En murint Lukket kiste Modell av myokardiskemi og reperfusjon

Summary

Kirurgisk traumer induserer en inflammatorisk respons. Cytokiner og endogene ligander er kjent for å modulere hjerteinfarkt størrelse etter iskemi og reperfusjon. Vi presenterer en modifisert lukket kiste modell av murine iskemi og reperfusjon bruke hengende vekter for å minimalisere virkningene av torakotomi.

Abstract

Kirurgisk traumer ved torakotomi i åpen brystet modeller av koronar ligation induserer en immunrespons som modifiserer ulike mekanismene som er involvert i iskemi og reperfusjon. Immunrespons omfatter cytokine uttrykk og frigjøring eller utskillelse av endogene ligander av medfødte immunsystemet reseptorer. Aktivering av medfødt immunitet kan potensielt modulere infarkt størrelse. Vi har endret en eksisterende murine lukket kiste modell med henger vekter som kan være nyttig for å studere hjerteinfarkt pre-og postconditioning og rollen medfødt immunitet i myokardiskemi og reperfusjon. Denne modellen gjør at dyrene å komme seg fra kirurgisk traume før utbruddet av myokardiskemi.

Flyktige anestesimidler har vært intenst studert og deres prekondisjonering effekt for iskemisk hjertesykdom er velkjent. Men utelukker denne beskyttende effekten bruk i åpne brystet modeller av koronar ligation. Dermed kan en annen fordel være bruk av the vel kontrollerbare flyktige anestesimidler for instrumentering i en kronisk lukket brystet modellen, siden deres prekondisjonering Effekten varer opp til 72 timer. Kroniske hjerte sykdommer med intermitterende iskemi og flere rammede modellene er andre mulige anvendelser av denne modellen.

For kronisk lukket kiste modell, intuberte og ventilerte mus gjennomgår en lateral sløv torakotomi via fjerde interkostalrom. Etter identifikasjon av venstre fremre nedstigende en ligatur er gått under fartøyet og begge sutur endene er tredd gjennom en occluder. Deretter blir begge sutur endene gikk gjennom brystveggen, knotted å danne en løkke og forlatt i det subkutane vevet. Etter brystet nedleggelse og gjenoppretting for 5 dager, mus er bedøvet igjen, blir brystet hud gjenåpnet og hengende vekter er koblet opp til sløyfen i henhold EKG kontroll.

På slutten av iskemi / reperfusjon protokollen, kan hjerter bli beiset med TTC for infarktstørrelse vurdering eller gjennomgå perfusjon fiksering å tillate morfometriske studier i tillegg til histologi og immunhistokjemi.

Protocol

1. Induksjon av anestesi

1. For induksjon med isofluran, plasserer musen inn i en induksjons boks som er koblet til damp satt til 3,0 vol% og oksygen på 0,5 l / min.
2. Etter bevisstløshet oppnås med taktil stimulans unnlate å indusere en respons og forbena eller hindlimb pedal uttak refleks være fraværende, plasserer musen på en temperaturkontrollert operasjonsbordet i liggende stilling. Opprettholde anestesi over en nasal kjegle som er koblet til damp via induksjon boksen. Lene hodet ved å feste de øvre fortennene med en 5-0 nylon sutur å lette intubasjon.
3. Sett rektal temperatur probe for å opprettholde kroppens kjernetemperatur på 37 ° C. Fest ekstremiteter med tape. Kryss nedre venstre beinet over det høyre beinet til å åpne opp venstre bryst og utsetter hjertet bedre.
4. Påfør Hårfjerningskrem til nakken og venstre bryst. Tørk av kremen etter 1 minutt. Påfør povidonjodid for lokal huddesinfeksjon. Injiser buprenorfin 0,05 mg / kg kroppsvekt for smertelindring subkutant.
5. Lag en midtlinjen hals hud snitt med en liten saks. Sløve dissekere kjertlene og muskler som dekker luftrøret. Slå på ventilator. Ventilator innstillinger bør justeres til fysiologiske parametere. Vi bruker en Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Harvard Apparatus med en respirasjonsfrekvens på 105/min og en tidevolum på 200 mL. Trekk tungen med en tang og forsiktig setter inn en 22 G metall rør. Bekreft intubasjon ved direkte visualisering av røret inne i luftrøret og brystet bevegelse.
6. Bypass induksjon boksen ved å bytte til avgassen slangen for å hindre forurensning av laboratoriet plass. Juster damp til 2,0 vol%.

2. Torakotomi

1. Lag en hud snitt i venstre medioklavikularlinje. Sløve dissekere det subkutane vevet mot armhulen. Identifiser grensen av det store pectoralis muskelen og sløve dissekere den fra mindre pectoralis muskel under. Trekk den mindreårige pectoralis muskelen til høyre. Du vil få en direkte utsikt over brystkassen.
2. Identifisere og blankt pentetrate 4. interkostalrom med en tang. La tips av tang span interkostalrom å tillate deg selv å sette inn haker som er justert med gummistrikk festet til operasjonsbordet. Du bør ha et klart syn på hjertet, inkludert venstre atriet. Denne tilgangen er vanligvis oppnås uten blod tap og dermed uten behov for elektrisk koagulering.

3. Utarbeidelse av the Heart

1. Trekk forsiktig av hjerteposen uten å skade hjertet.
2. Identifiser venstre fremre nedstigende arterie (LAD) ved å løfte av venstre atrie atriet fra fremre vegg av venstre ventrikkel. LAD vil bli sett bare over en kort rett kurs med uklare grenser og lys rød farge i forhold til venene.

4. KoronarInstrumentering

1. Forbered en 8-0 prolene sutur med en konisk nål tips ved å danne det inn en U-form. Før nålen gjennom hjertemuskelen dypt nok under LAD.
2. Klipp av nålen enden av suturen å ha 1 cm av sutur på hver side.
3. Klipp av en 1 mm PE-10 tubing seksjonen som en occluder forebygge eventuelle skarpe hjørner. La occluder å suge i alkoholisk desinfeksjon og trykk ut før bruk. Merk: Slangen bør soaking i 100% etanol i 24 timer for å sterilisere det riktig ^4.
4. Tråd både sutur ender gjennom occluder.
5. Bruk en størrelse 3 Kalt sutur nål for å veilede både sutur ender ut i den øvre interkostalrom.

5. Bryst Closure

1. Knyt øvre og nedre ribben på åpnet interkostalrom sammen med en 6-0 prolene sutur. Før du lukker brystet bør du fortsette til 5,2.
2. Hyperinflate lungene for noen respiratoriske sykluser for å åpneopp atelektase ved å klemme den ekspiratorisk tube. Denne manøveren kan også avhenge av hvilken type ventilator du bruker. Sett tidevolum til 300 mL inntil brystet er stengt.
3. Sett ventilator tidevolum tilbake til 200 mL.
4. Bind begge ender av 8-0 LAD ligation sutur å ha dem danne en løkke.
5. Fest en EKG.
6. Hook opp vektene til 8-0 løkke og la vektene nøye henger. Du burde se en betydelig ST-elevasjon i løpet av få hjerteslag. Slipp vekter. Merk: Disse eksperimentene bruke totalt 5,5 g vekt, men vekt kan variere basert på stamme og kroppsvekt av mus.
7. Løkken i en subkutan lomme og lukker huden med 6-0 enkel knute suturer.
8. La musen gjenopprette etter ekstubasjon under en oppvarming lampe.

6. Myokardiskemi og reperfusjon

1. Etter en frisk periode på minst 5 dager indusere anestesi med en blanding av ketamin, xylazinog atropin (4 ml / kg kroppsvekt, ketamin 10 mg / ml, xylazin 2 mg / ml, atropin 0,06 mg / ml, ^1.
2. Intubate og ventilere med romluft for iskemi og reperfusjon eksperimenter.
3. Åpne sutureres huden på brystet. Klargjør 8-0 sutur loop. Fest en EKG.
4. Hook opp vektene og lot dem henge. Følg iskemi protokollen. Se EKG for potensiell oppløsning av ST-elevasjon ^to.
5. Slipp vektene ved utgangen av iskemi. Lukk hud, extubate musen og la det komme.

7. Infarktet Størrelse Assessment med reperfusjon Tid opp til 3 dager

1. Anesthetize og intubate musen på slutten av ønsket reperfusion tid.
2. Skjær brystet hud i midtlinjen til xyphoid. Åpne buken og kutte mellomgulvet under brystkassen. Skjær brystet åpent på begge sider av medioklavikularlinje.
3. Fest flakset fremre brystveggen med en sutur å få uhindret tilgang til hjertet.
4. Nøye forberede 8-0 sutur loop. Skjær loopen og knyt en knute til occlude gutten.
5. Injiser 10% phthalo blå inn i venstre atrium. For å forhindre hjerte-volum overbelastning, injiserer fargestoff langsomt og aspirer fra tid til annen.
6. Injiser kaliumklorid inn i venstre atrium. Dette vil arrestere hjertet i diastolen for likt infarkt størrelse vurdering.
7. Klipp ut hjerte, forlater så mye av extracardial vev som mulig for å lette kutte hjertet.
8. Vask hjertet i fosfatbuffer løsning.
9. Frys hjertet i isopentan og flytende nitrogen. Alternativt kan hjerter bli plassert i en fryser til lett frosset.
10. Skjær hjertet i 1 mm skiver. Vi har en kutting enhet laget av barberblad til å skjære hjertet i like skiver (figur 4). Pass på hjertet er riktig justert for å kutte vinkelrett på den lange aksen av hjertet.
11. Inkuber skiver i 1,5% TTC ved 37 ° C i 20 min. Vi bruker en plate med 96 brønner hvorhver skive blir satt i en brønn. Dette vil spare TTC og spare dere bruk av en Whatman filter for å hindre artefakter.
12. Fest skiver med 4% formaldehyd over natten. Dette vil krympe skivene, men øker kontrasten av fargestoff.
13. Sett stykket på et objektglass. Dekk med et annet lysbilde. Bruk 1 mm Metall avstandsstykker i hver ende av raset og holde lysbilder sammen med binders.
14. Ta et digitalt bilde fra begge sider av hver skive. Bruk alltid de samme innstillingene og ikke zoome inn for mindre skiver.
15. Bruk en programvare for planimetry. Vi bruker ImageJ ved NIH. Bruk alltid de samme kriteriene for infarcted områder, er f.eks bare hvite områder infarcted. Hvite lyserøde områder er ikke infarcted. Vi har blindet etterforskere for intervensjoner og planimetry også.

8. Alternativ Hjerte Forberedelse til Histologi

1. Følg trinn 7.1 til 7.2. og videre til 8,2. Pålitelig infarktet vurdering med TTC flekker kan gjøres innen 72 timer av reperfusjon grunn av arret krymping.
2. Forbered av eventuelle extracardial vev og sløve dissekere thymus dekker aortarot.
3. Ta tak i aorta ascendens med pinsett og klipp ut hjerte med som mindre ekstrakardiale vev som mulig.
4. Vask og klem hjertet forsiktig i cardioplegic løsning.
5. Plasser hjertet i en p35 tallerken fylt med cardioplegic løsning.
6. Forbered aorta ascendens.
7. Cannulate aorta ascendens med en kanyle som er fylt med formaldehyd. Vi bruker sink-formalin bindemiddel og en 24 G iv linje ^3.
8. Skjær et hull mellom venstre atriet og venstre atrium.
9. Sett inn en 26 G kateter inn i venstre atrium med en 16 cm lang slange festet til den. Du kan også bruke en PE50 rør.
10. Perfuse hjertet i ti minutter med formalin bindemiddel.
11. Plasser hjertet i et rør fylt med fiksativ for maksimum 24 timer ved 7 ° C.
12. Fortsett med preparation for histologi / immunhistokjemi.

9. Representative Resultater

Kronisk koronar ligation er en kompleks teknikk med flere fallgruver. Men når det er mestret det kan utføres med svært lav dødelighet og svært pålitelige resultater. Optimal plassering av mus og tilgang til hjertet er avgjørende for vellykket identifisering og instrumentering av gutten. Plasseringen av ligation vil åpenbart påvirke infarktet størrelse, og dermed krever å ha et standardisert ligation nettsted. Også hvis septal grener er berørt dette kan føre til en grenblokk istedenfor ST elevasjon. Blødning fra epimyocardial årer eller fra ventrikkel, hvis ligation er for dypt, kan oppstå og mus bør utelukkes dersom blødningen er overdreven. Pericard bør fjernes så fullstendig som mulig. Forlate pericard vil forverre skyve nålen inn i myocard for ligation. Dessuten vil det føre til perikarditt, til sluttindusere sammenvoksninger og vil gjøre histologisk undersøkelse vanskelig. PE-occluder bør være så kort som mulig uten skarpe hjørner for å minimere traumer til myocard. Hyperinflasjon av lungene er helt avgjørende for å hindre spenning pneumothorax etter brystet nedleggelse. Det er ikke behov for en kiste drenering. Testing av en korrekt plassering av ligation i åpen kiste ved å trekke sutur endene bør utelates fordi trekke spenning er vanskelig å kontrollere. Hvis instrumentering av LAD mislykkes, bør ytterligere forsøk unngås fordi dette vil legge til traumer og ødem til hjertemuskelen.

For å oppnå pålitelige resultater, bør protokollparametere være standardisert. Derfor er mus intubert og ventilert med romluft og kroppstemperaturen blir strengt kontrollert med en tilbakemelding system. Bruken av hengende vekter er allerede vektlagt. Andre trekker enheter har den ulempen av spenning tap og ikke-standardiserte trekke spenning. Iskemiskpre-og postconditioning protokoller med flere runder med reperfusjon og okklusjon er lettere utføres med hengende vekter fordi de bare trenger å bli løftet og la hang (figur 1).

Infarktet områder (hvit) skal kunne atskilles fra områder med risiko (rød) og ikke areal på risiko (blå) (figur 2a-B). Infarktet størrelser er avhengig av varigheten av iskemi. Reperfusjon tid bør være minst 2 timer for å tillate vellykket TTC farging (Figur 1 og 2). Viktigst er cytokin RNA uttrykk lav i falske opererte dyr som hadde alle kirurgiske prosedyrer unntatt iskemi og reperfusjon i forhold til dyr som gjennomgikk hjerteinfarkt (figur 3A-C).

Figur 1. Infarktet størrelse i prosent av areal i fare (IS / AAR%). Mus gjennomgikk 30 minutter iskemi fulgt av en20 minutter reperfusjon (I / R, n = 10). IPC: Iskemisk postconditioning, mus gjennomgikk 30 minutter med iskemi fulgt av 3 sykluser med reperfusjon / okklusjon 20 sek hver (n = 6, * indikerer p <0,05).

Figur 2a. Representant TTC-beiset hjerte skive. Hvit: infarktet område, Red: område i fare, Blue: ikke-okkluderte område.

Figur 2B. Representant skive en infarcted (hvit) område. Merk at på grunn av den koniske formen av venstre ventrikkel nær apex, vil epimyocard vises som plan areal og bør ikke anses for planimetric måling (rosa / blå ytre område). Rød = TTC flekket levedyktig myocard.

Figur 3A. Ingen signifikant forskjell i mittocardial TNF-α mRNA uttrykk etter 30 minutter ischemi og 120 minutter reperfusjon. n = 4-6 per gruppe.

Figur 3B. Myocardial IL-1β mRNA uttrykk etter 30 minutter ischemi og 120 minutter reperfusjon (I / R). Det er ingen signifikant forskjell mellom kontroll (ingen kirurgi) og humbug-opererte (ingen iskemi / reperfusjon) gruppe. n = 4-6 per gruppe, indikerer * p <0,05.

Figur 3C. Myocardial IL-6 mRNA uttrykk etter 30 minutter ischemi og 120 minutter reperfusjon (I / R). Det er ingen signifikant forskjell mellom kontroll (ingen kirurgi) og humbug-opererte (ingen iskemi / reperfusjon) gruppe. n = 4-6 per gruppe, indikerer * p <0,05.

Figur 4A-C. Hørt kutte enhet. A: stengt med barberblader i freseposisjonen. B: åpen, side utsikt. C: åpen, sett forfra. Hjerte vil bli justert i sporet av den hvite plast seng med sin lange akse vinkelrett på barberblader (pil).

Discussion

Vi har endret en murine lukket kiste modell ved å gå midt gjennom en venstre lateral interkostalrom torakotomi og fører ut guttens sting i brystet i venstre medioklavikularlinje. Forlate bony brystkassen intakt vil minimere traumer, behov for smertestillende medikamenter, kirurgiske området infeksjon og dermed lette utvinning. Ved å bevare den venstre interne pattedyr arterien det ikke er behov for electrocautery. Vi forlater sutur sløyfe i det subkutane vev for senere enkel tilgang og bruk en hengende vekt system for en definert okklusjon. Et lukket kiste modellen gjør at anvendelse av alle studier protokoller av myokardiskemi og reperfusjon med hensyn til kirurgisk traume og påfølgende immunrespons ^4. Men cytokin RNA uttrykk økt i inntil 3 dager på grunn av kirurgisk traume i mus, rotter og hunder ^4-6. Derfor bør en utvinning intervall på 5 dager følges. I tillegg gir denne modellen bruk av flyktige anesthetics for instrumentering som har et kjent prekondisjonering effekt i opptil 72 timer ^7,8. opioider for postoperativ smerte kan også forbedre hjerteinfarkt. Det har blitt vist for buprenorfin som hjerteinfarkt funksjonen er forbedret etter den globale myokardiskemi ^9. Men mus generelt ikke trenger flere doser av buprenorfin som bedømt av atferdsmessige observasjon. Det er dokumentert at kirurgisk traume forut hjerteinfarkt vil forårsake en "bakgrunn" støy cytokin uttrykk og dessuten, modulere infarkt størrelse. Ren et al. har vist at ekstern kirurgisk traume induserer prekondisjonering av hjertet ^10. Andre endogene ligander som høy mobilitet gruppe boks 1 (HMGB1) eller heat shock proteiner som er utgitt eller skilles etter traumer har vist seg å modulere myokard funksjon ^11-13.

Hjerteinfarkt i en prehospitalt miljø oppstår vanligvis uten preceDing traumer eller skader. Dermed kan en kronisk lukket kiste modellen en mer livaktig tilnærming til myokardiskemi og reperfusjon.

Potensielle studere protokoller inkluderer iskemiske og farmakologisk pre-og postconditioning og invasiv hemodynamisk målinger. Fremtidige anvendelser av denne modellen kan omfatte flere rammede modeller uten å vurdere den kirurgiske traumet av instrumentering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vapor	Drägerwerk AG	Isoflo
Microscope	Leica	M80
Light source	Schott	KL 1500 LCD
Homeothermic Blanket Control Unit	Harvard Apparatus
MiniVent Type 845	Hugo Sachs Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6.5mm 3/8c
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 9.3 mm 3/8c
Kalt suture needle size 3	FST	12050-03
Triphenyltetrazolium	Sigma Aldrich	93145
Phthalo blue	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments