Summary
在这里，我们提出了成本低，耐用cryotolerant设备样品从充满液氮的杜瓦罐检索。易于施工和设备的模块化设计使得低温储罐的样本检索过程的安全和方便。
Abstract
液氮是无色，无嗅，极冷（-196℃）的液体在压力下保持。它通常被用来作为一个长期的生物材料，如血液，细胞和组织1,2长期储存的低温液体。液氮低温性质，而理想的样品保存，可引起接触活组织快速冷冻-被称为“低温烧伤”2，这可能会导致密切合作，参与从杜瓦瓶样品的存储和检索的人严重冻伤。此外，液氮蒸发，降低空气中的氧气浓度，并可能导致窒息，特别是在密闭空间2。
在实验室，生物样品往往存储在冷冻管或不锈钢架堆放在杜瓦罐1 cryoboxes。提供这些存储架，以防止打滑从机架盒与长轴成底部杜瓦在常规处理。然而，过于频繁，箱或珍贵样品小瓶溜出去和充满液氮罐的底部下沉。在这种情况下，样本可以不厌其烦地检索后液氮转移到一个备用的容器中或丢弃它。然后可以相对安全地从回收空杜瓦盒和瓶。然而，低温液态氮，其扩张速度的性质，使沉船样本检索的危险。它通常被推荐样本检索从未由一个人进行了安全处。另一种方法是使用市售的酷抓斗或钳拉出瓶3。在黑暗的充满液体的杜瓦瓶的能见度有限，但在其使用带来的一个主要的限制。
在这篇文章中，我们描述了一个Cryotolerant DIY的检索设备，这使得从杜瓦样本检索含有低温液体既安全建设第二容易。
Protocol
1。大会Cryotolerant设备Cryoboxes检索
- 用钳子，理顺3片面强领带（ 图1A），使L形图1b所示的强领带注：侧。强领带的尺寸可以选择取决于杜瓦颈部直径。
- 确保两个这样的强强烈的领带ţ表带使用皇冠螺栓螺母，垫圈和螺钉形成Cryoscoop基地，在图3（AB）所示（ 图2）注：两强关系是用来允许检索5年半英寸x 5½英寸cryoboxes。
- 使用开槽板（ 图4），强ţ领带皮带上的插槽与插槽对齐开槽板的一端，并确保与帮助希尔曼螺母和螺栓（ 图5），两项合计注：如果开槽板和强烈的领带并没有合作我与预钻孔，您将不得不使用硬质合金钻头孔钻。
- 弯曲的钳子的帮助下，开槽板的另一端， 如图6所示。 （这一步是可选的）。
- 包装用泡沫手柄，更好地掌握设备时，在液氮中， 如图6所示。 （可选） 注意：以高压灭菌前取出泡沫。
2。大会Cryotolerant设备冷冻管检索
Cryotolerant DIY的检索设备，也可以适应冷冻管检索。这涉及到代不锈钢滤网平底舀出液氮瓶（ 图7）改变。
- 拧官方螺栓和螺母，开槽板强领带ţ表带附加。
- 开槽板前附加不锈钢滤网，轻轻弯曲的颈部;这将会使设备更容易操纵，如果过滤网唇，用钳子弯唇：用钳子帮助定位在一个角度基地类似于勺子（ 图8）注意过滤。
- 随着开槽板的孔对准过滤器手柄上的洞，并确保滤网帮助希尔曼螺母和螺栓， 如图8所示的注意的：如果过滤不预钻孔，您将需要安排有硬质合金钻头钻孔。
3。检索的杜瓦Cryoboxes和冷冻管
- 开始，放在低温手套，并删除1个或2个冰柜从杜瓦架到允许的回旋余地。
- 轻轻刮去沿杜瓦底部的直立Cryotolerant DIY检索装有强领带ţ表带基地（ 图5）设备和收集箱fallen个底部的杜瓦罐注：液氮沸腾。立即用温暖的对象接触，包绕在绝缘氮气体（Leidenfrost效果）的对象。冷却装置之前，检索样本，慢慢地浸入到杜瓦设备，并允许液氮冷却，然后再进行上述步骤的设备足够。
- 直立拉设备，沿墙壁杜瓦罐舀出冷冻箱。
- 抓斗从杜瓦底部检索框。
- 检索冷冻管，轻轻刮去杜瓦的底部装有一个过滤器（ 图9）cryoscoop。
- 类似cryobox检索，正直和抢拉设备在过滤器收集的小瓶。
4。代表结果
在基因表达研究中的一个主要挑战是，RNA的质量取决于储存条件冷冻组织标本，提取RNA。 图10显示了样品处理的总RNA的完整性的影响。来自同一组织源（人体脂肪）的总RNA受到不同的样品处理。实验之前，完整的总RNA的preparate显示清晰的28S和18S rRNA基因与28S rRNA的乐队乐队约两倍激烈的18S rRNA带（ 图10，泳道1）。这个比例为2:1（28S：18S）是一个迹象表明，RNA是完整的，而部分降解的RNA出现一抹黑，或者其28S 18S强度比从2:1 5出发。泳道3-4描绘了显着降解的RNA样品。这些RNA样品经反复局部defreezing从杜瓦（方法A）的短期检索，从而建模与长期贮存定期滗由于堕落瓶和盒检索的必要性（ 图10巷3-4 ）。然而，样本存储在杜瓦服务使用自助设备（方法B），因此，没有偏defreezing，包含完整的RNA（ 图10巷2号）。
图1。 A）该基地由两个3双面强领带的尺寸。每一个强烈的领带，包含一个大型预钻孔（实心箭头）和多个较小的孔，每个面（小箭头）。这提供了一个选项，以允许用螺母和螺栓紧固。还小的孔允许在样本检索液氮快速排水B）强烈的领带一边用钳子的帮助，使L形强领带拉直。
图2。强领带ţ表带的用于保护强联系在一起。像强领带，T字表带一体的大型预钻孔（实心箭头）和两个较小的孔（SMaL公司升箭头）上的每一个角落。这可以确保沿长度的T强关系 - 表带使用的螺母和螺栓。这也使T型带固定槽板。
图3。一）每个强领带系T型带的一个角落，沿其长度冠螺栓螺母，螺栓和垫圈。 乙）两强关系获得彼此相邻，以帮助检索5½英寸×5½英寸cryoboxes。小cryoboxes如2英寸x 2英寸，单强领带可以直接固定开槽板，没有一个T-表带。
图4。开槽平板作为手柄使用。开槽板的长度取决于杜瓦的深度。在这种情况下，使用了4英尺开槽板。开槽板的厚度是非常重要的小号自从开槽薄钢板（<14计），使设备薄弱，同时检索充满杜瓦液氮样品。
图5。强关系和T带平底组成，然后开槽板的一端固定在。其余的T表带角落较大的孔对齐平板插槽，并用六角螺栓和螺母紧固。该装置可用于检索从杜瓦cryoboxes。
图6。开槽平板的一端用钳子弯曲，并用泡沫覆盖，以提供更好的抓地力，特别是深杜瓦瓶，在这种情况下所示。
图7。滤网，丝网和不锈钢拉手用于检索从杜瓦冷冻管。如果手柄没有提供一个插槽，钻硬质合金钻头钻一个洞，将需要。
图8。为了便于检索的冷冻管，过滤器一起用钳子杓形滤网的颈部弯曲。如果唇在这种情况下，提供了过滤器，钳子可以用来弯曲。这可确保滤网内没有得到杜瓦捕获。
图9。过滤器的一端固定在平板开槽六角螺母和螺栓。
图10。样品的总RNA的完整性受到不同的样品处理的条件。探讨如何处理C样品的影响RNA的质量onditions，一套来自同一来源的RNA样品受到两种方法的装卸。在使用自助设备的样品检索杜瓦，因此，没有偏defreezing包括RNA的存储方法A。方法B遭受杜瓦短期检索重复的部分defreezing存储在杜瓦的RNA，从而建模与长期存储，检索下跌样品定期调迁。总RNA的完整性，然后用凝胶电泳分析。泳道1：样品前存储杜瓦;巷2：从的杜瓦样品遭受的检索方法A; 3巷，4：样品从遭受的检索方法B杜瓦，M：100 bp的阶梯。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
检索cryoboxes和冷冻管从杜瓦罐底部的最常用的方法之一是迁置到一个备用的容器中的液态氮和拉出样品留在烧瓶或漂浮在倒出的液氮。然而，这是一个不安全的做法，可能会导致低温烫伤或窒息，由于长时间暴露在液氮蒸汽2。其他常见的方式检索堕落的冷冻管涉及使用离心管钳3。然而，黑暗的空间内充满液氮罐的能见度有限，限制了其可操作性。
如上所述的Cryotolerant DIY检索设备提供了一个检索下降cryoboxes和冷冻管从有限的能见度深瓶的底部更便宜，更安全，更容易替代。 DIY的检索设备易于处理规避需要清空之前检索的烧瓶。此外，在RET与离心管rieval的帮助表示装置可以由一个人单独进行。此外，DIY的检索设备的使用大大缩短了环境温度下储存在同一个单位花费的时间等样品的数量，从而提高样品的储存条件6,7。
许多常用材料，如塑料，碳素钢和橡胶变脆，在液氮中，经常断裂压力下8,9,10。 DIY的设备中使用的不锈钢或镀锌元件耐低温液体分冷冻温度损坏。此外，这些组件是在当地的五金商店和金额少于$ 50.00的自助设备的建设成本低，容易获得。长柄有助于防止运营商直接接触，允许即时排水样品回收率在液氮低温液体和穿孔基地和过滤。快速ŕetrieval液氮蒸汽，使样品检索一个更安全的过程中允许的最小曝光。由于其模块化设计，DIY的检索设备，要么盒或瓶的灵活性。此外，简单的设计使设备可适应不同的形状和大小，并可能与其他类型的低温液体杜瓦瓶。使用该设备的可能，但是，只限于在低温储罐的情况下，没有平底。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
“在真核细胞中，利用生物信息学和分子生物学方法的建模细菌蛋白质异戊烯”玛丽·路易丝·安德鲁斯奖的癌症研究计划，弗吉尼亚州科学院主办，“血浆中的RNA编辑的生理意义的项目过程中，DIY低温检索设备已测试树突状细胞“由托马斯·Jeffress和凯特·米勒Jeffress纪念信托和国家合同16.740.11.0364（科教部，俄罗斯）。我们想感谢援助与RNA的完整性实验贝丝EOM。
References
- Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. , Springer. 41 (1996).
- Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , Plenum Press. New York. (1996).
- Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , National Academies Press. (2011).
- Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
- Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).
- Crawford, R. J. Plastics Engineering. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
- Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. , University of New South Wales Press. (1996).
- Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. , (2003).
