Summary
La génomique des virus simples (SVG) est une méthode pour isoler et d'amplifier le génome de virions isolés. Suspensions virales d'un assemblage mixte sont triées par cytométrie de flux sur une lame de microscope, avec des puits discrètes contenant l'agarose, capturant ainsi le virion, et la réduction de cisaillement du génome au cours du traitement en aval. Amplification du génome entier est obtenue en utilisant une amplification par déplacement multiple (MDA) résultant en matériel génomique qui est approprié pour le séquençage.
Abstract
Amplification du génome entier et le séquençage de cellules microbiennes simples permet une caractérisation génomique sans le besoin de la culture 1-3. Les virus, qui sont omniprésentes et les plus nombreuses entités de notre planète et 4 importante dans tous les environnements, 5 n'ont pas encore été révélé par des approches similaires. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et caractériser les génomes des virions single intitulé «Génomique de virus unique» (SVG). SVG utilise la cytométrie en flux pour isoler les virus individuels et amplification du génome entier pour obtenir un ADN génomique de haut poids moléculaire (ADNg) qui peut être utilisé dans des réactions de séquençage suivantes.
Protocol
1. Préparation des suspensions virales
Avant d'isolement des virions par l'intermédiaire de simples cytométrie de flux, préparer des suspensions virales non fixées.
- Isoler des particules virales en utilisant des protocoles déjà établis en s'assurant suspension virale finale est contenue dans 0,1 um-filtré TE (Tris-EDTA, pH 8). Nous vous recommandons d'utiliser la filtration à flux tangentiel (TFF) s'approche 6 bien que d'autres méthodes ont été développées qui utilisent la floculation chimique 7.
- Énumérer des particules virales en utilisant des protocoles établis, par exemple en utilisant 8-10 épifluorescence ou la cytométrie de flux 11,12.
- Aliquote de suspension virale dans deux tubes Eppendorf (volume final est recommandé d'être 1.000 pi).
2. cytométrie en flux
- Pour trier les virus utilisant le FACSAria cytomètre de flux BD II équipé d'un PMT Forward Scatter personnalisé (FSC PMT), diluer les particules virales dans 0,1 um-filtré TE, pH 8.0 à un titrage approprié pour un taux d'événement d'événements 200 sec -1.
- Définir des seuils pour maximiser rations signal-sur-bruit, par exemple. pour un assemblage mixte contenant des particules de phage T4 et lambda qui suit est recommandée: FSC PMT à 1000 et SSC à 200.
- Exécutez 100 pi d'échantillons «blanc» ne contenant que 1) 0,1 um-filtré TE et 2) 0,1 um-filtré TE et SybrGreen1 au 1e-4 dilution de stock (10.000 X).
- Exécuter une petite aliquote (100 pi est recommandé) de suspension virale sans tache pour évaluer fond, suivie de la suspension virale teinté (SybrGreen1 au 1e-4 dilution de stock), les particules virales à un total de 5.000 événements chacune. Il s'agit de vérifier la concentration et régler les portes de tri, si nécessaire, avant de trier. Nous recommandons une porte étanche dans le centre de particules virales. Aussi, pour générer des portes, nous utilisons le SYBR Green et FSC PMT terrain.
- Ajouter 5 ul de 1% point de fusion bas (LMP) agarose (en tampon TBE) refroidi à 37 ° C pour chaquebien sur un (PTFE) lame de microscope polytétrafluoroéthylène (Electron Microscopy Sciences).
- Charger la lame de microscope en PTFE dans le cytomètre en flux pour capturer les particules virales trié.
- Commencez sorte de SYBR Green particules virales colorés directement sur PTFE diaporama avec agarose LMP. Nous vous recommandons de tri plus de 10 événements (particules virales) dans certains puits pour aider à la détection de la profondeur du virus au cours de la microscopie confocale à balayage laser (CSLM).
- Lorsque le tri est terminé, retirez lame du cytomètre en flux et ajouter 5 pi plus agarose LMP refroidi à 37 ° C pour chaque puits, intégrant ainsi la particule virale (s).
3. Visualisation des virions simple en utilisant la microscopie confocale
Si un seul virion est désirée, puis à déterminer si chaque puits contient un virus particulier est impératif et BFRC est nécessaire pour visualiser le virion incorporé (s) en 3D pour vérifier qu'une seule particule est présente et que plusieurs virusne sont pas empilées les unes sur les autres.
- Réglez le laser du microscope à la longueur d'onde 488 nm d'excitation.
- Image des particules virales intégrées à l'aide d'une longue distance de travail objectif 63X.
4. Amplification du génome entier
- Une fois les puits par des virus individuels sont identifiés par BFRC, effectuer une amplification du génome en utilisant l'amplification par déplacement multiple (MDA) dans de l'agarose (in situ).
- Pour réduire la probabilité d'introduction de contamination de l'ADN, enlever les «perles» souhaités agarose de la glissière et placé dans un tube PCR stérile. Utilisation d'une paire de pinces stériles et / ou des lames de rasoir pour cette étape.
- Lyser la particule virale in situ en utilisant la chaleur (94 ° C) pendant 3 min dans le bloc thermique d'un thermocycleur.
- Effectuer les recommandations de la MDA réaction suivante fabricant (GenomiPhi kit HY, GE Healthcare) avec les modifications suivantes
- Réduire le volume de l'échantillon et buf de réactionréfère à 11,25 pi et incuber à 30 ° C pendant un maximum de 2 heures pour réduire l'amplification non spécifique.
- On purifie le matériel génomique amplifié par le transfert d'ADN génomique (ADNg) à un tube Eppendorf de 1.7 ml et ajouter 1/10 de volume de 3M acétate de sodium (NaOAc) dans un tampon TBE (même tampon utilisé dans la préparation d'agarose LMP).
- Placer l'échantillon (s) à 55 ° C pendant 10 minutes pour dissoudre l'agarose.
- Déplacer tube (s) à 42 ° C pour réduire la température avant d'ajouter l'enzyme.
- Ajouter 2 unités β-agarase à chaque tube et incuber pendant 2 heures.
- Ajouter 1 volume d'une solution de phénol saturé de tampon dans le tube, mélanger vigoureusement et centrifuger à 3500 g pendant 15 min. Transfert d'ADN contenant le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf de 1,7 ml.
- Ajouter un volume de 100% d'isopropanol et 1 microlitre de Glycoblue. Bien mélanger en retournant le tube.
- Centrifuger à 28000 g à 4 ° C pendant 60 min. Décanter isopropanol veillant à ne pas perturber le culot. Ajouter 150 ul de 70% ethanol à chaque tube. Tourner à 28.000 xg et RT pendant 10 min. Décanter l'éthanol, l'air sec le culot d'ADN et remettre l'ADN dans un volume approprié de tampon TE.
- Nous vous recommandons de répéter les étapes 4.4 à 4.9 avec les modifications suivantes. Mettre en place 3-5 réactions MDA répétés et réduire incubation à 30 ° C à 1 h. échantillons de piscine après purification et précipité avec de l'éthanol à 95-100% pour obtenir la concentration voulue.
5. Les résultats représentatifs
La figure 1 résume le processus SVG. Ces méthodes utilisent la cytométrie en flux pour trier les particules virales sur des lames de microscope PTFE contenant agarose pour isoler les virions simples à partir d'un assemblage mixte suivie par MDA pour obtenir des quantités de gDNA qui sont suffisants pour le séquençage.
Comme une de preuve de concept, bactériophage lambda et T4 ont été mélangés et soumis au processus SVG 11. Une fois virions ont été capturés et intégrés dans agarose, CLSM was permet de visualiser et de confirmer qu'un seul virion a été obtenu;. résultats sont présentés dans la figure 2 Une fois les puits avec virions individuels ont été identifiés, ils ont été choisis pour MDA de gDNA. Nous avons ensuite utilisé la PCR multiplex spécifique pour les T4 et lambda pour identifier le virion isolé, Figure 3. Un isolé phage lambda a été sélectionné pour le séquençage du génome.
Le séquençage du génome a été réalisée en utilisant la technologie 454-titane et le séquençage lectures ont été soumis à référencer cartographie pour identifier le niveau de protection obtenu avec SVG. Figure 4 montre que presque la totalité du génome lambda a été récupéré (à l'exception des 5 premières pb).
Figure 1. SVG méthodologie. Suspensions virales contenant un assemblage mixte sont réduits à des particules virales uniques par cytométrie de flux qui sont ensuite ssignalés auparavant sur chaque agarose "perles". Le virus est incorporé dans le talon agarose par la superposition d'une couche supplémentaire de poste écoulement tri par cytométrie agarose. Enfin, toute amplification du génome est effectuée in situ.
Figure 2. Confocale à balayage laser micrographie d'une particule virale triés noyé dans un cordon d'agarose. A) reconstruction tridimensionnelle d'une particule virale verte I-teinté Sybr l'intérieur d'un bourrelet d'agarose. Encart: plus fort grossissement de la particule virale isolée B) Profil parcelle de fluorescence relative de la particule virale unique teinté dans une perle agarose..
Figure 3. l'identification des bactériophages en utilisant la PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR utilisant des amorces T4 et lambda-spécifique de génotype, Lanes: 1. TrackIt 1 kb ainsi échelle (Invitrogen), 2. lambda intégrase (750 pb), 3. T4 protéine majeure de capside (1050 pb), 4. . Mélange de lambda intégrase et la protéine majeure de capside T4 B) Après lambda PCR spécifique avec loci supplémentaires pour confirmer davantage d'isolement du génome du phage, Lanes: 1. Lambda intégrase (750 pb), 2. Répresseur lambda (356 pb) 3. Lambda sie (exclusion de surinfection) (456 pb) 4. TrackIt 1 kb ainsi échelle (Invitrogen).
Figure 4. Lambda attributs génome et la couverture. A) GC intrigue, B) Carte génome de lambda (adapté de http://img.jgi.doe.gov ), et c) la cartographie de SVG lit à la référence bactériophage lambda, l'axe des x est la position du génome, yaxis est% de couverture.
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Discussion
Un certain nombre de facteurs importants doivent être pris en considération lors de l'application d'approches SVG. Génotypage, comme cela a été effectué au cours de la preuve de concept de l'expérience 13, n'est pas une option valable pour les isolats environnementaux ou inconnus comme amorces conservées ne sont pas disponibles dans tous les groupes virales. Aussi, fond synthèse de l'ADN ou de l'amplification non spécifique est fréquemment rapportées lors de l'amplification en utilisant la réaction MDA 14. Amplification non spécifique a été attribué à l'ADN contaminant émergeant de réactifs de réaction et / ou à travers un mécanisme qui permet l'amplification des hexamères aléatoires dans le mélange réactionnel. Lorsque vous travaillez avec des assemblages viraux, il ya peut-être une plus grande probabilité d'ADN non spécifiques préférentiellement amplifié en raison de la plus faible quantité d'ADN viral de modèle, par opposition aux cellules bactériennes simples en raison de la différence importante de particules (cellules) de la taille et la teneur en ADN génomique ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg pour les virus, commeopposition à 0,2-1,5 um; ~ 14 fg pour les bactéries). Les méthodes suivantes sont recommandées afin de réduire le niveau d'amplification non spécifique: le traitement des assemblages virales avec la DNase I, l'examen des virus contenant des billes d'agarose en utilisant CLSM, la réduction du temps d'incubation MDA et augmentation de la profondeur de séquençage (c'est à dire comme est capable de technologies de séquençage de prochaine génération comme 454-titane et Illumina).
Lors de l'exécution SVG sur des échantillons environnementaux, l'assemblage optimisé de novo est impératif d'obtenir des séquences complètes ou quasi-complète du génome. Nous avons constaté que la réduction de la redondance lit avant l'assemblage est nécessaire pour obtenir une plus grande couverture 13.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Ken Nealson pour sa perspicacité et conseils tout au long du processus de préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
