Summary
Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor het rangschikken.
Abstract
Whole genome amplificatie en sequentiebepaling van afzonderlijke microbiële cellen kunnen genoomkarakterisering zonder van de teelt 1-3. Virussen, die alomtegenwoordig en de meest talrijke entiteiten op onze planeet 4 en belangrijk in alle omgevingen 5 zijn, moeten nog worden onthuld via een vergelijkbare aanpak. Hier beschrijven we een aanpak voor het isoleren en karakteriseren van de genomen van enkele virusdeeltjes genaamd 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG gebruikt flowcytometrie individuele virussen en gehele genoom amplificatie isoleren hoog molecuulgewicht genomisch DNA (gDNA) dat kan worden gebruikt in daaropvolgende sequentie-vinden.
Protocol
1. Voorbereiding van Viral Schorsingen
Vóór isolatie van enkele virusdeeltjes via flowcytometrie, bereiden vastgelegde virale schorsingen.
- Isoleer virale deeltjes met behulp van vooraf vastgestelde protocollen en zorg ervoor uiteindelijke virale suspensie bevindt zich in 0,1 micrometer-gefilterde TE (Tris-EDTA, pH 8). Wij raden het gebruik van tangentiële stroom filtratie (TFF) benadert 6 hoewel ook andere methoden zijn ontwikkeld die gebruik chemische flocculatie 7.
- Inventariseer virale deeltjes met behulp van vastgestelde protocollen, bijvoorbeeld met behulp van epifluorescentie 8-10 of flowcytometrie 11,12.
- Aliquot virussuspensie in twee Eppendorf buizen (eindvolume wordt aanbevolen 1.000 III zijn).
2. Flowcytometrie
- Om virussen met behulp van de BD FACSAria II flowcytometer uitgerust met een aangepaste Forward Scatter PMT (FSC PMT) sorteren, verdunnen virale deeltjes in 0,1 micrometer-gefilterd TE, pH 8.0 om een geschikte titer voor een evenement van 200 evenementen sec -1.
- Drempels om signaal-naar-ruis rantsoenen te optimaliseren, bijvoorbeeld. een gemengde assemblage met T4 en lambda faag partikels de volgende aanbevolen: FSC PMT bij 1000 en SSC bij 200.
- Run 100 ul van "lege" monsters met alleen 1) 0.1 micrometer-gefilterd TE en 2) 0.1 micrometer-gefilterd TE en SybrGreen1 bij 1e-4 verdunning van voorraad (10000 X).
- Voer een klein monster (100 pl wordt aanbevolen) van ongekleurde virussuspensie achtergrondinformatie beoordelen, gevolgd door de gekleurde virussuspensie (SybrGreen1 bij 1e-4 verdunning van voorraad), virale deeltjes in totaal 5000 evenementen per. Dit is om de concentratie te controleren en aan te passen sorteren poorten eventueel vóór sorteren. Wij raden een strakke poort in het centrum van virale deeltjes. Ook voor het genereren poorten gebruiken we de SYBR Green en FSC PMT plot.
- Voeg 5 ul van 1% laag smeltpunt (LMP) agarose (in TBE buffer) gekoeld tot 37 ° C aan elkegoed op een polytetrafluorethyleen (PTFE) microscoopdia (Electron Microscopy Sciences).
- Laad de PTFE microscoop dia in de flowcytometer om naargelang virale deeltjes op te vangen.
- Begin soort SYBR groen gekleurd virale deeltjes direct op PTFE dia met LMP agarose. Wij raden sortering 10 of meer evenementen (virale deeltjes) in sommige putten om te helpen bij de opsporing van de diepte van virussen tijdens confocale laser scanning microscopie (CSLM).
- Wanneer sorteren is voltooid, verwijdert de dia flowcytometer en voeg 5 ul meer LMP agarose gekoeld tot 37 ° C aan elk putje, waardoor de inbedding virale deeltje (s).
3. Visualiseren van Single Virionen met confocale microscopie
Als een virion wordt gewenst, dan bepalen of elke well bevat een individu virus is noodzakelijk en CLSM noodzakelijk het ingesloten virion (s) in 3D te verifiëren dat slechts een deeltje aanwezig is, te visualiseren meerdere virussenniet gestapeld bovenop elkaar.
- Stel de microscoop laser bij de golflengte 488 nm excitatie.
- Afbeelding van de ingebedde virale deeltjes met behulp van een 63X lange werkende objectieve afstand.
4. Whole Genome Amplification
- Zodra putten met enkele virussen worden geïdentificeerd met CLSM, presteren gehele genoom amplificatie met behulp van meerdere verplaatsing amplificatie (MDA) binnen de agarose (in situ).
- Om de kans op introductie van contaminatie DNA afnemen, verwijdert u de gewenste agarose 'parels' van de glijbaan en geplaatst in een steriele PCR-buis. Volgt met een steriele pincet en / of scheermesje voor deze stap.
- Lyse het virale deeltje in situ met hitte (94 ° C) gedurende 3 minuten in het verwarmingsblok van een thermocycler.
- Voer de aanbevelingen van de MDA reactie volgende fabrikant (GenomiPhi HY kit, GE Healthcare) met de volgende wijzigingen
- Verminder het volume van het monster en de reactie buffers om 11.25 ui en incubeer bij 30 ° C gedurende maximaal 2 uur om specifieke amplificatie te verminderen.
- Zuiver het geamplificeerde genomisch materiaal door overdracht genomisch DNA (gDNA) een 1,7 ml Eppendorf buis en voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat (NaOAc) in TBE buffer (dezelfde buffer in LMP agarose voorbereiding).
- Het monster (s) bij 55 ° C gedurende 10 min aan agarose lossen.
- Verplaats tube (s) tot 42 ° C om de temperatuur te verlagen voorafgaand aan het toevoegen van enzym.
- Voeg 2 units β-agarase aan elke buis en incubeer gedurende 2 uur.
- Voeg 1 volume van een buffer-verzadigde fenol-oplossing aan de buis, meng grondig en centrifugeer bij 3500 xg gedurende 15 minuten. Overdragen supernatant dat DNA een nieuwe 1,7 ml Eppendorf buis.
- Voeg een volume 100% isopropanol en 1 pl Glycoblue. Meng goed door het buisje.
- Centrifugeer bij 28.000 xg bij 4 ° C gedurende 60 minuten. Decanteren isopropanol zorg ervoor dat de pellet niet te verstoren. Voeg 150 ul van 70% ethanol aan elke buis. Spin bij 28.000 xg en RT gedurende 10 min. Giet de ethanol, lucht droog de DNA pellet opnieuw in suspensie en het DNA in een geschikt volume TE buffer.
- Wij raden herhalen van de stappen 4,4-4,9 met de volgende wijzigingen. Stel 3-5 repliceren MDA reacties en verminderen incubatie bij 30 ° C en 1 uur. Pool monsters na zuivering en neerslag met 95-100% ethanol om de gewenste concentratie te verkrijgen.
5. Representatieve resultaten
Figuur 1 geeft een overzicht van de SVG-proces. Deze methoden gebruiken flowcytometrie om virale deeltjes te sorteren op PTFE objectglaasjes met agarose om enkele virusdeeltjes isoleren van een gemengde assemblage gevolgd door MDA op de hoeveelheden van gDNA dat voldoende is voor het rangschikken zijn te verkrijgen.
Als een proof-of-concept, werden bacteriofaag lambda en T4 gemengd en onderworpen aan de SVG-proces 11. Zodra virionen werden gevangen genomen en ingebed in agarose, CLSM was voor het visualiseren en te bevestigen dat een virion verkregen;. resultaten worden getoond in Figuur 2 wells eenmaal met enkele virions werden geïdentificeerd, werden ze geselecteerd MDA van gDNA. Vervolgens gebruikte multiplex PCR specifiek voor T4 en lambda het virion geïsoleerd, figuur 3. Identificeren Een geïsoleerde faag lambda werd geselecteerd genoom.
Genome sequencing werd uitgevoerd met 454-titaniumtechnologie, sequentiebepaling leest werden onderworpen aan mapping verwijzing naar de dekking verkregen middels SVG identificeren. Figuur 4 toont dat bijna de gehele lambda genoom werd verkregen (met uitzondering van de eerste 5 bp).
Figuur 1. SVG methodologie. Viral suspensies die een gemengde assemblage worden gereduceerd tot enkele virusdeeltjes via flowcytometrie die vervolgens zijn sorted op individuele agarose "parels". Het virus wordt ingebed in de agarose kraal door bedekken met een extra laag van agarose na flowcytometrische sorteren. Ten slotte wordt het gehele genoom amplificatie uitgevoerd in situ.
Figuur 2. Confocale laser scanning microscoop foto van een gesorteerde virusdeeltje ingebed in een agarose kraal. A) Driedimensionale reconstructie van een Sybr Green I-lood virusdeeltje in een agarose kraal. Inzet: hogere vergroting van de geïsoleerde virusdeeltje B) Profiel perceel van relatieve fluorescentie van de vlek enkel virusdeeltje in een agarose kraal..
Figuur 3. Bacteriofaag identificatie middels PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR met T4 en lambda-specifieke primers om genotype, Lanen: 1. Trackit 1 kb plus ladder (Invitrogen), 2. lambda integrase (750 bp), 3. T4 hoofdcapside eiwit (1050 bp), 4. . Mix van lambda integrase en T4 grote capsideproteïne B) Na lambda specifieke PCR met extra loci verder te bevestigen faaggenoom isolatie, Lanen: 1. Lambda integrase (750 bp), 2. Lambda repressor (356 bp) 3. Lambda sie (superinfectie uitsluiting) (456 bp) 4. Trackit 1 kb plus ladder (Invitrogen).
Figuur 4. Lambda genoom attributen en dekking. A) GC plot, B) Genoom kaart van lambda (naar http://img.jgi.doe.gov ) en C) Mapping van SVG leest de referentie bacteriofaag lambda, x-as genoom positie, yaXIS is% dekking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een aantal belangrijke factoren moeten in aanmerking worden genomen bij de toepassing van SVG benaderingen. Genotypering, zoals werd uitgevoerd tijdens de proof-of-concept experiment 13, is geen geldige optie voor milieu-of onbekende isolaten als geconserveerde primers zijn niet beschikbaar in alle virale groepen. Ook wordt achtergrond DNA-synthese of specifieke amplificatie vaak gerapporteerd tijdens amplificatie met behulp van de MDA reactie 14. Specifieke amplificatie wordt toegeschreven aan contaminerende DNA die uit reactie reagentia en / of een formule die amplificatie mogelijk maakt van de willekeurige hexameren in het reactiemengsel. Bij het werken met virale assemblages, is er misschien een hogere waarschijnlijkheid van aspecifieke DNAs geamplificeerd voorkeur vanwege de lagere hoeveelheid template DNA virale tegenover bacterie-cellen als gevolg van het grote verschil in deeltjes (cellen) grootte en genomisch DNA inhoud ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg virussen, zoalstegen 0,2-1,5 um, ~ 14 fg voor bacteriën). De volgende methoden aanbevolen om het niveau van niet-specifieke amplificatie beperken: behandeling van virale assemblages met DNase I behandeling van virus dat middels agarose korrels CLSM, vermindering van MDA incubatietijd en verhoogde sequentie diepte (dwz staat met next generation sequencing technologie zoals 454-Titanium en Illumina).
Bij het uitvoeren van SVG op milieu monsters, geoptimaliseerd novo assemblage is het noodzakelijk om volledige of bijna volledige genoom sequenties te verkrijgen. Wij hebben gevonden dat het verminderen van de overbodige leest vóór de montage noodzakelijk om een groter 13 te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij willen Ken Nealson bedanken voor zijn inzicht en advies tijdens het manuscript voorbereidingsproces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
