Summary
Хирургическая травма вызывает воспалительную реакцию. Цитокины и эндогенных лигандов, как известно, модулировать инфаркт миокарда размер после ишемии и реперфузии. Мы представляем изменение закрытой грудью модели мышей ишемии и реперфузии использованием висит весов, чтобы минимизировать последствия торакотомии.
Abstract
Хирургические травмы на торакотомия в открытой грудной модели перевязки коронарной вызывает иммунный ответ, который изменяет различные механизмы, задействованные при ишемии и реперфузии. Иммунный ответ включает в себя выражение цитокинов и освобождение или секреции эндогенных лигандов рецепторов врожденного иммунитета. Активация врожденного иммунитета потенциально может модулировать размер инфаркта. Мы модифицировали существующие мышиных закрытой грудью модели с использованием подвесной весов, которые могут быть полезны для изучения миокарда до и посткондиционирования и роли врожденного иммунитета при ишемии миокарда и реперфузии. Эта модель позволяет животным, чтобы оправиться от хирургической травмы до начала ишемии миокарда.
Летучие анестетики были интенсивно изучается и их предварительной эффект для ишемической болезни сердца, хорошо известно. Однако это защитное действие исключает его использования в открытой модели грудь перевязки коронарной артерии. Таким образом, еще одним преимуществом может стать использование йхорошо управляемый электронной летучих анестетиков для приборов в хроническую закрытой груди модели, так как их предварительной эффект длится до 72 часов. Хронические заболевания сердца с прерывистой ишемии и несколько моделей хитом и другие возможные применения этой модели.
Для хронического закрытой груди модели, интубации и вентиляции мышей пройти боковой тупой торакотомия через 4 межреберье. После идентификации левой передней нисходящей лигатура проходит под судном и оба шва концы пропускаются через окклюдера. Тогда, как шов концы пропускаются через стенку грудной клетки, узлами, образуя петлю и оставил в подкожной клетчатке. После закрытия груди и восстановление в течение 5 дней мышей вновь под наркозом, на груди кожа вновь и подвесных весов подключили к петле под контролем ЭКГ.
В конце ишемии / реперфузии протокол, сердца могут быть окрашены с ТТК на инфарктОценка размера или пройти перфузии фиксации, чтобы морфометрических исследований в дополнение к гистологии и иммуногистохимии.
Protocol
1. Анестезии
- Для индукции ИФ, поместите курсор в поле индукции, который связан с множеством пар до 3,0% и т. поток кислорода 0,5 л / мин.
- После того, как бессознательное достигается с помощью тактильных стимулов не в состоянии вызвать отклик и вывода лапы или задних конечностей педали рефлекс отсутствующих, при наведении на контролируемой температурой операционном столе в положении лежа. Поддержание анестезии на носовой конус, который связан с паром через индукцию поля. Откидывать голову фиксации верхних резцов с 5-0 нейлон шва для облегчения интубации.
- Вставьте ректального датчика температуры для поддержания температуры ядра тела при температуре 37 ° C. Закрепите конечностей с ленты. Крест нижней левой ноги на правую ногу, чтобы открыть левую грудь и подвергать сердце лучше.
- Применяют для удаления волос крем для шеи и левой груди. Протрите крем после 1 минуты. Применение повидон-йода для местных кожидезинфекции. Вводите бупренорфин 0,05 мг / кг массы тела для облегчения боли подкожно.
- Сделайте срединный разрез кожи шеи с небольшой ножницами. Притупить рассекать желез и мускулов, которые охватывают трахею. Включите вентилятор. Вентилятор настройки должны быть приспособлены для физиологических параметров. Мы используем Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Гарвардский аппарата с дыхательной скорость 105/min и дыхательного объема 200 мкл. Вытяните язык с пинцетом и аккуратно вставьте 22 G металлическую трубу. Подтвердите интубация прямой визуализации трубки внутрь трахеи и грудной клетки движение.
- Обход индукции поле за счет перехода на трубы отходящих газов для предотвращения загрязнения космической лаборатории. Регулировка пара на 2,0% Vol.
2. Торакотомия
- Сделайте разрез кожи в левом межключичный линии. Притупить рассекают подкожную клетчатку к подмышечной впадине. Определить границы основных грудной мышцы и притупить анализировать его с незначительными рПод ectoralis мышцы. Потяните за незначительные грудной мышцы справа. Вы получите прямой вид на грудную клетку.
- Выявление и прямо pentetrate 4 межреберье с щипцами. Пусть кончики пинцета охватывают межреберье, чтобы позволить себе вставить преднатяжителями, которые согласованы с резинками прикреплены к операционном столе. Вы должны иметь четкое представление о сердце в том числе левого предсердия. Этот доступ обычно достигается без потери крови и, следовательно, без электрической коагуляции.
3. Подготовка сердца
- Осторожно снять, не повредив перикарда сердца.
- Определение левой передней нисходящей артерии (LAD), сняв с левого предсердия ушной раковины от передней стенки левого желудочка. ЛАД будет видно только в течение короткого прямого курса с размытыми границами и ярко-красного цвета по сравнению с венами.
4. ИшемическаяИзмерительные приборы
- Подготовить 8-0 проленовой шов с коническим острием, формируя его в U-образную форму. Пропустите иглу через миокарда достаточно глубоко под LAD.
- Отрежьте конец стрелки шва, чтобы 1 см шва с каждой стороны.
- Отрежьте 1 мм ПЭ-10 Трубы раздел как окклюдера предотвращения любых острых углов. Позвольте окклюдера, чтобы впитать в алкогольном дезинфекции и нажмите перед использованием. Примечание: трубы должны быть замоченным в 100% этилового спирта в течение 24 часов для стерилизации уместнее 4.
- Тема, как шов заканчивается через окклюдера.
- Используйте размер 3 Kalt шов игла для руководства и заканчивается швом из верхней межреберье.
5. Грудь закрытия
- Привяжите верхний и нижний ребра открыл межреберье вместе с 6-0 проленовой шва. Перед тем, как закрыть грудью вы должны приступить к 5.2.
- Перерастянутой легких за несколько дыхательных циклов, чтобы открытьдо ателектаза, зажимая трубку выдоха. Этот маневр может также зависеть от типа вентилятора вы используете. Установить дыхательного объема до 300 мкл до груди закрыт.
- Установить вентилятор приливной назад объем до 200 мкл.
- Свяжите оба конца шва 8-0 перевязки LAD, чтобы они образуют замкнутый контур.
- Прикрепить ЭКГ.
- Подключите веса 8-0 цикла, и пусть вес тщательно повесить. Вы должны увидеть значительный подъем ST-в течение нескольких ударов сердца. Отпустите веса. Примечание: Эти эксперименты использовать в общей сложности 5,5 г веса, а вес может варьироваться в зависимости от напряжения и массы тела мышей.
- Поместите петлю в подкожный карман и закрывать кожу 6-0 швов одного узла.
- Пусть мышь восстановиться после экстубации под потепление лампы.
6. Ишемии миокарда и реперфузии
- После восстановительного периода, по крайней мере 5 дней вызывает наркоз смесью кетамин, ксилазинаи атропин (4 мл / кг массы тела, кетамина в дозе 10 мг / мл, ксилазина 2 мг / мл, атропин 0,06 мг / мл, 1.
- Интубации и вентиляции воздуха в помещении с для ишемии и реперфузии экспериментов.
- Откройте зашивается кожу груди. Подготовка шва 8-0 цикла. Прикрепить ЭКГ.
- Подключите веса, и пусть они висят. Следуйте ишемии протокола. Смотреть ЭКГ для потенциальных роспуска ST-высота 2.
- Отпустите весов в конце ишемии. Закройте кожи, экстубации мышь и дайте ему восстановиться.
7. Инфаркт оценки размера с реперфузии время до 3 дней
- Обезболить и интубации мыши в конце реперфузии желаемого времени.
- Разрежьте кожу груди по средней линии к xyphoid. Откройте живот и перерезал диафрагмы ниже грудной клетки. Разрежьте грудь открытой с обеих сторон межключичный линии.
- Закрепите хлопали передней стенке груди шов, чтобы получить беспрепятственный доступ к сердцу.
- Тщательно готовить 8-0 шва петли. Разрежьте петлю и завяжите узел, чтобы закупорить LAD.
- Вводите 10% phthalo синий в левое предсердие. Чтобы предотвратить сердечные перегрузки объемом, вводить медленно и красить аспирации время от времени.
- Вводите хлористого калия в левое предсердие. Это позволит остановить сердце в диастолу за равные оценки размера инфаркта.
- Вырежьте сердце, оставив большую часть extracardial ткани, как можно облегчить сокращение сердца.
- Вымойте сердце в фосфатном буферном растворе.
- Замораживание сердце изопентан и жидкого азота. Кроме того, сердце может быть помещена в морозильную камеру до слегка заморожены.
- Сокращение сердца в 1 ломтика мм. У нас есть нарезка устройство из бритвенных лезвий, чтобы вырезать сердце в равных кусочков (рис. 4). Убедитесь, что сердце правильно согласованы с вырезанной перпендикулярно к длинной оси сердца.
- Инкубируйте ломтики в 1,5% TTC при температуре 37 ° С в течение 20 мин. Мы используем 96 пластины, гдекаждый ломтик кладется на одну скважину. Это позволит сэкономить ТТК и избавить вас от использования Ватман фильтр для предотвращения артефактов.
- Прикрепите кусочки с 4% формальдегида в одночасье. Это позволит уменьшить ломтиками но и повышает контрастность красителя.
- Положите ломтик на предметное стекло микроскопа. Крышка с другой слайд. Используйте 1 мм проставки металла на каждом конце сдвиньте и удерживайте слайды вместе со скрепками.
- Возьмите цифровое изображение с обеих сторон каждый ломтик. Всегда используйте те же настройки и не увеличить для небольших кусочков.
- Используйте программное обеспечение для планиметрии. Мы используем ImageJ по НИЗ. Всегда используйте те же критерии для инфаркта областях, например, только белые районы инфаркта. Белый розоватые области не инфаркта. Мы ослеплены следователей для проведения интервенций и планиметрии, а также.
8. Подготовка альтернативного сердца для гистологии
- Выполните шаги 7.1 до 7.2. и перейдите к 8.2. Надежная оценка инфаркта с окрашивание ТТК может быть сделано в течение 72 часа реперфузии из-за шрама усадки.
- Подготовить от любых extracardial ткани и притупить рассекать тимуса покрытие корня аорты.
- Возьмите восходящей аорты с пинцетом и вырезал сердце как менее экстракардиальных ткани, как это возможно.
- Вымойте и отожмите сердце нежно кардиоплегического решение.
- Поместите сердце в p35 блюдо заполнено кардиоплегического решение.
- Подготовить восходящей аорты.
- Вводить иглу восходящей аорты с канюлей, которое заполнено с формальдегидом. Мы используем цинк-формалина фиксатором и 24 G IV строке 3.
- Вырежьте отверстие между левого предсердия и левого предсердия.
- Вставьте 26 G катетер в левое предсердие с 16 см в длину трубы прилагается к нему. Вы также можете использовать PE50 труб.
- Заливать сердца в течение десяти минут с формалином фиксатором.
- Поместите сердце в трубе, наполненной фиксатор не более 24 часов на 7 ° C.
- Продолжить подготовительнуюaration для гистологии / иммуногистохимии.
9. Представитель Результаты
Хронические коронарные артерии лигирование является сложной техники с нескольких ошибок. Однако, как только он освоил это может быть выполнено с очень низкой смертности и высокой надежные результаты. Оптимальное позиционирование мыши и доступ к сердцу имеют решающее значение для успешной идентификации и аппаратуры LAD. Позиция перевязкой, очевидно, будет влиять размер инфаркта, поэтому необходимо иметь стандартизированный сайт труб. Кроме того, если перегородки отрасли влияет это может привести к блоку пучка Гиса вместо ST высотой. Кровотечение из epimyocardial вены или из желудочков, при перевязке слишком глубоко, может произойти и мыши должны быть исключены, если кровотечение является чрезмерным. Pericard должны быть устранены как можно более полно. Оставив pericard усугубит нажатием иглы в миокарде для перевязки. Кроме того, это может привести перикардит, в конечном итогевызывают спайки и сделают гистологическое исследование трудно. PE-окклюдера должно быть как можно короче, без острых углов, чтобы минимизировать травмы миокарда. Гиперинфляция легких имеет решающее значение для предотвращения напряженности пневмоторакс после закрытия груди. Существует нет необходимости в грудь дренажа. Испытания правильное положение перевязки в открытую грудь, потянув за концы шва должны быть исключены, потому что тянет напряжение трудно контролировать. Если аппаратура не может LAD, дальнейшие попытки следует избегать, поскольку это добавит травмы и отека в миокарде.
Для достижения надежных результатов, параметры протокола должны быть стандартизированы. Таким образом, мышей интубации и вентиляции воздуха в помещении с температурой тела и жестко контролируется с помощью системы обратной связи. Использование подвесных весов уже подчеркивал. Другие потянув устройства имеют тот недостаток, потери напряжения и нестандартных потянув напряженности. Ишемическийпред-и посткондиционирования протоколы с несколькими циклами реперфузии и окклюзии более легко осуществляется с висячими весами, потому что они просто должны быть сняты, и пусть висел (рис. 1).
Инфаркт области (белые) должны быть отличимы от районов, подверженных риску (красный) и не в области рисков (синий) (рис. 2A-B). Инфаркт размеры зависят от продолжительности ишемии. Реперфузии время должно быть не менее 2 часов, чтобы успешное окрашивание ТТК (рис. 1 и 2). Самое главное, экспрессии цитокинов РНК низких в фиктивный оперированных животных, которая имела все хирургические процедуры, кроме ишемии и реперфузии по сравнению с животными, которые подверглись инфаркт миокарда (рис. 3А-C).
Рисунок 1. Размер инфаркта в процентах от зоны риска (IS / AAR%). Мыши прошли 30 минут ишемии 120 минут реперфузии (I / R, N = 10). МПК: ишемическая посткондиционирования, мыши подверглись 30 минут ишемии и 3 цикла реперфузии / окклюзия 20 сек каждый (п = 6, * обозначает р <0,05).
Рисунок 2А. Представитель TTC-окрашенные сердце кусочек. Белый: инфаркт области, Красный: зона риска, Blue: без окклюзии области.
Рисунок 2B. Представитель кусочек инфаркта (белый) области. Обратите внимание, что в связи с конической формы левого желудочка близки к вершине, epimyocard будет выглядеть как плоскость области и не должны рассматриваться для контурной измерения (розовый / голубой внешней области). Красный = TTC окрашивали жизнеспособного миокарда.
3А. Статистически значимых различий в моейocardial TNF-α экспрессию мРНК после 30 минут ишемии и 120 минут реперфузии. п = 4-6 в группе.
Рисунок 3B. Миокарда ИЛ-1β экспрессию мРНК через 30 минут после ишемии и реперфузии 120 минут (I / R). Существует нет существенной разницы между контролем (без операции) и фиктивный управлением (без ишемии / реперфузии) группы. п = 4-6 в каждой группе, * обозначает р <0,05.
Рисунок 3C. Миокарда IL-6 экспрессию мРНК после 30 минут ишемии и реперфузии 120 минут (I / R). Существует нет существенной разницы между контролем (без операции) и фиктивный управлением (без ишемии / реперфузии) группы. п = 4-6 в каждой группе, * обозначает р <0,05.
Рисунок 4A-C. Услышьт режущего аппарата. : Выходной с лезвиями в позиции резки. B: открытый, вид сбоку. C: открытые, вид спереди. Сердце будет согласована в паз белой пластиковой постели с его длинной оси, перпендикулярной к бритвенных лезвий (стрелка).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы модифицировали мышиный закрытой грудью модель доступа к сердцу через левый боковой межреберная торакотомия и ведущие из ЛАД швы на груди в левой межключичный линии. Выход из костной грудной клетки нетронутыми позволит свести к минимуму травмы, потребность в обезболивающих лекарственных средств, хирургических инфекций сайта и, таким образом, содействия восстановлению. Сохраняя левой внутренней артерии млекопитающих нет необходимости электрокоагуляции. Мы оставляем швом петля в подкожной ткани для последующего легкого доступа и использования висит вес системы в течение определенного окклюзии. Закрытая модель груди позволяет применять все протоколы исследований ишемии миокарда и реперфузии по отношению к хирургической травмы и последующего иммунного ответа 4. Тем не менее, выражение цитокинов РНК увеличивается на срок до 3 дней в связи с хирургической травмы у мышей, крыс и собак 4-6. Таким образом, восстановление интервалом в 5 дней должны быть соблюдены. Кроме того, эта модель позволяет использовать летучие ANESThetics для приборов, которые имеют известные предварительной эффект в течение 72 часов 7,8. опиоидов для послеоперационного болевого синдрома могут также улучшить инфаркта миокарда. Было показано, что бупренорфин функцию миокарда улучшается после глобальной ишемии миокарда 9. Однако мыши, как правило, не нуждаются в дополнительной дозы бупренорфина, если судить по наблюдения за поведением. Существует доказательство того, что хирургическая травма предшествующий инфаркт миокарда может привести "фонового" шума экспрессию цитокинов и, кроме того, модулируют размер инфаркта. Ren и соавт. показали, что удаленный хирургической травмы индуцирует предварительной сердца 10. Другие эндогенных лигандов, таких как высокая мобильность поле группы 1 (HMGB1) или белки теплового шока, которые выделяются или выделяются после травмы, как было показано модулировать функцию миокарда 11-13.
Инфаркт миокарда в догоспитальном настройки обычно происходит без прецедентДин травмы или увечья. Таким образом, хронический закрытой грудью модель позволяет более реалистично подходить к ишемии миокарда и реперфузии.
Потенциальные протоколы исследования включают ишемического и фармакологического пред-и посткондиционирования и инвазивного гемодинамического измерения. Будущие приложения этой модели может включать в себя несколько моделей хит без рассмотрения хирургической травмы контрольно-измерительных приборов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Даниэля Дюрр за его советы относительно перфузии фиксации техники.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vapor | Drägerwerk AG | Isoflo | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Light source | Schott | KL 1500 LCD | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| MiniVent Type 845 | Hugo Sachs Elektronik | ||
| 8-0 Prolene | Ethicon | BV130-5 6.5mm 3/8c | |
| 6-0 Prolene | Ethicon | BV-1 9.3 mm 3/8c | |
| Kalt suture needle size 3 | FST | 12050-03 | |
| Triphenyltetrazolium | Sigma Aldrich | 93145 | |
| Phthalo blue | Heucotech LTD | ||
| PowerLab |  ADInstruments |
References
- Lim, S. Y., Davidson, S. M., Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: the essential role of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc. Res. 75, 530-535 (2007).
- Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (50), e2526 (2011).
- Michael, L. H. Myocardial infarction and remodeling in mice: effect of reperfusion. Am. J. Physiol. 277, H660-H668 (1999).
- Nossuli, T. O. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies 52. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, H1049-H1055 (2000).
- Irwin, M. W. Tissue expression and immunolocalization of tumor necrosis factor-alpha in postinfarction dysfunctional myocardium 846. Circulation. 99, 1492-1498 (1999).
- Michael, L. H. Creatine kinase and phosphorylase in cardiac lymph: coronary occlusion and reperfusion. Am. J. Physiol. 248, 350-359 (1985).
- Tonkovic-Capin, M. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels 765. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283, H61-H68 (2002).
- Tsutsumi, Y. M. Role of caveolin-3 and glucose transporter-4 in isoflurane-induced delayed cardiac protection. Anesthesiology. 112, 1136-1145 (2010).
- Benedict, P. E., Benedict, M. B., Su, T. P., Bolling, S. F. Opiate drugs and delta-receptor-mediated myocardial protection. Circulation. 100, II357-II360 (1999).
- Ren, X., Wang, Y., Jones, W. K. TNF-alpha is required for late ischemic preconditioning but not for remote preconditioning of trauma. J. Surg. Res. 121, 120-129 (2004).
- Andrassy, M. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart. Circulation. 117, 3216-3226 (2008).
- Kim, S. C. Extracellular heat shock protein 60, cardiac myocytes, and apoptosis. Circ. Res. 105, 1186-1195 (2009).
- Lin, L. HSP60 in heart failure: abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 293, 2238-2247 (2007).
