Summary
هنا نقدم منخفضة التكلفة، ومتحمل البرد جهاز دائم لاسترجاع عينة من خزانات مليئة ديوار النيتروجين السائل. سهولة البناء وتصميم وحدات الجهاز يجعل من عملية استرجاع عينة من الدبابات المبردة آمنة وسهلة.
Abstract
النيتروجين السائل هو عديم اللون، عديم الرائحة، بارد جدا (-196 درجة مئوية) السائلة أبقى تحت الضغط. ويشيع استخدام هذا كسائل المبردة لتخزين على المدى الطويل من مواد بيولوجية مثل خلايا الدم والأنسجة 1،2. طبيعة المبردة من النيتروجين السائل، في حين المثالي لحفظ عينة، يمكن أن يسبب التجميد السريع للأنسجة الحية في الاتصال - المعروفة باسم 'حرق المبردة "2، والذي قد يؤدي إلى قضمة الصقيع الشديد في الأشخاص الذين يشاركون عن كثب في تخزين واسترجاع عينات من Dewars. وبالإضافة إلى ذلك، والنيتروجين السائل يتبخر أنه يقلل من تركيز الأوكسجين في الهواء، وربما يسبب الاختناق، وخاصة في الأماكن الضيقة 2.
في المختبرات، وغالبا ما يتم تخزين العينات البيولوجية في cryovials أو cryoboxes مكدسة في الرفوف الفولاذ المقاوم للصدأ داخل الدبابات ديوار 1. وتقدم هذه رفوف التخزين مع رمح طويل لمنع مربعات من الانزلاق الخروج من الرفوف والى الجزء السفلي منDewars خلال التعامل مع الروتين. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، وعلب أو قوارير مع العينات الثمينة تفلت وتنزل الى القاع من خزان النتروجين السائل شغلها. في مثل هذه الحالات، يمكن أن عينات استرجاع مضجر بعد نقل النيتروجين السائل في وعاء الغيار أو رميه. يمكن للصناديق وقارورة ثم تكون بأمان نسبيا تعافى من ديوار تفرغ. ومع ذلك، فإن طبيعة المبردة من النيتروجين السائل ومعدل توسع يجعل الغارقة الخطرة استرجاع العينة. ويوصى عادة من قبل مكاتب السلامة أن يتم أبدا تنفيذ استرجاع عينة من قبل شخص واحد. وثمة بديل آخر يتمثل في استخدام الأيادي بارد المتاحة تجاريا أو ملقط لسحب قوارير 3. ومع ذلك، الرؤية محدودة داخل Dewars سائل مظلم شغل يشكل عائقا كبيرا في استخدامها.
في هذه المقالة، ونحن تصف بناء جهاز متحمل البرد استرجاع DIY، الأمر الذي يجعل استرجاع عينة من السوائل المبردة ديوار التي تحتوي على كل من آمن 1الثانية وسهل.
Protocol
1. تجميع الأجهزة متحمل البرد لاسترجاع Cryoboxes
- باستخدام كماشة، تصويب جانب واحد من 3 جانب قوي التعادل (الشكل 1A) لتقديم مذكرة L قوي التعادل على شكل مبين في الشكل 1B: يمكن تحديد أبعاد تحالف قوي اعتمادا على قطر العنق من ديوار .
- 2 تأمين مثل هذه العلاقات القوية مع حزام تي قوي التعادل (الشكل 2) باستخدام التاج الترباس الجوز، غسالة والمسمار لتشكيل قاعدة Cryoscoop كما هو مبين في الشكل (3) (أ ب) ملاحظة: تستخدم اثنين من العلاقات القوية للسماح للاسترجاع 5 ½ بوصة × 5 بوصة ونصف cryoboxes.
- باستخدام لوحة فترة زمنية محددة (الشكل 4)، محاذاة فتحات على حزام قوي التعادل مع تي فتحات في واحدة من نهاية فترة زمنية محددة، وتأمين لوحة اثنين معا مع مساعدة من الجوز هيلمان وبراغي (الشكل 5) ملاحظة: إذا كان لوحة فترة زمنية محددة وقوية في مباراة لا يشاركلي مع الثقوب ما قبل حفر، وسوف يكون لديك ثقوب باستخدام مثقاب كربيد.
- ثني الطرف الآخر من لوحة فترة زمنية محددة وذلك بمساعدة من كماشة كما هو مبين في الشكل (6). (هذه الخطوة اختيارية).
- لف مقبض مع رغوة إلى فهم أفضل للجهاز عندما تكون في النيتروجين السائل كما هو مبين في الشكل (6). (اختياري) ملاحظة: إزالة الرغوة قبل جهاز الأوتوكليف.
2. تجميع الأجهزة متحمل البرد لاسترجاع Cryovials
ويمكن أيضا استرداد DIY متحمل البرد جهاز تكييفها لاسترجاع cryovials. وهذا ينطوي على استبدال قاعدة مسطحة مع مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ كما هو موضح غيرت لشفط خارج قارورة من النيتروجين السائل (الشكل 7).
- فك التاج الصواميل والمسامير ربط حزام تي قوي التعادل على لوحة فترة زمنية محددة.
- قبل ربط مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة فترة زمنية محددة، تثبت بلطف عنقومصفاة بمساعدة كماشة الى قاعدة في زاوية توجيه لتشبه مغرفة (الشكل 8) ملاحظة: إذا كانت مصفاة يأتي مع شفة، استخدم كماشة لثني الشفاه لأسفل، وهذا سيجعل من السهل المناورة مع الجهاز.
- محاذاة حفرة على مقبض مصفاة جنبا إلى جنب مع الفتحات الموجودة على لوحة فترة زمنية محددة وتأمين مصفاة بمساعدة من المكسرات هيلمان والمسامير كما هو موضح في الشكل 8 ملاحظة: إذا كان لا يأتي في مصفاة ذات ثقوب قبل حفر، وسوف تحتاج إلى الترتيبات اللازمة لحفر ثقوب مع مثقاب كربيد.
3. استرجاع Cryoboxes وCryovials من ديوار
- لتبدأ، وضعت على قفازات المبردة وإزالة رفوف الثلاجة 1 أو 2 من ديوار للسماح للغرفة للمناورة.
- كشط بلطف على طول الجزء السفلي من ديوار مع تستقيم متحمل البرد جهاز استرجاع DIY مزودة قوي التعادل قاعدة حزام تي (الشكل 5) وجمع falle مربعn إلى أسفل خزان ديوار ملاحظة: غليان النيتروجين السائل على الفور على اتصال مع كائن أكثر دفئا، يغلف الكائن في عزل غاز النيتروجين (Leidenfrost المفعول). لتبريد جهاز قبل استرجاعها من العينات، وتزج ببطء الجهاز في ديوار والسماح النيتروجين السائل لتبريد جهاز بما فيه الكفاية قبل الشروع في الخطوة أعلاه.
- سحب الجهاز تستقيم على طول الجدران لديوار لحلج القطن مربع المجمد للخروج من دبابة.
- الاستيلاء على مربع التي تم استردادها من الجزء السفلي من ديوار.
- لاسترجاع cryovials، كشط بلطف أسفل ديوار مع cryoscoop مزودة مصفاة (الشكل 9).
- مماثلة لاسترجاع cryobox، سحب الجهاز تستقيم وانتزاع قوارير التي تم جمعها في مصفاة.
4. ممثل النتائج
ويتمثل التحدي الرئيسي في دراسات التعبير الجيني هو أن نوعية الحمض النووي الريبي يعتمد على ظروف التخزينلكل من عينات الأنسجة المجمدة والشكل استخراج الحمض النووي الريبي 4. 10 يظهر تأثير على سلامة التعامل مع عينة من الحمض النووي الريبي مجموع. تعرض الحمض النووي الريبي مجموع من المصدر نفسه الأنسجة (الدهنية لجسم الإنسان) إلى التعامل مع عينة مختلفة. قبل التجربة، سليمة مجموع الحمض النووي الريبي preparate يظهر واضحا 28S و 18S الريباسي العصابات مع الفرقة الريباسي 28S تقريبا ضعف شديد كما الفرقة الريباسي 18S (الشكل 10، لين 1). هذه النسبة 2:1 (28S: 18S) هو إشارة إلى أن الحمض النووي الريبي غير سليمة، في حين أن الحمض النووي الريبي المتدهورة جزئيا يظهر تشويه، أو 28S لها: 18S نسبة كثافة يبتعد 02:01 5. الممرات 3-4 يصور عينات الحمض النووي الريبي مع تدهور كبير. وتعرض هذه العينات على الحمض النووي الريبي defreezing الجزئية المتكررة على المدى القصير الاسترجاع من ديوار (الطريقة أ)، والنمذجة وبالتالي تخزين على المدى الطويل مع الدوري الصب نظرا لضرورة استرجاع من قنينة الذين سقطوا ومربعات (الشكل 10، لين 3-4 ). ومع ذلك، والعينات المخزنة في خدمتها ديوارباستخدام DIY الجهاز (الطريقة ب)، وبالتالي، لا defreezing جزئي، تحتوي على الحمض النووي الريبي سليمة (الشكل 10، لين 2).
الشكل 1. A) وقاعدة تتألف من اثنين من 3 أبعاد قوي من جانب والتعادل هو مبين. كل علاقة وثيقة، يحتوي على واحد كبير قبل حفر حفرة (السهم الصلبة) والعديد من الثقوب الصغيرة (السهم الصغير) على كل وجه. ويوفر هذا الخيار للسماح الربط مع الجوز ومسامير. أيضا أصغر الثقوب تسمح الصرف السريع من النيتروجين السائل خلال استرجاع العينة. B) يتم تقويمها جانب واحد من كل من مباراة قوية مع مساعدة من كماشة لجعل L شكل قوي التعادل.
الشكل 2. يستخدم قوية التعادل حزام تي لتأمين علاقات قوية معا. مثل تحالف قوي، T-حزام واحد كبير قبل حفر حفرة (السهم الصلبة) واثنين من الثقوب الصغيرة (األصغرل السهم) في كل زاوية. وهذا يسمح بتأمين علاقات قوية على طول تي - الشريط باستخدام المكسرات، والترباس. كما أنها تمكن إبزيم حزام T-إلى لوحة فترة زمنية محددة.
الشكل 3. أ) أن تثبت كل علاقة وثيقة إلى إحدى زوايا حزام-T، على طوله باستخدام المكسرات الترباس تاج ومغالق وغسالات. B) يتم تأمين اثنين من العلاقات القوية المجاورة لبعضها البعض للمساعدة في استرداد 5 ½ بوصة × 5 ونصف cryoboxes فيها. لأصغر cryoboxes مثل 2 بوصة X 2 بوصة، ويمكن تثبيتها واحد قوي التعادل مباشرة إلى لوحة فترة زمنية محددة من دون حزام-T.
الشكل 4. مشقوق يتم استخدام لوحة مسطحة والمقبض. طول فترة زمنية محددة لوحة يعتمد على عمق ديوار. في هذه الحالة، تم استخدام 4 أقدام من لوحة فترة زمنية محددة. سماكة لوحة فترة زمنية محددة هي الصورة الحاسمةاينس لوحات رقيقة فترة زمنية محددة (<14 مقاييس) جعل الجهاز واهية في حين استرجاع عينات من النيتروجين السائل ملء ديوار.
الشكل 5. ثم يتم تأمين قاعدة شقة تتكون من علاقات قوامها وحزام تي في واحدة من نهاية فترة زمنية محددة لوحة. يتم محاذاة أكبر ثقب في الزاوية المتبقية من حزام تي مع فتحة على لوحة مسطحة وتثبيتها باستخدام عرافة الترباس والجوز. ويمكن استخدام هذا الجهاز الآن لاسترداد cryoboxes من ديوار.
يعكف الشكل 6. واحدة من نهاية فترة زمنية محددة لوحة الشقة باستخدام كماشة وغطت رغوة مع لتوفير أفضل وخاصة بالنسبة للقبضة Dewars العميقة، كما هو مبين في هذه القضية.
الشكل 7. مصفاة مع اسلاك الصلب والفولاذ المقاوم للمؤشريستخدم لاسترداد cryovials من ديوار. سيكون مطلوبا إذا لم يتم توفير مقبض مع فتحة، مع حفر بت كربيد لحفر حفرة.
الرقم 8. لتخفيف استرجاع cryovials، عازمة مصفاة على طول الرقبة باستخدام كماشة للحصول على شكل مغرفة مصفاة. إذا تم توفير مصفاة مع شفة كما في هذه الحالة، يمكن استخدام كماشة لثنيه. هذا لا يضمن مصفاة ننشغل في ديوار.
يتم تأمين الشكل 9. مصفاة لوحة في شقة واحدة في نهاية فترة زمنية محددة باستخدام عرافة الجوز والترباس.
الرقم 10. سلامة عينة من الحمض النووي الريبي مجموع يتعرضون لمختلف ظروف المناولة عينة. لاستكشاف كيفية تأثر الحمض النووي الريبي الجودة من خلال عينة التعامل مع جonditions، تعرضت مجموعة من عينات الحمض النووي الريبي من نفس المصدر إلى طريقتين من handlings. وتألفت طريقة لتخزين من الحمض النووي الريبي في ديوار تعرض لاسترجاع العينة باستخدام جهاز DIY، وبالتالي لا defreezing جزئي. وتألفت طريقة B من تخزين الحمض النووي الريبي في ديوار التعرض للdefreezing الجزئية المتكررة على المدى القصير الاسترجاع من ديوار، والنمذجة وبالتالي تخزين على المدى الطويل مع الدوري الصب لاسترجاع عينات من سقط. وقد تم تحليل الحمض النووي الريبي ثم مجموع سلامة من قبل الكهربائي للهلام. Lane1: عينة قبل تخزينها في ديوار، لين 2: عينة من ديوار التعرض للاسترجاع من خلال طريقة، لين 3 و 4: عينة من ديوار تعرض لاستردادها من قبل الطريقة ب، M: 100 شركة بريتيش بتروليوم سلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إحدى الطرق الأكثر شيوعا لاسترداد cryoboxes وcryovials من قاع الخزان ديوار هو صب النتروجين السائل في وعاء الغيار وسحب العينات المتبقية في قارورة أو طافية في النيتروجين السائل يصب. هذا، مع ذلك، من الممارسات غير الآمنة التي يمكن أن تسبب حروقا المبردة أو الاختناق بسبب التعرض لفترات طويلة لأبخرة النيتروجين السائل 2. طريقة أخرى شائعة من استرجاع cryovials سقطوا ينطوي على استخدام ملقط cryovial 3. ومع ذلك، فإن الرؤية محدودة داخل فضاء مظلم من خزان مملوء النتروجين السائل يحد من القدرة على المناورة بها.
استرداد DIY متحمل البرد جهاز المذكورة أعلاه توفر بديلا أرخص وأكثر أمنا وأسهل لاسترجاع cryoboxes سقط وcryovials من الجزء السفلي من قوارير عميق مع الرؤية محدودة. سهولة التعامل مع الجهاز استرجاع DIY تلتف على الحاجة لتفريغ القوارير قبل استرجاعها. وعلاوة على ذلك، وأرجعوقال rieval من cryovial بمساعدة جهاز يمكن القيام بها فرد واحد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام جهاز استرجاع DIY تقصير كبير في كمية من عينات أخرى وقت المخزنة في نفس الوحدة انفاق تحت درجات الحرارة المحيطة، وبالتالي تحسين ظروف تخزين عينة 6،7.
العديد من المواد التي تستخدم عادة مثل البلاستيك، والكربون الصلب والمطاط وتصبح هشة في النيتروجين السائل، وكسر في كثير من الأحيان تحت الضغط 8،9،10. والفولاذ المقاوم للصدأ أو المجلفن المكونات المستخدمة في الجهاز DIY هي مقاومة للضرر من دون تجميد درجات الحرارة من السوائل المبردة. وعلاوة على ذلك، وهذه المكونات هي متاحة بسهولة في المتاجر المحلية ومنخفضة التكلفة مع بناء جهاز DIY تصل إلى أقل من دولار و50.00. مقبض طويل يساعد على منع المشغل من الاتصال المباشر مع السوائل المبردة وقاعدة مثقبة ومصفاة تسمح لحظة استنزاف النيتروجين السائل خلال انتعاش عينة. ص السريعetrieval يسمح التعرض إلى الحد الأدنى أبخرة النيتروجين السائل مما يجعل استرجاع عينة أكثر أمنا عملية. نظرا لتصميمها وحدات، وجهاز استرجاع DIY لديه المرونة لاستخدامها في أي من صناديق أو قوارير. علاوة على ذلك، البساطة في التصميم يسمح تكيف الجهاز لDewars متفاوتة الأشكال والأحجام، وربما للعمل مع أنواع أخرى من السوائل المبردة. ربما، واستخدام هذا الجهاز مع ذلك، أن يقتصر في حالة من الدبابات المبردة التي ليس لها قاع مسطح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم اختبار الجهاز DIY استرجاع المبردة في سياق مشاريع "prenylation نمذجة البروتين البكتيري في الخلايا حقيقية النواة استخدام المعلوماتية الحيوية والنهج الجزيئي" التي ترعاها جائزة ماري لويز أندروز لبرنامج أبحاث السرطان، فرجينيا أكاديمية العلوم "، مما يعني الفسيولوجية لتحرير الحمض النووي الريبي في البلازما شجيري خلايا "برعاية Jeffress F. توماس وكيت ميلر Jeffress الثقة التذكارية وعقد 16.740.11.0364 الدولة (وزارة العلوم والتربية، وروسيا). نود أن نشكر بيت بعثة مراقبة الانتخابات للحصول على المساعدة مع تجربة سلامة الحمض النووي الريبي.
References
- Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. , Springer. 41 (1996).
- Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , Plenum Press. New York. (1996).
- Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , National Academies Press. (2011).
- Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
- Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).
- Crawford, R. J. Plastics Engineering. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
- Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. , University of New South Wales Press. (1996).
- Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. , (2003).
