecht op de scheermesjes (pijl).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een gewijzigd muis closed-borst-model door de toegang tot het hart door middel van een linker laterale intercostale thoracotomie en het leiden van de LAD hechtingen om de kist in de linker midclaviculaire lijn. Het verlaten van de benige ribbenkast intact zal het minimaliseren van trauma's, behoefte aan pijnstillers, postoperatieve wondinfectie en dus gemakkelijker herstel. Door het behoud van de linker interne zoogdier slagader is niet nodig elektrocauterisatie. We verlaten de hechting lus in het onderhuidse weefsel voor later gemakkelijke toegang en gebruik maken van een opknoping gewicht voor een bepaalde occlusie. Een gesloten kist model maakt de toepassing van alle onderzoeksprotocollen van myocardiale ischemie en reperfusie met betrekking tot chirurgisch trauma en de daarop volgende immuunrespons 4. Echter, cytokine RNA-expressie verhoogd tot 3 dagen als gevolg van chirurgische trauma bij muizen, ratten en honden 4-6. Daarom moet een herstel interval van 5 dagen gevolgd. Daarnaast heeft dit model wordt het gebruik van vluchtige Anesthetics voor instrumentatie, die een bekende voorbehandeling effect voor maximaal 72 uur 7,8 te hebben. Opioïden voor postoperatieve pijn kan ook verbeteren myocardinfarct. Het is gebleken dat voor buprenorfine myocardiale functie wordt verbeterd na globale myocardiale ischemie 9. Echter, muizen over het algemeen geen behoefte aan extra doseringen van buprenorfine zoals beoordeeld door gedragsobservatie. Er is bewijs dat chirurgisch trauma voorafgaand aan een hartinfarct zal een "achtergrond" geluid van de cytokine-expressie veroorzaken en bovendien moduleren infarctgrootte. Ren et al.. hebben aangetoond dat op afstand chirurgisch trauma induceert conditioneren van het hart 10. Andere endogene liganden zoals hoge mobiliteit groep box 1 (HMGB1) of heat shock eiwitten die vrij of uitgescheiden na trauma is gebleken moduleren myocardiale functie 11-13.
Myocard infarct in een preklinische omgeving gebeurt meestal zonder preceding een trauma of letsel. Zo kan een chronische gesloten kist model maakt een meer levensechte benadering van myocardiale ischemie en reperfusie.
Potentiële studie protocollen zijn onder andere ischemische en farmacologische pre-en postconditioning en invasieve hemodynamische metingen. Toekomstige toepassingen van dit model kan onder meerdere hit modellen zonder de chirurgische trauma van instrumenten te overwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Daniël Duerr voor zijn advies over perfusie-fixatie techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vapor | Drägerwerk AG | Isoflo | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Light source | Schott | KL 1500 LCD | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| MiniVent Type 845 | Hugo Sachs Elektronik | ||
| 8-0 Prolene | Ethicon | BV130-5 6.5mm 3/8c | |
| 6-0 Prolene | Ethicon | BV-1 9.3 mm 3/8c | |
| Kalt suture needle size 3 | FST | 12050-03 | |
| Triphenyltetrazolium | Sigma Aldrich | 93145 | |
| Phthalo blue | Heucotech LTD | ||
| PowerLab |  ADInstruments |
References
- Lim, S. Y., Davidson, S. M., Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: the essential role of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc. Res. 75, 530-535 (2007).
- Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (50), e2526 (2011).
- Michael, L. H. Myocardial infarction and remodeling in mice: effect of reperfusion. Am. J. Physiol. 277, H660-H668 (1999).
- Nossuli, T. O. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies 52. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, H1049-H1055 (2000).
- Irwin, M. W. Tissue expression and immunolocalization of tumor necrosis factor-alpha in postinfarction dysfunctional myocardium 846. Circulation. 99, 1492-1498 (1999).
- Michael, L. H. Creatine kinase and phosphorylase in cardiac lymph: coronary occlusion and reperfusion. Am. J. Physiol. 248, 350-359 (1985).
- Tonkovic-Capin, M. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels 765. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283, H61-H68 (2002).
- Tsutsumi, Y. M. Role of caveolin-3 and glucose transporter-4 in isoflurane-induced delayed cardiac protection. Anesthesiology. 112, 1136-1145 (2010).
- Benedict, P. E., Benedict, M. B., Su, T. P., Bolling, S. F. Opiate drugs and delta-receptor-mediated myocardial protection. Circulation. 100, II357-II360 (1999).
- Ren, X., Wang, Y., Jones, W. K. TNF-alpha is required for late ischemic preconditioning but not for remote preconditioning of trauma. J. Surg. Res. 121, 120-129 (2004).
- Andrassy, M. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart. Circulation. 117, 3216-3226 (2008).
- Kim, S. C. Extracellular heat shock protein 60, cardiac myocytes, and apoptosis. Circ. Res. 105, 1186-1195 (2009).
- Lin, L. HSP60 in heart failure: abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 293, 2238-2247 (2007).
