Summary
ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.
Abstract
ההגברה הגנום כולו ורצף של תאי חיידקים בודדים מאפשרים אפיון גנטי ללא צורך בטיפוח 1-3. וירוסים, שהם נמצאים בכל מקום והגופים הרבים ביותר על הפלנטה שלנו 4 וחשובים בכל הסביבות 5, עדיין לא גילו דרך גישות דומות. כאן אנו מתארים גישה לבידוד ואפיון הגנום של virions יחיד בשם 'נומיקס וירוס אחד "(SVG). SVG מנצל cytometry זרימה לבודד וירוסים בודדים וכל הגברה הגנום להשיג DNA הגבוה מולקולרי משקל גנומית (gDNA) שניתן להשתמש בו ברצף תגובות שלאחר מכן.
Protocol
1. הכנת תרחיפי ויראלי
לפני הבידוד של virions יחיד באמצעות cytometry הזרימה, להכין השעיות נגיפיות הלא מתוקנות.
- לבודד את החלקיקים נגיפיים באמצעות פרוטוקולים שנקבעו בעבר להכנת תרחיף נגיפי סופי בטוח כלול ב0.1 מיקרומטר מסונן TE (טריס-EDTA, pH 8). אנו ממליצים להשתמש בסינון זרימה משיק (TFF) מתקרב 6 למרות ששיטות אחרות שפותחו השימוש הפתתה הכימית 7.
- למנות חלקיקים נגיפיים באמצעות פרוטוקולים מבוססים, למשל באמצעות 8-10 epifluorescence או cytometry זרימת 11,12.
- Aliquot השעיה נגיפית לשני צינורות Eppendorf (נפח סופי מומלץ להיות 1,000 μl).
2. הזרימה cytometry
- כדי למיין באמצעות וירוסי cytometer זרימת BD FACSAria השני מצוידים בPMT פיזור קדימה מותאם אישית (FSC PMT), לדלל חלקיקים נגיפיים ב0.1 מיקרומטר מסונן TE, pH 8.0 עד כייל מתאים לקצב אירוע של 200 אירועי שנייה -1.
- להגדיר סף על מנת למקסם את מנות אות לרעש, לדוגמה. למכלול מעורב המכיל חלקיקי phage T4 ומבדה הבאים מומלץ: PMT FSC ב 1000 וSSC ב 200.
- לרוץ 100 μl של דגימות "ריקות" המכילות רק 1) 0.1 מיקרומטר TE מסונן ו2) 0.1 מיקרומטר TE מסונן וSybrGreen1 ב1E-4 דילול של מניות (10,000 X).
- הפעל aliquot קטן (100 μl מומלץ) של השעיה נגיפית בלא כתם להעריך רקע, ואחרי ההשעיה נגיפית המוכתמת (SybrGreen1 ב1E-4 דילול של מניות), חלקיקים נגיפיים לסך של 5,000 אירועים כל אחד. זאת על מנת לבדוק את הריכוז ולהתאים את שערי מיון, אם יש צורך, לפני המיון. אנו ממליצים שער חזק במרכזה של חלקיקים נגיפיים. כמו כן, ליצירת שערים אנו משתמשים בגרין SYBR ועלילת PMT FSC.
- הוסף 5 μl של 1% נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose (במאגר TBE) התקרר עד 37 ° C לכל אחדגם בשקופית polytetrafluoroethylene מיקרוסקופ (PTFE) (מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים).
- טען את שקופיות מיקרוסקופ PTFE לcytometer הזרימה כדי ללכוד חלקיקים נגיפיים ימוינו.
- מתחיל סוג של חלקיקים נגיפיים מוכתמים SYBR הירוק ישירות על גבי שקופית PTFE עם LMP agarose. אנו ממליצים מיון 10 או יותר מאירועים (חלקיקים נגיפיים) בכמה בארות כדי לסייע בזיהוי של העומק של וירוסים במהלך סריקת מיקרוסקופ לייזר confocal (CSLM).
- בעת המיון יושלם, להסיר שקופית מcytometer הזרימה ולהוסיף 5 μl יותר LMP agarose מקוררת ל -37 מעלות צלזיוס היטב כל אחד, ובכך הטבעת החלקיק הנגיפי (ים).
3. חזותי virions יחיד באמצעות מיקרוסקופ confocal
אם virion יחיד הוא רצוי, ולאחר מכן לקבוע אם כל אחד גם מכיל וירוס פרט הכרחי וCLSM יש צורך לדמיין virion המוטבע (ים) ב3D כדי לוודא שרק חלקיק יחיד קיים וכי וירוסים מרוביםלא נערם על גב אחד את השני.
- הגדר את לייזר מיקרוסקופ לעירור אורך גל 488 ננומטר.
- תדמית החלקיקים הנגיפיים המשובצים באמצעות מטרת מרחק 63X עבודה ארוכה.
4. ההגברה הגנום כולו
- פעם אחת בארות עם אחת וירוסים מזוהות עם CLSM, לבצע כל הגנום באמצעות הגברה הגברה עקירה מרובה (מד"א) בתוך agarose (באתר).
- כדי להקטין את הסיכוי של החדרת זיהום הדנ"א, להסיר את 'חרוזים' הרצויים agarose מהשקופית והניח בצינור PCR סטרילי. השתמש בפינצטה ו / או סכין גילוח לצעד זה סטריליים.
- Lyse החלקיק הנגיפי באתרו באמצעות חום (94 מעלות צלזיוס) במשך 3 דקות בבלוק של thermocycler החום.
- בצע את המלצות היצרן הבא תגובת מד"א (GenomiPhi ח.י. ערכה, GE Healthcare) בשינויים הבאים
- לצמצם את היקף המדגם וbuf התגובהfers ל11.25 μl ולדגור על 30 ° C למקסימום של 2 שעות כדי להפחית הגברה ספציפיות.
- לטהר את החומר הגנטי המוגבר על ידי העברת הדנ"א הגנומי (gDNA) לצינור 1.7 מיליליטר אפנדורף ולהוסיף 3 נתרן אצטט M (NaOAc) במאגר TBE (אותו חיץ המשמש בהכנת agarose LMP) נפח 1/10.
- מדגם מקום (ים) על 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפזר agarose.
- להעביר צינור (ים) עד 42 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הטמפרטורה לפני הוספת אנזים.
- הוסף 2 יחידות β-agarase לצינור כל דגירה במשך שעה 2.
- הוסף 1 נפח של פנול פתרון חיץ רווי לצינור, ומערבב במרץ ו צנטריפוגות XG ב 3500 במשך 15 דקות. העבר את ה-DNA המכיל supernatant לצינור חדש 1.7 מיליליטר אפנדורף.
- הוסף נפח אחד של 100% isopropanol ו1μl של Glycoblue. מערבבים היטב על ידי צינור היפוך.
- צנטריפוגה ב 28,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. למזוג isopropanol כדי לוודא שלא להפריע גלולה. הוסף 150 μl של 70% ethaנול לצינור אחד. ספין ב28,000 XG וRT במשך 10 דקות. למזוג אתנול, אוויר יבש גלולה דנ"א וresuspend DNA בנפח מתאים של חיץ TE.
- אנו ממליצים לחזור על שלבים 4.4-4.9 בשינויים הבאים. להגדיר 3-5 תגובות מד"א לשכפל ולהפחית דגירה על 30 מעלות צלזיוס לשעה 1. דגימות בריכת לאחר טיהור ומשקע באמצעות 95-100% אתנול להשיג ריכוז רצוי.
5. נציג תוצאות
איור 1 מסכם את תהליך SVG. שיטות אלה משתמשות cytometry הזרימה למיין חלקיקים נגיפיים על שקופיות מיקרוסקופ המכילות PTFE agarose לבודד virions בודד ממכלול מעורב אחרי מד"א להשיג כמויות של gDNA כי הם מספיק עבור סידור.
כהוכחה של קונספט, bacteriophage מבדה ו-T4 היו מעורבת וחשוף לתהליך SVG 11. ברגע שvirions נתפסו ומוטבעים בagarose, CLSM waים משמש לדמיין ולאשר כי virion אחת הושג;. תוצאות מוצגות באיור 2 ברגע שבארות עם virions בודד זוהו, הם נבחרו למד"א של gDNA. לאחר מכן, אנו משמשים זמנית PCR ספציפי למבדה T4 ולזהות virion מבודד, איור 3. הפאג מבדה מבודדת נבחרה לריצוף הגנום.
ריצוף הגנום בוצע באמצעות 454-טיטניום טכנולוגיה וכניסות רצף היו נתונים להפנית מיפוי לזהות את רמת הכיסוי שהושגה באמצעות SVG. איור 4 מראה שכמעט כולו למבדה הגנום התגלה (למעט ב -5 נ"ב הראשונים).
איור 1. המתודולוגיה. השעיות ויראלי SVG המכילים מכלול מעורב מופחתות לחלקיקי נגיף יחידים באמצעות cytometry זרימה שלאחר מכן sorted על "חרוזים" agarose בודדים. הווירוס מוטבע בחרוז agarose ידי כיסה עם שכבה נוספת של מיון זרימת cytometric הודעה agarose. לבסוף, כל ההגברה הגנום מתבצעת באתר.
איור 2. לייזר confocal סריקת מיקרוסקופ של חלקיק נגיפי מסודרים משובצים בחרוזי agarose. שיקום) שלוש ממדי של חלקיקים נגיפיים Sybr ירוק אני מוכתם בתוך חרוז agarose. הבלעה: ההגדלה גבוהה יותר של החלקיקים נגיפיים B המבודד) עלילת פרופיל של הקרינה היחסית של החלקיקים נגיפיים אחת המוכתם בחרוז agarose..
איור 3. זיהוי bacteriophage באמצעות PCR.) </ Strong> Multiplex PCR באמצעות פריימרים T4 ומבדה ספציפיים לגנוטיפ, נתיבים: 1. TrackIt 1 קילו בתוספת סולם (Invitrogen), 2. integrase מבדה (750 נ"ב), 3. חלבון T4 גדול קופסית (1,050 נ"ב), 4. . שילוב של integrase מבדה וחלבון capsid גדול T4 ב ') לאחר PCR הספציפי למבדה עם לוקוסים נוספים כדי לאשר את בידוד הפאג הגנום, נתיבים נוספים: 1. integrase מבדה (750 נ"ב), 2. למבדה repressor (356 נ"ב) 3. למבדה sie (הדרת superinfection) (456 נ"ב) 4. TrackIt 1 קילו בתוספת סולם (Invitrogen).
איור 4. תכונות מבדה הגנום וכיסוי. A) מגרש GC, ב) מפת הגנום של למבדה (עיבוד http://img.jgi.doe.gov), ו-C) מיפוי SVG קורא להתייחסות bacteriophage למבדה, ציר x הוא עמדת הגנום, יאxis הוא% כיסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר גורמים חשובים חייבים להילקח בחשבון בעת יישום גישות SVG. Genotyping, כפי שבוצע במהלך ניסוי הוכחה של הקונספט-13, אינו אופציה תקפה לבידודים ידועים או סביבתיים כמו פריימרים משומרים אינם זמינים בכל הקבוצות ויראליות. כמו כן, סינתזת דנ"א רקע או הגברה ספציפיות ומדווח בדרך כלל במהלך ההגברה שימוש בתגובת מד"א 14. הגברה ספציפיות יוחסה לזיהום ה-DNA המתעוררים מחומרים כימיים תגובה ו / או באמצעות מנגנון המאפשר הגברה מhexamers האקראיות בתוך תערובת התגובה. כאשר עובד עם מכלולים נגיפיים, אולי קיימת סבירות גבוהה יותר של DNAs ספציפי מעדיפים מוגברת בשל הכמות נמוכה יותר של ה-DNA נגיפי התבנית בניגוד לתאי חיידקים בודדים כתוצאה מהבדל המשמעותי בחלקיקים (תא) גודל ותוכן הדנ"א הגנומי ( 25-100 ננומטר; ~ 1.5 FG לוירוסים, כפילעומת 0.2-1.5 אום; ~ 14 מהשדה לחיידקים). השיטות הבאות מומלצות להפחית את הרמה של הגברה ספציפיות: טיפול במכלולים נגיפיים עם DNase אני, בחינה של וירוס המכילה חרוזים agarose באמצעות CLSM, צמצום זמן הדגירה מד"א וגדלו עומק רצף (כלומר כמסוגל עם טכנולוגיות הדור הבא של רצף כמו 454-טיטניום וIllumina).
בעת ביצוע SVG בדגימות סביבתיות, מותאם דה נובו הרכבה היא הכרחית כדי להשיג רצפי הגנום מלאים או כמעט מלא. מצאנו כי הפחתה מיותרת קורא לפני ההרכבה יש צורך לקבל כיסוי גדול יותר 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לקן Nealson לתובנה שלו והייעוץ לאורך כל תהליך הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
