Summary
Enda virus Genomics (SVG) är en metod för att isolera och förstärka genom av enskilda virioner. Virala suspensioner av en blandad assemblage sorteras med användning av flödescytometri på ett objektglas med diskreta brunnar innehållande agaros och därigenom ta virionen och minska genomet skjuvning under nedströms bearbetning. Hela genamplifieringsteknik uppnås med användning av multipla förskjutning amplifiering (MDA) som resulterar i genomiskt material som är lämpligt för sekvensering.
Abstract
Hela genamplifieringsteknik och sekvensering av enskilda mikrobiella celler möjliggör genomisk karakterisering utan behov av odling 1-3. Virus, som är allmänt förekommande och de mest talrika enheterna på vår planet 4 och viktigt i alla miljöer 5, har ännu inte avslöjat via liknande tillvägagångssätt. Här beskriver vi en metod för att isolera och karakterisera genom av enskilda virioner kallade enda virus Genomics "(SVG). SVG utnyttjar flödescytometri för att isolera enskilda virus och hela genamplifieringsteknik att erhålla hög molekylvikt DNA vikt genomisk (gDNA) som kan användas i efterföljande sekvenseringsreaktioner.
Protocol
Ett. Framställning av Viral Avstängningar
Före isolering av enstaka virioner via flödescytometri, förbereda ofixerade virala suspensioner.
- Isolera viruspartiklar med hjälp av tidigare fastställda protokoll och ser till final viral Suspensionen är fylld i 0,1 um-filtrerad TE (Tris-EDTA, pH 8). Vi rekommenderar att du använder tangentiaMödesfiltrering (TFF) närmar sig 6 även om andra metoder har utvecklats som använder kemisk flockning 7.
- Räkna viruspartiklar med hjälp av fastställda protokoll, t.ex. med epifluorescence 8-10 eller flödescytometri 11,12.
- Alikvot viral suspension i två Eppendorf-rör (slutlig volym rekommenderas vara 1.000 pl).
2. Flödescytometri
- För att sortera efter virus med hjälp av BD FACSAria II flödescytometer utrustad med en anpassad Forward Scatter PMT (FSC PMT), späd viruspartiklar i 0,1 um-filtrerad TE, pH 8.0 till en lämplig titer för en händelse på 200 händelser sek -1.
- Ange tröskelvärden för att maximera signal-till-brus ransoner, t.ex.. för en blandad samling innehåller T4 och lambdafagpartiklar följande rekommenderas: FSC PMT vid 1000 och SSC vid 200.
- Springa 100 ^ "tomma" prover innehållande endast 1) 0,1 um-filtrerad TE och 2) 0,1 um-filtrerad TE och SybrGreen1 at 1e-4 utspädning av lager (10000 X).
- Kör en liten portion (100 pl rekommenderas) av ofärgad virussuspensionen att bedöma bakgrunden, följt av färgade virussuspensionen (SybrGreen1 at 1e-4 utspädning av lager), viruspartiklar till totalt 5.000 evenemang varje. Detta för att kontrollera koncentrationen och justera sortering grindar, om nödvändigt, före sorteringen. Vi rekommenderar en tät grind i centrum av viruspartiklar. Dessutom, för att generera portar vi använder SYBR Green och FSC PMT tomt.
- Tillsätt 5 | il av 1% låg smältpunkt (LMP) agaros (i TBE-buffert) kyld till 37 ° C till varjeväl på en polytetrafluoreten (PTFE) objektglas (Electron Microscopy Sciences).
- Ladda PTFE objektglas i flödescytometern att fånga sorterade viruspartiklar.
- Börja slags SYBR Green färgade viruspartiklar direkt på PTFE slide med LMP agaros. Vi rekommenderar sortering 10 eller flera händelser (viruspartiklar) i vissa brunnar för att hjälpa till att upptäcka djupet av virus under konfokala laserskanning mikroskopi (CSLM).
- När sorteringen är klar, ta bort bilden från flödescytometern och tillsätt 5 ìl mer LMP agaros kyls till 37 ° C till varje brunn, vilket bädda den virala partikeln (s).
Tre. Visualisera enda Virioner använder konfokalmikroskopi
Om en enda virion önskas, sedan bestämma om varje brunn innehåller en individuell virus är absolut nödvändigt och CLSM är nödvändig för att visualisera den inbäddade virionen (er) i 3D för att kontrollera att endast en enda partikel är närvarande och att flera virusinte staplas ovanpå varandra.
- Ställ in mikroskop laser med våglängden 488 nm excitation.
- Image Det inbäddade viruspartiklar med en 63X lång arbetsdag avstånd objektiv.
4. Hel Genome Amplifiering
- När brunnar med enstaka virus identifieras med CLSM, utför hela genamplifieringsteknik med multipel förskjutning förstärkning (MDA) i agaros (in situ).
- För att minska sannolikheten för att införa DNA kontaminering, ta bort de önskade agaros "pärlor" från bilden och placeras i ett sterilt PCR-rör. Använd ett par av sterila pincetter och / eller rakblad för detta steg.
- Lyse den virala partikeln in situ med användning av värme (94 ° C) under 3 min i värmeblock av en termocykler.
- Utför MDA reaktion efter tillverkarens rekommendationer (GenomiPhi HY kit, GE Healthcare) med följande ändringar
- Sänk volymen på provet och reaktion buftransfereringar till 11,25 il och inkubera vid 30 ° C i högst 2 timmar för att minska ospecifik amplifiering.
- Rena det amplifierade genomiska materialet genom att överföra genomiskt DNA (gDNA) till ett 1,7 ml Eppendorf-rör och tillsätt 1/10 volym 3 M natriumacetat (NaOAc) i TBE-buffert (samma buffert som användes i LMP agaros utarbetande).
- Placera provet (proven) vid 55 ° C under 10 min för att lösa upp agaros.
- Flytta rör (s) till 42 ° C för att reducera temperatur före tillsats av enzym.
- Lägg två enheter β-agaras till varje rör och inkubera i 2 timmar.
- Tillsätt 1 volym av en buffert-mättad fenollösning till röret, blanda kraftigt och centrifugera vid 3500 xg under 15 min. Överför supernatanten innehållande DNA till ett nytt 1,7 ml Eppendorf-rör.
- Tillsätt en volym av 100% isopropanol och 1 pl Glycoblue. Blanda väl genom att vända röret.
- Centrifugera vid 28.000 xg vid 4 ° C i 60 min. Dekantera isopropanol se till att inte störa pelleten. Tillsätt 150 pl av 70% etainle till varje rör. Snurra på 28.000 xg och RT i 10 min. Häll av etanol, lufttorka DNA pelleten och återsuspendera DNA i en lämplig volym av TE-buffert.
- Vi rekommenderar att upprepa steg 4,4-4,9 med följande modifieringar. Ställ in 3-5 replikat MDA reaktioner och minska inkubation vid 30 ° C till en timme. Pool prover efter rening och utfällning med hjälp av 95 till 100% etanol för att erhålla önskad koncentration.
Fem. Representativa resultat
Figur 1 sammanfattar SVG processen. Dessa metoder använder flödescytometri för att sortera virala partiklar på PTFE objektglas innehållande agaros för att isolera enstaka virioner från ett blandat assemblage följt av MDA att erhålla kvantiteter av gDNA som är tillräckliga för sekvensering.
Som ett proof-of-concept, var bakteriofag lambda och T4 blandas och utsätts för SVG-processen 11. När virioner fångades och inbäddade i agaros, CLSM was används för att visualisera och bekräftar att en enda virion erhölls,. resultat visas i figur 2 När brunnar med enstaka virioner identifierades, de var utvalda för MDA av gDNA. Vi använde sedan multiplex-PCR specifik för T4 och lambda att identifiera virionen isoleras, figur 3. En isolerad fag lambda vald var för genomet sekvensering.
Genome sekvensering utfördes med hjälp av 454-Titanium-teknik och sekvensering läsningar utsattes för referens kartläggning för att identifiera graden av täckning erhålls med SVG. Figur 4 visar att nästan hela lambdagenom utvanns (med undantag för de första 5 bp).
Figur 1. SVG metodik. Viral suspensioner innehållande en blandad samling reduceras till enstaka viruspartiklar via flödescytometri som sedan sorted på individuella agaros "pärlor". Viruset är inbäddat i agaroskula genom att lägga över med ett ytterligare skikt av agaros efter flödescytometrisk sortering. Slutligen är hela genamplifieringsteknik utförs in situ.
Figur 2. Konfokala laserskanning mikroskop av en sorterad viral partikel inbäddad i en agaroskula. A) Tredimensionell rekonstruktion av en Sybr Green I-färgade viral partikel inom en agaroskula. Infällt: högre förstoring av den isolerade virala partikeln B) Profil plot av relativ fluorescens av färgade enda virus partikel inom en agaroskula..
Figur 3. Bacteriophage identifiering med hjälp av PCR. A) </ Strong> Multiplex PCR med T4 och lambda-specifika primers till genotyp, Lanes: 1. TrackIT 1 kb plus stege (Invitrogen), 2. lambda integras (750 bp), 3. T4 huvudsakliga kapsidproteinet (1050 bp), 4. . Mix av lambda integras och T4 huvudsakliga kapsidproteinet B) Efterföljande lambda specifik PCR med ytterligare lokus för att ytterligare bekräfta faggenomet isolering, Lanes: 1. Lambda integras (750 bp), 2. Lambda repressor (356 bp) 3. Lambda sie (superinfektion uteslutning) (456 bp) 4. TrackIT 1 kb plus ladder (Invitrogen).
Figur 4. Lambdagenom attribut och täckning. A) GC tomt, B) genomkartan för lambda (anpassad från http://img.jgi.doe.gov ), och C) Kartläggning av SVG läser mot referensplanet bakteriofag lambda, är x-axeln genomet läge, yaX är är% täckning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett antal viktiga faktorer måste beaktas vid tillämpar SVG tillvägagångssätt. Genotypning, eftersom utfördes under den proof-av-konceptet experiment 13, är inte ett giltigt alternativ för miljö-eller okända isolat som konserverade primers finns inte tillgänglig tvärs alla virala grupper. Också, är bakgrund DNA-syntes eller ospecifik amplifiering vanligast rapporterade under amplifiering med användning av MDA reaktionen 14. Ospecifik amplifiering har tillskrivats att kontaminerande DNA emerging från reaktionsreagens och / eller genom en mekanism som möjliggör amplifiering från de slumpmässiga hexamerer inom reaktionsblandningen. När du arbetar med virala assemblages finns det kanske en högre sannolikhet för icke-specifika DNA: n preferentiellt förstärkt på grund av den lägre kvantitet av templat virus-DNA i motsats till enstaka bakterieceller som ett resultat av den signifikant skillnad i partikel (cell) storlek och genomiskt DNA-innehåll ( 25-100 nm; ~ 1,5 fg efter virus, eftersommotsatt till 0,2-1,5 um; ~ 14 fg för bakterier). Följande metoder rekommenderas för att minska nivån av ickespecifik amplifiering: behandling av virala assemblage med DNase I, examination av virus innehållande agaroskulor som använder CLSM, reduktion av MDA inkubationstid tid och ökad sekvensering djup (dvs. såsom är kapabel med nästa-generations teknologier för sekvensering av gillar 454-Titanium-och Illumina).
När du utför SVG på miljömässiga prover, är optimerat de novo montering absolut nödvändigt att få fullständiga eller i närheten-komplett genomet sekvenser. Vi har funnit att en minskning det redundanta läser före montering är nödvändig för att erhålla större täckning 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga konflikter av intresse deklareras.
Acknowledgments
Vi skulle vilja att tacka Ken Nealson för hans insikt och rådgivning under hela manuskriptet förberedelse-processen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
