Summary
Genomics vírus individuais (SVG) é um método para isolar e amplificar os genomas de virons individuais. Suspensões virais de uma assembléia mista são classificados usando citometria de fluxo em uma lâmina de microscópio com poços discretos contendo agarose, capturando assim, o virion e reduzindo corte genoma durante o processamento downstream. Amplificação do genoma inteiro é conseguida usando vários amplificação por deslocamento (MDA), resultando em material genómico que é adequado para a sequenciação.
Abstract
Amplificação e seqüenciamento do genoma inteiro das células microbianas individuais permite a caracterização genômica, sem a necessidade de cultivo 1-3. Os vírus, que são onipresentes e as mais numerosas entidades em nosso planeta 4 e importante em todos os ambientes 5, têm ainda a ser revelado através de abordagens semelhantes. Aqui nós descrevemos um método para isolar e caracterizar os genomas de virions single chamado 'Genomics Vírus único »(SVG). SVG utiliza a citometria de fluxo para isolar os vírus de amplificação individuais e todo o genoma para obter ADN genómico de elevado peso molecular (gDNA), que pode ser utilizado em reacções de sequenciação subsequentes.
Protocol
1. Preparação de suspensões virais
Antes de isolamento do vírus da única via citometria de fluxo, preparar suspensões virais não corrigidos.
- Isolar as partículas virais utilizando protocolos previamente estabelecidos, tornando-se a suspensão virai final, está contida em 0,1 micrometros de filtrado de TE (Tris-EDTA, pH 8). Recomendamos o uso de filtração de fluxo tangencial (TFF) se aproxima 6 embora outros métodos foram desenvolvidos que uso de produtos químicos de floculação 7.
- Enumerar partículas virais utilizando protocolos estabelecidos, por exemplo, usando 8-10 epifluorescência ou citometria de fluxo 11,12.
- Alíquotas de suspensão viral em dois tubos Eppendorf (volume final é recomendado para ser 1000 ul).
2. Citometria de Fluxo
- Para classificar os vírus usando o BD FACSAria II citômetro de fluxo equipado com um PMT Forward Scatter personalizado (FSC PMT), diluir partículas virais em 0,1 mM-filtrada TE, pH 8.0 com um título adequado para uma taxa de eventos de 200 eventos seg -1.
- Definir limites para maximizar rações sinal-ruído, por exemplo. para uma assembléia mista contendo partículas de fago T4 e lambda se recomenda o seguinte: FSC PMT em 1000 e SSC em 200.
- Executar 100 ml de amostras "em branco", contendo apenas 1) TE 0,1 mM-filtrada e 2) TE 0,1 mM-filtrada e SybrGreen1 em 1e-4 diluição de estoque (10.000 X).
- Executar uma pequena aliquota (100 uL é recomendado) de suspensão viral não coradas para avaliar a fundo, seguido por suspensão viral coradas (SybrGreen1 a 1e-4 de diluição de estoque), as partículas virais num total de 5.000 eventos cada. Isto é para verificar e ajustar a concentração de triagem portas, se necessário, antes da classificação. Recomenda-se uma porta estanque no centro de partículas virais. Além disso, para a geração de portas usamos o verde SYBR e FSC PMT trama.
- Adicionar 5 uL de 1% de baixo ponto de fusão (LMP) de agarose (em tamp TBE), arrefecida a 37 ° C para cadabem em um politetrafluoretileno (PTFE) lâmina de microscópio (Electron Microscopy Sciences).
- Carregar a lâmina de microscópio de PTFE no citómetro de fluxo para capturar classificados partículas virais.
- Comece tipo de SYBR Green manchadas de partículas virais diretamente em PTFE de slides com LMP agarose. Recomendamos triagem 10 ou mais acontecimentos (partículas virais) em alguns poços para auxiliar na detecção da profundidade de vírus durante a microscopia confocal laser scanning (CSLM).
- Quando a separação está completa, remover a lâmina do citómetro de fluxo e adicionam-se 5 ul de agarose LMP mais arrefecida até 37 ° C a cada poço, incorporando assim a partícula virai (s).
3. Visualizando Virions única usando microscopia confocal
Se uma única virião é desejado, em seguida, determinar se cada poço contém um vírus indivíduo é imperativo e MCVL é necessário visualizar o virião incorporado (s) em 3D para verificar que apenas uma única partícula está presente e que vários vírusnão são empilhadas em cima umas das outras.
- Definir o microscópio de laser no comprimento de onda de 488 nm de excitação.
- Imagem das partículas virais incorporadas usando um longo objetiva 63X distância de trabalho.
4. Amplificação do genoma inteiro
- Depois de os poços com vírus individuais são identificados com CLSM, realizar amplificação do genoma completo, utilizando amplificação por deslocamento múltipla (MDA) na agarose (in situ).
- Para diminuir o risco de introdução de contaminação de DNA, remover os desejados '' grânulos de agarose a corrediça e colocado num tubo estéril de PCR. Utilizar um par de pinças esterilizadas e / ou lâmina de barbear para esta etapa.
- Lisar as partículas virais in situ, utilizando calor (94 ° C) durante 3 min no bloco de calor de um termociclador.
- Realizar recomendações reação do fabricante seguinte, o MDA (GenomiPhi HY kit, GE Healthcare) com as seguintes modificações
- Reduzir o volume de amostra e de reacção bufrências para 11,25 mL e incubar a 30 ° C por um período máximo de 2 horas para reduzir a amplificação inespecífica.
- Purifica-se o material genómico amplificado por transferência de ADN genómico (gDNA) para um tubo Eppendorf de 1,7 ml e adicione 1/10 do volume de 3 M de acetato de sódio (NaOAc) em tampão TBE (o mesmo tampão usado na preparação de agarose LMP).
- Colocar a amostra (s), a 55 ° C durante 10 minutos para dissolver agarose.
- Mover tubo (s) a 42 ° C para reduzir a temperatura antes da adição da enzima.
- Adicionar duas unidades β-agarase a cada tubo e incubar durante 2 horas.
- Adicionar 1 volume de uma solução de fenol saturado com tampão ao tubo, misturar vigorosamente e centrifugar a 3500 x g durante 15 min. Transferir o sobrenadante contendo o ADN para um novo tubo Eppendorf de 1,7 ml.
- Adicionar um volume de 100% de isopropanol e 1 ul de Glycoblue. Misture bem, invertendo o tubo.
- Centrifugar a 28.000 xg, a 4 ° C durante 60 min. Decantar isopropanol tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Adicionar 150 ul de 70% ethanol a cada tubo. Girar a 28.000 xg e RT durante 10 min. Decantar o etanol, o ar seco do sedimento de DNA e ressuspender o ADN num volume apropriado de tampão TE.
- Recomendamos repetindo os passos 4,4-4,9 com as seguintes modificações. Configurar 3-5 replicados reacções MDA e reduzir a incubação a 30 ° C e 1 hora. Piscina amostras após purificação e precipitado com etanol a 95-100% para se obter a concentração desejada.
5. Os resultados representativos
A Figura 1 resume o processo SVG. Esses métodos usam a citometria de fluxo para classificar partículas virais em PTFE lâminas de microscópio contendo agarose para isolar virions único a partir de um conjunto misto, seguido pelo MDA para obter quantidades de gDNA que são suficientes para o seqüenciamento.
Como uma prova de conceito, bacteriófago lambda e T4 foram misturados e submetidos ao processo de SVG 11. Uma vez que os viriões foram capturadas e embebidas em agarose, MCVL was utilizados para visualizar e confirmar que um único virião foi obtido,. resultados são mostrados na Figura 2 Uma vez que os poços com viriões individuais foram identificados, que foram seleccionados para MDA de gDNA. Em seguida, utilizado a PCR multiplex específico para T4 e lambda para identificar o virião isolado, Figura 3. Um isolado do fago lambda foi seleccionado para sequenciação do genoma.
A sequenciação do genoma foi realizada utilizando a tecnologia 454-titânio e sequenciação leituras foram submetidos a mapeamento de referência para identificar o grau de cobertura obtida usando SVG. Figura 4 mostra que a quase totalidade do genoma de lambda foi recuperado (com a excepção dos primeiros 5 bp).
Figura 1. SVG metodologia. Suspensões virais contendo uma assembléia mista são reduzidos a partículas do vírus individuais através de citometria de fluxo, que são, em seguida, sorted para cada agarose "beads". O vírus está incorporado no agarose talão sobrepondo com uma camada adicional de agarose pós classificação por citometria de fluxo. Por último, a amplificação do genoma inteiro é realizada in situ.
Figura 2. Micrografia de varrimento de laser confocal de uma partícula viral classificados incorporado num grânulo de agarose a.) Reconstrução tridimensional de SYBR Green I-manchado partícula viral dentro de um grânulo de agarose. Detalhe: maior ampliação da partícula viral isolado B) lote de fluorescência relativa do manchado partícula viral único dentro de um talão de agarose Perfil..
Figura 3. Identificação bacteriófago utilizando PCR. D) </ Strong> Multiplex PCR usando primers T4 e específico lambda para genótipo, Lanes: 1. TrackIt 1 kb, mais escada (Invitrogen), 2. lambda integrase (750 pb), 3. Principal proteína da cápside T4 (1050 bp), 4. . Mix de lambda integrase e T4 principal proteína da cápside B) Após lambda específico PCR com loci adicionais para confirmar ainda mais o isolamento do genoma de fagos, Lanes: 1. Lambda integrase (750 pb), 2. Repressor Lambda (356 bp) 3. Lambda sie (exclusão superinfecção) (456 pb) 4. TrackIt 1 kb além de escada (Invitrogen).
Figura 4. Lambda genoma atributos e cobertura a.) GC enredo, B) Genome mapa de lambda (adaptado de http://img.jgi.doe.gov ) e C) Mapeamento de SVG lê a referência bacteriófago lambda, x-eixo é posição do genoma, yaxis é a cobertura%.
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Discussion
Uma série de fatores importantes devem ser levados em consideração na aplicação de abordagens SVG. Genotipagem, que foi realizada durante o experimento prova-de-conceito 13, não é uma opção válida para os isolados ambientais ou desconhecidos como iniciadores conservados não estão disponíveis em todos os grupos virais. Além disso, a síntese de ADN de fundo, ou a amplificação não específica é comumente avaliado durante a amplificação usando a reacção do MDA 14. Amplificação não específica tem sido atribuída a DNA contaminador emergindo os reagentes da reacção e / ou através de um mecanismo que permite a amplificação dos hexâmeros aleatórios dentro da mistura de reacção. Quando se trabalha com conjuntos virais, talvez haja uma maior probabilidade de ADN não específicos preferencialmente amplificado devido à menor quantidade de DNA viral modelo, em oposição às células bacterianas individuais, como resultado da diferença significativa em partículas (células) de tamanho e conteúdo de ADN genómico ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg de vírus, comooposição ao 0,2-1,5 hum; ~ 14 fg de bactérias). Os seguintes métodos são recomendados para reduzir o nível de amplificação não específica: tratamento de conjuntos virais com DNase I, o exame dos vírus contendo pérolas de agarose usando CLSM, a redução do tempo de incubação e de MDA aumentou sequenciação de profundidade (isto é, como é capaz de tecnologias de sequenciação de nova geração como 454-Titanium e Illumina).
Ao realizar SVG em amostras ambientais, de novo conjunto otimizado é fundamental para obter seqüências genômicas completas ou quase completa. Verificou-se que a redução do redundante lê antes da montagem é necessária para obter uma maior cobertura 13.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Ken Nealson por sua visão e aconselhamento ao longo do processo de preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
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