Summary
Здесь мы представляем недорогой, прочный cryotolerant устройство для извлечения образца из танков Дьюара с жидким азотом. Простота конструкции и модульной конструкции устройство делает процесс извлечения образцов из криогенных баков простым и безопасным.
Abstract
Жидкий азот имеет цвета, запаха, очень холодной (-196 ° C) жидкость находится под давлением. Он широко используется в качестве криогенной жидкости для длительного хранения биологических материалов, таких как кровь, клетки и ткани 1,2. Криогенной природы жидкого азота, в то время как идеальный образец для сохранения, может привести к быстрому замораживанию живых тканей на контакт - известный как "криогенный ожог '2, что может привести к серьезным обморожения у людей тесно связаны с хранения и извлечения образцов из сосудов Дьюара. Кроме того, как жидкий азот испаряется она снижает концентрацию кислорода в воздухе и может привести к асфиксии, особенно в ограниченном пространстве 2.
В лабораториях, биологических образцов, часто хранятся в криопробирки или cryoboxes сложены из нержавеющей стали стойки в танках Дьюара 1. Эти стеллажи снабжены длинным валом коробки, чтобы предотвратить соскальзывание из стоек и в нижней частиДьюара при обычной работе. Слишком часто, однако, коробки или флаконы с драгоценными образцами выскользнуть и опускаются на дно жидкого азота заполнить бак. В таких случаях образцы могут быть получены после утомительного передачи жидкого азота в запасной контейнер или отбросить его. Коробки и флаконы могут быть относительно благополучно оправилась от опустели Дьюара. Тем не менее, криогенной природы жидкого азота и его расширение ставка составляет затонувших опасных извлечения образца. Это обычно рекомендованных безопасности офисов, что образец поиска никогда не будет осуществляться одним человеком. Другой альтернативой является использование коммерчески доступных прохладно видеозахвата или щипцы, чтобы вытащить флаконах 3. Тем не менее, ограниченная видимость в темной жидкости заполнены Дьюара представляет собой главное ограничение в их использовании.
В этой статье мы рассмотрим строительство DIY Cryotolerant поиск устройств, что делает поиск образца из Дюара с криогенных жидкостей и безопасноя просто.
Protocol
1. Собрание Cryotolerant Устройство для извлечения из Cryoboxes
- Используя плоскогубцы, разобраться в одну сторону 3 односторонней сильной связи (рис. 1а), чтобы сделать Г-образный сильной связи показано на Рисунке 1B. Примечание: размеры сильной связи может быть выбран в зависимости от диаметра шейки Дьюара .
- Закрепите два таких сильных связей с сильной связи T ремень (рис. 2), используя болт гайку короны, шайбы и винты, чтобы сформировать базу Cryoscoop, как показано на рисунке 3 (AB). Примечание: Два сильных связей используются, чтобы поиск 5 ½ дюйма x 5 ½ дюйма cryoboxes.
- С помощью щелевой пластиной (рис. 4), совместите отверстия на сильной связи T ремень с отверстиями на одном конце прорези и закрепите их друг с другом с помощью Хиллман гайки и болты (рис. 5). Примечание: щелевые плиты и тесная связь в не взаимодействуетмне предварительно просверленные отверстия, Вы будете иметь отверстия, просверленные использованием карбида сверло.
- Согните другой конец прорези пластины с помощью плоскогубцев, как показано на рисунке 6. (Этот шаг является необязательным).
- Оберните ручку с пеной, чтобы лучше понять устройство, когда в жидком азоте, как показано на рисунке 6. (Опционально) Примечание: удаление пены до автоклавирования.
2. Собрание Cryotolerant Устройство для извлечения из криопробирки
Cryotolerant поиска DIY устройство также может быть адаптирована для поиска криопробирки. Это включает в себя заменой плоским дном из нержавеющей стали фильтр, как показано изменен для черпая из флакона с жидким азотом (рис. 7).
- Отвинтить заводную головку гайки и болты крепления сильной связи T ремень прорези пластины.
- Перед установкой фильтра из нержавеющей стали с прорезями пластины, аккуратно согнуть шеюфильтр с помощью плоскогубцев, чтобы сориентировать базу под углом к напоминают ковш (рис. 8) Примечание: Если фильтр поставляется с губ используйте плоскогубцы, чтобы согнуть губу вниз, это будет сделать маневрирование с устройством проще..
- Совместите отверстия на ручке сито вместе с отверстиями в прорези и закрепите фильтр с помощью Хиллман гайки и болты, как показано на рисунке 8. Примечание: если фильтр не поставляются с предварительно просверленные отверстия, вам нужно организовать иметь отверстия, просверленные с сверло карбида.
3. Получение Cryoboxes и криопробирки С Дьюара
- Для начала, надел перчатки и криогенных удалить 1 или 2 морозильник стойки из Дьюара, чтобы поле для маневра.
- Аккуратно очистите по дну сосуда Дьюара с вертикально Cryotolerant поиска DIY устройство оснащено сильной связи T ремень базы (рис. 5) и собирать окна фаллеп на дно сосуда Дьюара танк. Примечание: жидкий азот кипит непосредственно при контакте с теплым объект, обволакивающий объект в изолирующих азота (Лейденфроста эффект). Для охлаждения устройства до извлечения из образцов, медленно погружать устройство в Дьюара и жидким азотом, позволяет охлаждать устройство достаточно, прежде чем приступить выше шаг.
- Выньте устройство вертикально вдоль стен сосуда Дьюара, чтобы выкопать морозильник окно из танка.
- Возьмите ящик извлекается из нижнего сосуда Дьюара.
- Для получения криопробирки, мягко очистить дно сосуда Дьюара с cryoscoop оснащен фильтром (рис. 9).
- Как cryobox поиска, потяните устройство в вертикальном положении и захват пузырьков, собранные в фильтр.
4. Представитель Результаты
Одна из основных проблем в изучении экспрессии генов является то, что качество РНК зависит от условий хранениядля замороженных образцов тканей и экстрагируют РНК 4. На рисунке 10 показано влияние обработки проб на целостность общей РНК. Тотальная РНК из того же источника ткани (жировая человека) был подвергнут обработке различных образцов. До эксперимента, нетронутой общую РНК preparate показывает ясно 28S и 18S рРНК группы с группой 28S рРНК примерно в два раза интенсивнее, чем группа 18S рРНК (рис. 10, дорожка 1). Это соотношение 2:1 (28S: 18S) является свидетельством того, что РНК не повреждена, а частично деградированных РНК выглядит как мазок, или 28S: 18S соотношение интенсивностей отходит от 2:01 5. Дорожки 3-4 изображает РНК образцы со значительной деградации. Эти РНК образцы подвергались неоднократным частичное размораживание по краткосрочным извлечений из Дьюара (метод), что моделирование длительного хранения с периодическими декантации в связи с необходимостью поиска падших флаконы и коробки (рис. 10, переулок 3-4 ). Тем не менее, образцы хранятся в Дьюара обслуживаемыеиспользование устройства DIY (метод B) и, таким образом, не частичное размораживание, содержат РНК нетронутым (рис. 10, переулок 2).
Рисунок 1. А) База состоит из двух 3 односторонней сильной галстук показали измерения. Каждый сильной связи содержит один большой предварительно просверленные отверстия (сплошная стрелка) и несколько небольших отверстий (стрелка) на каждом лице. Это дает возможность разрешить с гайкой крепления и болты. Кроме того, меньшие отверстия позволяют быстрый дренаж жидкого азота в течение образец поиска. B) На одной стороне каждой из сильных связующих выпрямляется с помощью плоскогубцев, чтобы сделать Г-образный сильной связи.
Рисунок 2. Сильные галстук T ремень используется для обеспечения сильной связи друг с другом. Как и сильной связи, T-ремень имеет один большой предварительно просверленные отверстия (сплошная стрелка) и два небольших отверстия (маленькийл стрелка) на каждом углу. Это позволяет обеспечить сильной связи вдоль T - ремень использованием орехов и болтов. Она также позволяет крепление Т-ремень к прорези пластины.
Рисунок 3. А) Каждый сильный галстук крепится к углу T-ремень, по всей его длине использованием корону болты гайки, болты и шайбы. Б) Два сильных связей закреплены рядом друг с другом, чтобы получить 5 ½ дюйма x 5 ½ cryoboxes дюйма. Для небольших cryoboxes, такие как 2 дюйма x 2 дюйма, один сильной связи можно крепить непосредственно к прорези пластины без T-ремень.
Рисунок 4. Щелевые плоские пластины используются в качестве ручки. Длина прорези пластины зависит от глубины сосуда Дьюара. В этом случае, 4 ноги прорези пластины используются. Толщина прорези пластины с критическимосле тонкие прорези пластин (<14 датчиков) делают устройство надуманные при получении образцов заполненный жидким азотом сосуд Дьюара.
Рисунок 5. Плоское основание, состоящее из сильных связей и T ремень затем фиксируется на одном конце прорези пластины. Чем больше отверстий на оставшиеся углу T ремень выравнивается с помощью слота на пластине и прикреплен использованием болт и гайку. Это устройство может быть в настоящее время используется для получения cryoboxes из Дьюара.
Рисунок 6. Один конец прорези плоская пластина согнута использовании плоскогубцев и покрыты пеной для обеспечения лучшего сцепления, особенно на глубоких сосудов Дьюара, как показано в этом случае.
Рисунок 7. Фильтр с сеткой и ручкой из нержавеющей сталииспользуется для получения криопробирки из Дьюара. Если ручка не снабжен слотом, бурение с немного карбида будут необходимы для сверления отверстия.
Рисунок 8. Для облегчения поиска криопробирки, фильтр согнут вдоль шеи использовании плоскогубцев, чтобы получить форму ковша фильтр. Если фильтр поставляется с губ, как в этом случае, клещи могут быть использованы, чтобы согнуть ее. Это гарантирует, фильтр не попасть в сосуд Дьюара.
Рисунок 9. Фильтр крепится к щелевой плоской пластины с одной стороны использование шестигранная гайка и болт.
Рисунок 10. Пример целостности общей РНК подвергаются различным условиям обработки образца. Чтобы исследовать, как РНК качество зависит от обработки образца сonditions, набор образцов РНК из того же источника был подвергнут два способа расправы. Метод состоял хранения РНК в Дьюара подвергается образец извлечений использования DIY устройство, таким образом, не частичное размораживание. Метод B состоял из хранения РНК в Дьюара подвергались неоднократным частичное размораживание по краткосрочным извлечений из Дьюара, таким образом, моделирование длительного хранения с периодическими декантации для получения упал образцов. Всего целостности РНК затем анализируются с помощью гель-электрофореза. Lane1: Пример перед хранением в сосуд Дьюара, переулок 2: Пример из Дьюара подвергаются поиска по методу, 3 переулок, 4: Пример из Дьюара подвергаются поиска по методу B, M: 100 б.п. лестнице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Один из самых распространенных методов получения cryoboxes и криопробирки из нижней части емкости Дьюара является сцеживать жидкого азота в запасной контейнер и вытащите образцы, остающиеся в колбе или плавающие в сливают жидкий азот. Это, однако, опасное действие, которое может вызвать криогенные ожоги или асфиксия вследствие длительного воздействия паров жидкого азота 2. Другой распространенный способ поиска криопробирки падших включает в себя использование cryovial щипцы 3. Тем не менее, ограниченная видимость в темное пространство резервуара с жидким азотом ограничивает их маневренность.
Cryotolerant поиска DIY описанное выше устройство обеспечивает дешевле, безопаснее и проще альтернативы для получения упал cryoboxes и криопробирки со дна глубокого колбы с ограниченной видимостью. Простота работы с устройством DIY поиска обходит необходимость очистки колбы до поиска. Кроме того, в отставкеrieval из cryovial с помощью этого устройства может быть выполнен одним человеком. Кроме того, использование устройства поиска DIY существенно сокращает количество времени, другие образцы хранятся в тех же единицах проводят под температурах окружающей среды, тем самым улучшая условия хранения образцов 6,7.
Многие часто используемые материалы, такие как пластик, сталь и резина становятся ломкими в жидком азоте, а часто и разрушению под напряжением 8,9,10. Детали из нержавеющей стали или оцинкованной стали, используемые в устройстве DIY устойчивы к повреждению от суб-морозы криогенных жидкостей. Кроме того, эти компоненты легко доступны в местных магазинах оборудования и низкой стоимости при строительстве DIY устройства составляет менее $ 50.00. Длинная ручка помогает предотвратить оператора от прямого контакта с криогенной жидкости и перфорированные база и фильтр позволяет мгновенно слива жидкого азота в образце восстановления. Быстрый тetrieval позволяет минимальным воздействием жидкого азота паров делает образец поиска более безопасных процессов. Благодаря своей модульной конструкции, устройство DIY поиска обладает достаточной гибкостью, чтобы быть использованы как для коробки или флаконы. Кроме того, простота конструкции позволяет устройству быть адаптированы для сосудов Дьюара различной формы и размеров и, возможно, работать с другими типами криогенных жидкостей. Использование этого устройства, однако, может быть ограничено в случае криогенные резервуары, которые не имеют плоское дно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
DIY криогенного извлечения устройства были протестированы в ходе проекта "Моделирование бактериальных prenylation белка в эукариотических клеток с помощью биоинформатики и молекулярные подходы", организованная Мария Луиза Эндрюс премии по исследованию рака программы, Вирджиния академии наук, "Физиологический смысл редактирование РНК в плазме дендритных клеток ", организованная Томас Ф. Джеффресс и Кейт Миллер Джеффресс мемориального треста и государственного контракта 16.740.11.0364 (Министерство науки и образования, Россия). Мы хотели бы поблагодарить Бет Нот за помощь в эксперименте целостности РНК.
References
- Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. , Springer. 41 (1996).
- Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , Plenum Press. New York. (1996).
- Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , National Academies Press. (2011).
- Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
- Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).
- Crawford, R. J. Plastics Engineering. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
- Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. , University of New South Wales Press. (1996).
- Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. , (2003).
