Summary
Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung geeignete ist.
Abstract
Amplifikation des gesamten Genoms und Aneinanderreihung einzelner mikrobiellen Zellen ermöglicht Genoms ohne die Notwendigkeit des Anbaus 1-3. Viren, die allgegenwärtig und die meisten zahlreiche Unternehmen auf unserem Planeten 4 und wichtig in allen Umgebungen 5 sind, müssen noch über ähnliche Ansätze aufgedeckt werden. Hier beschreiben wir einen Ansatz für die Isolierung und Charakterisierung der Genome einzelner Virionen genannt 'Single Virus Genomics "(SVG). SVG verwendet Durchflusszytometrie einzelnen Viren, Amplifikation des gesamten Genoms zu isolieren, um hochmolekulare genomische DNA (gDNA), die in nachfolgenden Reaktionen Sequenzierung verwendet werden können erhalten.
Protocol
1. Herstellung von Virussuspensionen
Vor Isolierung einzelner Virionen über Durchflusszytometrie, bereiten fixierten Virussuspensionen.
- Isolieren Viruspartikel mit vorher etablierten Protokollen sicherstellen endgültigen Virussuspension wird in 0,1 enthielt um filtriert TE (Tris-EDTA, pH 8). Wir empfehlen die Verwendung Tangentialflussfiltration (TFF) nähert 6 obwohl andere Methoden entwickelt wurden, die Verwendung chemischer Flockung 7.
- Aufzählen Viruspartikel mit etablierten Protokollen, z. B. mit Epifluoreszenz 8-10 oder Durchflusszytometrie 11,12.
- Aliquot viralen Suspension in zwei Eppendorf-Röhrchen (Endvolumen wird empfohlen, bis 1000 ul sein).
2. Durchflusszytometrie
- Um Viren mit dem BD FACSAria II Durchflusszytometer mit einem benutzerdefinierten Forward Scatter PMT (FSC PMT) ausgestattet sortieren, verdünnen Viruspartikel in 0,1 um filtriert TE, pH 8.0 zu einem geeigneten Titer für eine Veranstaltung von 200 Veranstaltungen sec -1.
- Schwellenwerte, um das Signal-zu-Rausch-Rationen zu maximieren, zB. für eine gemischte Montage mit T4 und Lambda-Phagen-Partikel die folgende empfohlen: FSC PMT bei 1.000 und bei 200 SSC.
- Run 100 ul "blank" Proben, die nur 1) 0,1 um filtriert und TE 2) 0,1 um filtriert und TE SybrGreen1 bei 1e-4 Verdünnung Lager (10.000 X).
- Führen Sie ein kleines Aliquot (100 ul wird empfohlen) von ungefärbten viralen Suspension Hintergrund zu bewerten, durch die virale gefärbten Suspension (SybrGreen1 bei 1e-4 Verdünnung stock), virale Partikel zu insgesamt 5.000 Veranstaltungen pro gefolgt. Dies ist, um die Konzentration zu überprüfen und anzupassen Weichen, falls erforderlich, vor sort. Wir empfehlen eine enge Tor im Zentrum von Viruspartikeln. Auch zur Erzeugung von Toren nutzen wir die SYBR Green und FSC PMT Grundstück.
- In 5 ul 1% niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose (in TBE-Puffer), abgekühlt auf 37 ° C zu jedemgut auf einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Objektträger (Electron Microscopy Sciences).
- Laden Sie die PTFE Objektträger in Durchflusszytometer sortiert viralen Partikel zu erfassen.
- Beginnen Art von SYBR grün gefärbten Viruspartikel direkt auf PTFE Folie mit LMP-Agarose. Wir empfehlen Sortierung 10 oder mehr Veranstaltungen (Viruspartikel) in einigen Brunnen in der Erfassung der Tiefe der Viren während der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) unterstützen.
- Bei Sortierung abgeschlossen ist, entfernen Folie aus der Durchflusszytometer und mit 5 ul mehr LMP Agarose abgekühlt auf 37 ° C in jede Vertiefung, damit die Einbettung der Viruspartikel (n).
3. Visualizing Einzel Virionen mit konfokale Mikroskopie
Wenn ein einzelnes Virion erwünscht ist, dann Bestimmen, ob jeder Vertiefung enthält eine einzelne Virus unumgänglich ist und CLSM ist notwendig, um die eingebettete Virion (s) in 3D um sicherzustellen, dass nur ein einzelnes Teilchen vorhanden ist und visualisieren mehrere Virensind nicht auf der jeweils anderen gestapelt.
- Stellen Sie das Mikroskop Laser der Wellenlänge 488 nm Anregung.
- Bild die eingebetteten Viruspartikeln mit einem 63X langen Arbeitsabstand Ziel.
4. Whole Genome Amplification
- Sobald Vertiefungen mit einzelnen Viren mit CLSM identifiziert, führen Amplifikation des gesamten Genoms mit mehreren Displacement Amplification (MDA) in der Agarose (in situ).
- Um die Wahrscheinlichkeit der Einführung von DNA-Kontaminationen zu verringern, nehmen Sie die gewünschten Agarose 'Perlen' aus der Folie und in eine sterile PCR-Röhrchen. Verwenden Sie ein Paar sterile Pinzette und / oder einer Rasierklinge für diesen Schritt.
- Lyse der viralen Partikel in situ unter Verwendung von Wärme (94 ° C) für 3 min in der Hitze Block von einem Thermocycler.
- Führen Sie den MDA Reaktion folgenden Empfehlungen des Herstellers (GenomiPhi HY Kit, GE Healthcare) mit den folgenden Modifikationen
- Reduzieren Sie die Lautstärke der Probe und der Reaktion buffers auf 11,25 ul und Inkubation bei 30 ° C für maximal 2 Stunden, um unspezifische Amplifikation zu reduzieren.
- Reinigen Sie die amplifizierte genomische Material durch die Übertragung von genomischer DNA (gDNA) zu einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen und fügen Sie 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (NaOAc) in TBE-Puffer (gleichen Puffer in LMP-Agarose Zubereitung verwendet).
- Man gibt die Probe (n) bei 55 ° C für 10 min auflösen Agarose.
- Bewegen Rohr (s) bis 42 ° C um die Temperatur zu reduzieren, bevor Zugabe des Enzyms.
- In 2 Einheiten β-Agarase in jedes Röhrchen und Inkubation für 2 Stunden.
- 1 Volumen eines Puffers-gesättigtem Phenol-Lösung mit dem Rohr, kräftig mischen und zentrifugieren bei 3.500 xg für 15 min. Überstand die DNA zu einem neuen 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen.
- In einem Volumen von 100% Isopropanol und 1 ul GlycoBlue. Gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens.
- Zentrifuge bei 28.000 xg bei 4 ° C für 60 min. Dekantieren Isopropanol was sicher nicht um das Pellet zu stören. In 150 ul 70% ethanol in jedes Röhrchen. Spin bei 28.000 xg und RT für 10 min. Dekantiert das Ethanol, trockene Luft und das DNA-Pellet resuspendieren die DNA in einem geeigneten Volumen TE-Puffer.
- Wir empfehlen die Schritte 4.4-4.9 mit den folgenden Modifikationen. Einrichten 3-5 Replikat MDA Reaktionen und reduzieren Inkubation bei 30 ° C bis 1 Stunde. Pool-Proben nach der Reinigung und Niederschlag mit 95-100% Ethanol gewünschte Konzentration zu erhalten.
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 fasst die SVG Prozess. Diese Methoden verwenden Durchflusszytometrie, um virale Partikel auf PTFE Objektträger mit Agarose einzelne Virionen aus einer gemischten Versammlung von MDA gefolgt, um Mengen von gDNA, die ausreichend sind für die Sequenzierung zu erhalten isolieren sortieren.
Als Proof-of-concept, wurden Bakteriophagen Lambda und T4 gemischt und der SVG 11 Verfahren. Sobald Virionen wurden gefangen genommen und in Agarose eingebettet CLSM was zur Visualisierung und bestätigen, dass ein einzelnes Virion erhalten wurde;. Ergebnisse sind in Abbildung 2 gezeigt Sobald Brunnen mit einzelnen Virionen identifiziert wurden, wurden sie für MDA von gDNA ausgewählt. Wir haben dann verwendet Multiplex-PCR spezifisch für T4 und Lambda die Virion isoliert, Abbildung 3. Identifizieren Eine isolierte Phagen Lambda wurde für Genom-Sequenzierung ausgewählt.
Genom-Sequenzierung wurde unter Verwendung von 454-Titanium-Technologie und Sequenzierung gelesen wurden einer Zuordnung Verweis auf das Niveau der Berichterstattung unter Verwendung SVG identifizieren. Abbildung 4 zeigt, dass fast die gesamte Lambda-Genom gewonnen wurde (mit Ausnahme der ersten 5 bp).
Abbildung 1. SVG-Methodik. Viral Suspensionen, die eine gemischte Montage auf einzelne Viruspartikel über Durchflusszytometrie, die dann s reduziertorted auf einzelne Agarose "Perlen". Das Virus wird im Agarose-Kügelchen durch Überlagerung mit einer zusätzlichen Schicht von Agarose Beitrag durchflusszytometrische Sortierung eingebettet. Schließlich wird Amplifikation des gesamten Genoms in situ durchgeführt.
Abbildung 2. Die konfokale Laser-Scanning-Aufnahme einer sortierten Viruspartikel in einer Agarosekugel eingebettet. A) Dreidimensionale Rekonstruktion eines SYBR Green I gefärbten Viruspartikel innerhalb eines Agarosekugel. Einschub: höherer Vergrößerung des isolierten Viruspartikel B) Profil Diagramm der relativen Fluoreszenz der gefärbten einzigen Viruspartikel innerhalb eines Agarosekugel..
Abbildung 3. Bakteriophagen Identifizierung mittels PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR unter Verwendung von T4 und Lambda-spezifische Primer zu Genotyp Lanes: 1. TrackIt 1 kb zuzüglich Leiter (Invitrogen), 2. Lambda Integrase (750 bp), 3. T4 Hauptcapsid Protein (1.050 bp), 4. . Mix von Lambda Integrase und T4 Hauptcapsid Protein B) Nachfolgende Lambda spezifischen PCR mit zusätzlichen Loci weiter bestätigen Phagengenom Isolation, Lanes: 1. Lambda Integrase (750 bp), 2. Lambda-Repressor (356 bp) 3. Lambda SIE (Superinfektion Ausschluss) (456 bp) 4. TrackIt 1 kb zuzüglich Leiter (Invitrogen).
Abbildung 4. Lambda Genoms Attribute und Berichterstattung. A) GC Grundstück, B) Genome Karte von Lambda (adaptiert aus http://img.jgi.doe.gov ) und C) Mapping von SVG liest der Referenz Bakteriophagen Lambda, ist x-Achse Genom Position, yaxis ist% Deckung.
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Discussion
Eine Vielzahl wichtiger Faktoren müssen berücksichtigt werden, wenn die Anwendung SVG Ansätze. Genotypisierung, so wurde während des Proof-of-Concept-Experiment 13 durchgeführt wird, ist keine gültige Option für die Umwelt oder die unbekannten Isolate als konservierte Primer nicht verfügbar sind, in allen viralen Gruppen. Auch ist Hintergrund DNA-Synthese oder unspezifische Amplifikation häufig während der Amplifikation mit dem MDA-Reaktion 14 gemeldet. Die unspezifische Amplifikation kontaminierender DNA, die aus Reaktion Reagenzien und / oder durch einen Mechanismus, der Amplifikation ermöglicht Zufallshexameren im Reaktionsgemisch zurückgeführt. Beim Arbeiten mit viralen Zusammenstellungen, besteht vielleicht eine höhere Wahrscheinlichkeit von unspezifischen DNAs bevorzugt aufgrund der geringeren Menge an viraler DNA als Template, um einzelne Bakterienzellen als Folge der signifikanten Unterschied in der Partikelgröße (Zelle) Größe und genomischen DNA-Gehalt gegenüber verstärkt ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg für Viren, wieGegensatz zu 0,2-1,5 um; ~ 14 fg für Bakterien). Die folgenden Methoden werden empfohlen, um das Niveau der unspezifischen Verstärkung reduzieren: Behandlung von viralen Assemblagen mit DNase I, Prüfung des Virus enthält Agarosekügelchen mit CLSM, Reduzierung der MDA Inkubationszeit und erhöht Sequenzierung Tiefe (dh in der Lage ist mit der nächsten Generation Sequenzierung Technologien wie 454-Titanium und Illumina).
Bei der Durchführung von SVG auf Umweltproben ist optimiert de novo Assemblierung unerlässlich, um eine vollständige oder nahezu vollständige Genomsequenzen zu erhalten. Wir haben festgestellt, dass die Verringerung der redundanten liest vor der Montage ist notwendig, um eine größere Abdeckung 13 zu erhalten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Ken Nealson für seine Einsicht und Beratung während des Manuskripts Prozess danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
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