Summary
单一的病毒基因组(SVG)是一种方法来隔离和放大的基因组单virons。病毒悬浮液的混合组合,用流式细胞仪检测到载玻片离散井含琼脂糖,从而捕获病毒粒子和减少下游加工过程中的基因组剪切排序。全基因组扩增是通过使用多重置换扩增(MDA)的产生,是适合用于测序的基因组物质中。
Abstract
全基因组扩增和测序的单一微生物细胞使基因组特性,而不需要栽培1-3。病毒,是无处不在的,我们星球上的4最众多的实体和重要的在各种环境中5,通过类似的方法尚未透露。在这里,我们描述了一种方法,用于分离和表征单个病毒颗粒的基因组被称为“单个病毒的基因组学”(SVG)。 SVG利用流式细胞仪分离单个病毒和全基因组扩增,得到高分子量的基因组DNA(基因组DNA),可以用于在随后的测序反应。
Protocol
1。病毒悬浮液的制备
通过流式细胞仪分离出单个病毒颗粒之前,准备不固定的病毒悬液。
- 使用先前建立的协议,确保最终的病毒悬浮液中分离病毒颗粒被包含在0.1微米过滤TE液(Tris-EDTA,pH8)中。我们建议您使用其他方法虽然已开发出采用化学絮凝7切向流过滤(TFF)接近6。
- 枚举使用既定的协议, 例如 ,使用萤光8-10或流式细胞仪11,12的病毒颗粒。
- 病毒悬浮液的等分试样分成两个Eppendorf管中(最终体积是1,000微升)。
2。流式细胞仪
- 病毒使用BD FACSAria II流式细胞仪配备一个自定义的前向散射的PMT(FSC PMT)排序,稀释病毒颗粒在0.1微米过滤TE,pH值8。0到适当的事件发生率为200赛事秒-1滴度。
- 设置阈值,以最大限度地提高信号与噪声的口粮, 例如 。含有T4和λ噬菌体颗粒的混合组合建议:在1000和SSC FSC PMT 200。
- 运行100微升的“空白”样品只含有1)0.1微米过滤TE和2)0.1微米的过滤TE和SybrGreen1的1E-4的股票稀释(10,000倍)。
- 运行一个小等分不染病毒悬浮液(100微升),以评估背景,其次是染病毒悬液(SybrGreen1 1E-4的股票稀释),病毒颗粒共5000事件。这是检查浓度和调整分配门,如有必要,在排序前。我们建议紧栅的中心的病毒颗粒。另外,门,我们使用的SYBR Green和FSC PMT情节。
- 加入5μl的1%低熔点(LMP)琼脂糖(在TBE缓冲液)冷却至37℃到每个以及在一个聚四氟乙烯(PTFE)的显微镜载片上(电子显微学)。
- 装入PTFE显微镜的幻灯片到流式细胞仪捕捉到排序的病毒颗粒。
- SYBR绿色染病毒颗粒直接到四氟滑板与LMP琼脂糖开始排序。我们建议使用10个或更多的事件(病毒颗粒)在某些井进行排序,以帮助在共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)的深度的病毒的检测。
- 当排序完成流式细胞仪,删除幻灯片,加入5微升LMP琼脂糖冷却到37°C,每孔,从而嵌入病毒颗粒(次)。
3。可视化单的病毒粒子,利用共聚焦显微镜
如果需要一个单一的病毒粒子,然后确定每个包含一个单独的病毒是势在必行,激光共聚焦显微镜是必要的,以可视化的嵌入式病毒颗粒(S)在3D验证,只有一个单一的粒子存在,而且多种病毒不堆叠在彼此的顶部。
- 置显微镜激光的波长488 nm激发。
- 图片嵌入式病毒颗粒使用63X长工作距离的目标。
4。全基因组扩增
- 井与单一病毒一旦确定与激光共聚焦显微镜,琼脂糖( 原位 )内使用多重置换扩增(MDA)进行全基因组扩增。
- 为了减少引入DNA污染的可能性,取出所需的琼脂糖珠从滑动,并放置在无菌的PCR管中。使用无菌镊子和/或刀片用于此步骤中的一对。
- 裂解病毒粒子中就地采用热(94℃)的热循环仪的加热块中的3分。
- 执行以下修改MDA反应下列制造商的建议(GenomiPhi HY试剂盒,GE医疗)
- 减少体积的样品和反应BUF指11.25微升和孵化,在30°C,最多2小时,以减少非特异性扩增。
- 纯化扩增的基因组物质的基因组DNA(基因组DNA)转移到1.7毫升的Eppendorf管中,加1/10体积的3M醋酸钠(醋酸钠)在TBE缓冲液(LMP琼脂糖凝胶制剂中使用的相同的缓冲液)。
- 将样品(次),在55℃10分钟以溶解琼脂糖。
- 移动管(S)到42℃,以减少温度之前加入酶。
- 新增2个β-琼胶每个管和孵化2小时。
- 加入1倍体积的缓冲液饱和的苯酚溶液的试管中,剧烈混合,在3500×g离心15分钟,离心。将上清转移到新的1.7毫升的Eppendorf管中含有DNA。
- 添加一个体积100%异丙醇和加入1μlGlycoblue。拌匀倒相管。
- 在4℃以28,000 xg离心60分钟。倒出异丙醇,确保不打扰颗粒。加入150μl70%ETHA酚每个试管中。旋转28,000的XG及RT 10分钟。倒出乙醇,空气干燥DNA沉淀,并在适当体积的TE缓冲液中重悬DNA。
- 我们建议以下修改重复步骤4.4-4.9。设置3-5复制MDA反应和减少孵化,在30℃至1小时。池样品后,纯化和沉淀物,用95%-100%的乙醇,以取得所需的浓度。
5。代表结果
图1总结了SVG过程。这些方法使用流式细胞仪检测到病毒颗粒PTFE显微镜载玻片含琼脂糖分离单个的病毒颗粒从混合组合,然后由MDA获得数量足够进行测序的基因组DNA进行排序。
作为一个证明的概念,λ噬菌体T4混合SVG过程11。病毒颗粒一旦被抓获,并嵌入琼脂糖,激光共聚焦显微镜WA用来在不同可视化和确认一个单一的病毒粒子,得到的结果示于图2中,一旦与单个病毒粒子的孔中被确定,他们被选择为丙二醛(MDA)的基因组DNA。然后,我们使用的多重PCR具体T4和lambda来识别这种病毒的分离, 如图3所示。一个孤立的噬菌体基因组测序选择。
进行基因组测序,使用454-乙酸进行引用映射到识别的覆盖水平得到使用SVG的技术和测序读取。 如图4所示,几乎整个的λ基因组回收(与异常的第5个碱基)。
图1。 SVG方法。含有病毒悬液混合组合减少到单个病毒颗粒通过流式细胞仪则sorted到个人琼脂糖“珠”。该病毒嵌入在琼脂糖珠叠加一层额外的琼脂糖后流式细胞仪分选。最后, 在原位进行全基因组扩增。
图2。激光扫描共聚焦显微镜的排序病毒粒子嵌入在琼脂糖珠A)三维重建的SYBR Green I的的染病毒颗粒内的琼脂糖珠。插图:更高的放大倍率孤立的病毒粒子B)剖面图相对荧光染色的单个病毒颗粒内的琼脂糖珠。
图3。噬菌体鉴定采用PCR A)</ STRONG>多重PCR使用T4和lambda特异性引物的基因型,车道:1。则TrackIT 1 kb的加入水口(Invitrogen公司),2。拉姆达整合(750 bp)的,3。 T4的主要衣壳蛋白(1050碱基对),4。混合的lambda整合和T4的主要衣壳蛋白B)后续的lambda与其他位点特异性PCR进一步证实噬菌体基因组隔离,车道:1。拉姆达整合(750 bp)的,2。拉姆达阻遏(356个基点)3。拉姆达SIE(二重感染排除)(456个基点)4。则TrackIT 1 KB加梯(Invitrogen公司)。
图4。拉姆达基因组属性和覆盖范围。)GC情节,B)的基因组图谱的lambda(改编自http://img.jgi.doe.gov ),和C)的SVG读取映射参考λ噬菌体,x轴基因组的位置,雅红双喜%的覆盖率。
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Discussion
应用SVG方法时,必须考虑一些重要因素。基因分型,在概念证明型实验13,是不是保守引物的环境或未知的菌株可在所有病毒组的有效选项。此外,背景DNA合成或非特异性扩增常见的扩增过程中使用MDA反应14。非特异性扩增已被归因于新兴的反应试剂和/或通过一种机制,允许从随机六聚体在反应混合物中的扩增的DNA污染。当使用病毒的组合,有可能是一个更高的可能性由于作为粒子的显着差异(小区)的大小和基因组DNA的含量的结果,而不是单一的细菌细胞的病毒DNA模板量较低优先扩增的非特异性DNA( 25-100纳米〜1.5 fg的病毒,如反对0.2-1.5微米〜14 fg的细菌)。建议使用下面的方法,以减少非特异性扩增水平:治疗病毒性组合用DNase I,含有琼脂糖珠利用激光共聚焦显微镜检查病毒,减少的MDA孵化时间,增加了深度测序( 即能与新一代测序技术454-钛和Illumina公司等)。
执行SVG环境样品时,优化的从头组装必须取得完整或近乎完整的基因组序列。我们已经发现,减少了冗余读出在组装之前是必要的,以取得更大的覆盖范围13。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
愿我们,感谢肯Nealson的整个手稿的准备过程中他的见解和建议。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
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