Summary
単一のウイルスゲノム（SVG）は、単一のビリオンのゲノムを分離して増幅する方法である。混合された集合体のウイルス懸濁することにより、ビリオンを捕捉し、下流の処理中にゲノムせん断を低減、アガロースを含む個別のウェルを有する顕微鏡スライド上にフローサイトメトリーを用いてソートされる。全ゲノム増幅は、配列決定のために適しているゲノム材料をもたらす複数の置換増幅（MDA）を用いて達成される。
Abstract
単一の微生物細胞の全ゲノム増幅および配列決定は、栽培1-3を必要とせずにゲノム特性評価を可能にします。ユビキタスと私たちの惑星4上で最も数多くのエンティティとすべての環境5で重要であるウイルスは、同様のアプローチを介して明らかにされていない。ここでは、 'シングルウイルスゲノミクス'（SVG）と呼ばれる単一のビリオンのゲノムを単離し、特徴付けるためのアプローチについて説明します。 SVGは、その後の配列決定反応に用いることができる高分子量のゲノムDNA（gDNAを）を得るために、個々のウイルスおよび全ゲノム増幅を分離するためにフローサイトメトリーを利用する。
Protocol
1。ウイルス懸濁液の調製
フローサイトメトリーを経由して、単一のビリオンの分離前に、固定されていないウイルスの懸濁液を調製。
- 必ず最後のウイルス懸濁液を作る以前に確立されたプロトコルを使用してウイルス粒子を分離する0.1μmのフィルターTE（トリス-EDTA、pHが8）に含まれています。我々は、他の方法が使用化学凝集7が開発されているが（TFF）6に近づくタンジェンシャルフローろ過の使用をお勧めします。
- 落射蛍光8-10またはフローサイトメトリー11,12を使用して確立されたプロトコルを用いて、 例えば 、ウイルス粒子を列挙する。
- 2エッペンドルフチューブ（最終容量は1,000μLであることが推奨されます）にアリコートウイルス懸濁液。
2。フローサイトメトリー
- カスタム前方散乱PMT（FSC PMT）を搭載したBD FACSAria IIフローサイトメーターを使用してウイルスをソートするには、0.1μmのフィルターTE、pHを8にウイルス粒子を希釈する。200イベント秒-1のイベント発生率のための適切な力価を0。
- 信号対雑音配給などを最大化するためにしきい値を設定する。 T4とラムダファージ粒子、次を含む混合群集のために推奨されています：FSC PMTを1,000とSSCで200。
- 唯一の1を含んでいる "空白"サンプル）0.1μmのフィルターTEおよび2）1E-4で0.1μmのフィルターTEとSybrGreen1株式の希釈（10,000 X）を100μlを実行します。
- 汚されたウイルス懸濁液（株式の1E-4希釈でSybrGreen1）、5,000イベントそれぞれの合計にウイルス粒子が続くバックグラウンドを評価するための染色ウイルス懸濁液の小アリコート（100μlをお勧めします）を実行します。これは、ソート前に、必要に応じて、濃度を確認し、選別ゲートを調整することである。私たちは、ウイルス粒子の中心にタイトなゲートをお勧めします。また、ゲートを生成するために私たちは、SYBRグリーンとFSC PMTプロットを使用しています。
- 1％低融点（LMP）の5μlをアガロース（TBEバッファ内の）それぞれに37℃に冷却し、よくポリテトラフルオロエチレン（PTFE）顕微鏡スライド上（電子顕微鏡科学）。
- 並べ替えウイルス粒子を捕捉するためにフローサイトメーターにPTFEの顕微鏡スライドをロードします。
- 直接LMPアガロースとPTFEスライド上にSYBR緑ステンドウイルス粒子のようなものを開始します。我々は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CSLM）中のウイルスの深さの検出を助けるために、いくつかのウェル内の10以上のイベント（ウイルス粒子）の並べ替えをお勧めします。
- ソートが完了すると、フローサイトメーターからスライドを削除し、追加5μlをよりLMPアガロースしたがって、ウイルス粒子（s）を埋め込み、各ウェルに37℃に冷却した。
3。共焦点顕微鏡を使用して単一のビリオンの可視化
単一ビリオンが所望される場合、各ウェルの個々のウイルスが含まれているかどうかを決定することは不可欠であるとCLSMは、単一の粒子が存在し、その複数のウイルスであることを確認するために3Dに埋め込まれたビリオン（s）を可視化することが必要である互いの上に積層されていない。
- 波長488 nmの励起顕微鏡レーザーを設定します。
- 63X長作動距離対物レンズを用いて埋め込まれたウイルス粒子のイメージ。
4。全ゲノム増幅
- 単一のウイルスによるウェルをCLSMで識別された後、アガロース（ 上皮内 ）内で複数の置換増幅（MDA）を使用して、全ゲノム増幅を行う。
- DNA汚染を導入する可能性を減少させるために、スライドから所望のアガロース 'ビーズ'を削除し、滅菌PCRチューブに入れた。滅菌ピンセットおよび/またはこのステップのカミソリの刃のペアを使用してください。
- サーモサイクラーのヒートブロックで3分間熱（94℃）を使用して、その場でウイルス粒子を溶解。
- 以下の変更を加えて、製造業者の推奨に従ってMDA反応（GenomiPhi HYキット、GEヘルスケア）の実行
- サンプルと反応BUFの量を減らす30 11.25μLとインキュベートするFERS°非特異的増幅を低減するために2時間の最大のためのC。
- 1.7ミリリットルエッペンドルフチューブにゲノムDNA（gDNAを）を転送することにより、増幅されたゲノム物質を浄化し、TBE緩衝液中で1/10量の3M酢酸ナトリウム（NaOAcを）（LMPアガロースの調製に使用したのと同じ緩衝液）を追加する。
- 55時場所サンプル（秒）°アガロースを溶解するために10分間。
- 管（群）42に移動°C、酵素を加える前に温度を低下させる。
- 各チューブへのβ-アガラーゼ2台を追加し、2時間インキュベートする。
- チューブにバッファー飽和フェノール溶液1ボリュームを追加し、精力的に混合し、15分間3,500 xgで遠心。新しい1.7ミリリットルエッペンドルフチューブに上清を含むDNAを転送します。
- Glycoblueの100％イソプロパノール及び1μlののつのボリュームを追加します。反転チューブでよく混ぜる。
- 60分間4℃で28,000×gで遠心分離します。デカントイソプロパノールペレットを乱さないように確認すること。 70％ETHA150μlのを追加各チューブにNOL。 10分間28,000 xgで、室温でスピン。エタノールをデカントし、空気はDNAペレットを乾燥し、TEバッファーの適切な量でDNAを再懸濁します。
- 我々は、次の変更を加えて手順4.4から4.9を繰り返してお勧めします。 3-5複製MDA反応を設定し、1時間に30℃でのインキュベーションを減らす。所望の濃度を得るために、95〜100％のエタノールを用いて沈殿物を精製し、続いてサンプルをプール。
5。代表的な結果
図1は、SVGのプロセスをまとめたものです。これらの方法は、配列決定のために十分であるのgDNA量を得るために、MDA、続いて混合された集合体から単一のビリオンを分離するためにアガロースを含有するPTFE顕微鏡スライド上にウイルス粒子をソートするフローサイトメトリーを使用する。
概念実証として、バクテリオファージラムダおよびT4を混合し、SVGプロセス11に供した。ビリオンをアガロース、CLSMワシントン州でキャプチャされ、埋め込まれていた後はsは視覚化し、単一ビリオンが得られたことを確認するために使用される、 単一のビリオンとウェルが同定されたら、その結果を図2に示されているが、それらは、MDAのgDNAのために選択した。私たちは、その後、T4と孤立ビリオン、 図3。識別するラムダ孤立ファージラムダがゲノム解読のために選択されたためのマルチプレックスPCRは、特定の使用。
ゲノム配列決定は、SVGを用いて得られた被覆のレベルを識別するためにマッピングを参照するために行った454-チタン技術および配列読み取りを行った。 図4のほぼ全体ラムダゲノム（第5塩基対を除いて）を回収したこと。
図1。混合群集を含むSVG方法論。ウイルス懸濁液は、その後のあるフローサイトメトリーを経由して、単一のウイルス粒子に還元される個人アガロース "ビーズ"にorted。ウイルスはアガロースポストフローサイトメトリーソーティングの追加レイヤを重ねることによってアガロースビーズ内に埋め込まれます。最後に、全ゲノム増幅をin situで行われる。
図2。共焦点レーザーは、アガロースビーズに埋め込 ま並べウイルス粒子の顕微鏡写真をスキャン。）アガロースビーズ内のSYBR Green I染色ウイルス粒子の3次元再構築を。挿入図：絶縁ウイルス粒子の高倍率アガロースビーズ内ステンドシングルウイルス粒子の相対的な蛍光のB）プロファイルプロット。
図3。 PCRを用いたバクテリオファージの識別。）<1：/ strong>のマルチプレックスPCRは、遺伝子型にレーンをT4とラムダ特異的プライマーを用いた。 TrackIt 1キロバイトプラスラダー（Invitrogen社）、2。ラムダインテグラーゼ（750塩基対）、3。 T4主要キャプシドタンパク質（1,050 BP）、4。 1：ラムダインテグラーゼおよびT4主要キャプシドタンパク質のミックスB）追加の座とその後のラムダ特異的PCRはさらにファージゲノムの分離、レーンを確認する。ラムダインテグラーゼ（750塩基対）、2。ラムダリプレッサー（356塩基対）3。ラムダSIE（重複感染の排除）（456塩基対）4。 TrackIt 1キロバイトプラスラダー（Invitrogen社）。
図4。ラムダゲノム属性と報道。）GCプロット、ラムダのB）ゲノムマップ（から適応http://img.jgi.doe.gov ）、およびC）SVGのマッピング参照バクテリオファージλ、x軸に読み込んでゲノム位置、屋軸ロボットPは％カバレッジです。
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Discussion
SVGの手法を適用する際に重要な多くの要因を考慮しなければならない。ジェノタイピングは、概念実証実験13の間に行われたように、保存されたプライマーはすべてのウイルスのグループ間で利用できないなどの環境や未知の分離のための有効なオプションではありません。また、バックグラウンドDNA合成又は非特異的な増幅は、一般的にMDA反応14を用いて増幅中に報告されている。非特異的な増幅は、反応試薬および/または反応混合物の中からランダムヘキサマー増幅を可能にするメカニズムを介して新たなDNAの汚染に起因している。ウイルス群集で作業する場合、優先的に原因粒子（セル）のサイズおよびゲノムDNA含量の有意差の結果として、単一の細菌細胞とは対照的に、テンプレートウイルスDNAの下限量に増幅した非特異的DNAのより高い可能性が多分あります（ 25から100 nmで、ウィルス〜1.5 FGなど0.2〜1.5 umのとは対照的に、細菌のための〜14 FG）。 DNアーゼI、CLSMを用いたアガロースビーズを含むウイルスの検査、MDAのインキュベーション時間の短縮とともにウイルス群集の治療と（ つまり、などの次世代シーケンシング技術とが可能であるシーケン深さを増加させ、次のメソッドは、非特異的増幅のレベルを下げることをお勧めします454-チタンとイルミナのような）。
環境試料にSVGを行う際に、最適化されたデノボアセンブリは、完全またはほぼ完全なゲノム配列を得ることが不可欠である。我々は、冗長化は、アセンブリに先立って読み出す削減が13より大きいカバレッジを得る必要があることを見出した。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
私たちは、原稿の準備プロセスを通して彼の洞察とアドバイスをケンNealsonに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
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