Summary
כאן אנו מציגים בעלות נמוכה, המכשיר עמיד cryotolerant לאחזור מדגם טנקים דיואר מלא חנקן נוזלי. קלות הבנייה העיצוב המודולרי של המכשיר הופך את תהליך אחזור מדגם ומכלי קירור קלה ובטוחה.
Abstract
חנקן נוזלי הוא חסר צבע, חסר ריח, קר מאוד (-196 ° C) נוזלי כל הזמן תחת לחץ. זה הוא נפוץ כמו נוזל קירור לאחסון לטווח ארוך של חומרים ביולוגיים, כגון כדוריות הדם 1,2 רקמות. הטבע קריוגני של חנקן נוזלי, בעוד אידיאלי לשימור הדגימה, יכול לגרום הקפאה מהירה של רקמות חיות על קשר - המכונה "קריוגני לשרוף '2, אשר עשוי להוביל כוויות קור קשות בבני אדם מעורב מקרוב אחסון ואחזור של דגימות Dewars. בנוסף, כמו חנקן נוזלי מתאדה היא מפחיתה את ריכוז החמצן באוויר ועלולים לגרום חנק, במיוחד בחללים סגורים 2.
במעבדות, דגימות ביולוגיות מאוחסנות בדרך כלל cryovials או cryoboxes מוערמים על מדפי נירוסטה בתוך הטנקים דיואר 1. מתלים אלו אחסון מסופקים עם מוט ארוך על מנת למנוע החלקת תיבות מן המדפים את בתחתיתDewars במהלך טיפול שגרתי. לעתים קרובות מדי, עם זאת, תיבות או צלוחיות עם דגימות יקרות להחליק החוצה לשקוע בתחתית המכל מלא חנקן נוזלי. במקרים כאלה, דוגמאות אפשר היה לאחזר לעייפה לאחר העברת חנקן נוזלי לתוך מיכל רזרבי או ביטול זה. את קופסאות צלוחיות אז יכול להיות התאושש יחסית בשלום דיואר התרוקן. עם זאת, אופי קריוגני של חנקן נוזלי קצב ההתפשטות שלה עושה את מסוכנים שקועות אחזור לדוגמה. מומלץ בדרך כלל על ידי משרד הבטיחות מדגם אף פעם לא אחזור להתבצע על ידי אדם אחד. חלופה נוספת היא להשתמש grabbers מגניב זמינים מסחרית או מלקחיים כדי לשלוף את צלוחיות 3. עם זאת, הראות מוגבלת בתוך Dewars כהים מלאים נוזל מהווה מגבלה משמעותית את השימוש בהם.
במאמר זה, אנו מתארים את הבנייה של המכשיר DIY Cryotolerant אחזור, מה שהופך אחזור מדגם דיואר המכיל נוזלים קריוגני הן בטוחותND קלים.
Protocol
1. הרכבה של התקן Cryotolerant לאחזור של Cryoboxes
- באמצעות צבת, ליישר את צד אחד של 3 צדדית חזקה, עניבה (איור 1 א) כדי להפוך הערה בצורת L חזק עניבה שמוצג באיור 1 ב. ממדים של תיקו חזקה ניתן לבחור תלוי בקוטר של הצוואר של דיואר .
- לאבטח את שני אלה חזק הקשר עם רצועת עזה T-עניבה (איור 2) באמצעות כתר בורג, אגוז מכונת כביסה בורג כדי ליצור את הבסיס Cryoscoop כפי שמוצג באיור 3 (AB). הערה: שני קשרים חזקים משמשים כדי לאפשר אחזור של 5 ½ פנימה X 5 וחצי פנימה cryoboxes.
- באמצעות צלחת מחוררת (איור 4), יישר את חריצי על רצועת עזה, עניבה T עם החריצים בצד אחד של הצלחת מחוררת לאבטח את השניים יחד עם עזרה של אגוז הילמן ברגים (איור 5). הערה: אם צלחת מחוררת חזקה של עניבה לא שותףלי עם חורים שנקדחו מראש, תצטרך יש חורים שנקדחו באמצעות קצת קרביד תרגיל.
- לכופף את הקצה השני של צלחת מחוררת ובעזרת צבת כפי שמוצג באיור 6. (שלב זה הוא אופציונלי).
- לעטוף את הידית עם קצף טוב יותר לתפוס את המכשיר כאשר בחנקן נוזלי כפי שמוצג באיור 6. (לא חובה) הערה: הסר את הקצף לפני מעוקר.
2. הרכבה של התקן Cryotolerant לאחזור של Cryovials
מכשיר אחזור Cryotolerant DIY יכול גם להיות מותאם לשליפה של cryovials. זה כולל החלפת בסיס שטוח עם מסננת נירוסטה כפי שמוצג שינו את גורפת את צלוחיות של חנקן נוזלי (איור 7).
- קראון להתיר ברגים ואומים מצרף את רצועת עזה, עניבה T לצלחת מחוררת.
- לפני הצמדת מסננת נירוסטה לצלחת מחוררת, בעדינות לכופף את הצוואר שלמסננת בעזרת צבת לבסיס המזרח בזווית דומה מצקת (איור 8) הערה: אם מסננת מגיע עם השפה, השתמש צבת לכופף את השפה למטה, זה יעשה את התמרון עם המכשיר קלה יותר..
- יישר את חור על הידית של המסננת עם החורים על צלחת מחוררת ולהבטיח מסננת עם עזרה של אגוזים הילמן ברגים כפי שמוצג באיור 8. הערה: אם לא בא מסננת עם חורים שנקדחו מראש, יהיה עליך לסדר יש חורים שנקדחו עם המקדח קרביד.
3. אחזור Cryoboxes ו Cryovials מ דיואר
- כדי להתחיל, לשים את הכפפות קריוגני ולהסיר 1 או 2 מדפי הקפאה של דיואר לאפשר מקום תמרון.
- בעדינות לגרד בחלק התחתון של דיואר עם מכשיר זקוף DIY Cryotolerant אחזור מצויד עם בסיס חזק T-עניבה הרצועה (איור 5) ולאסוף falle תיבתn כדי בתחתית הערה דיואר מיכל:. רותח חנקן נוזלי באופן מיידי על קשר עם חפץ חם, עוטף את האובייקט בידוד גז חנקן (אפקט Leidenfrost). כדי לצנן את המכשיר לפני שליפה של דגימות, לאט לטבול את המכשיר לתוך דיואר ולאפשר חנקן נוזלי כדי לצנן את המכשיר מספיק לפני שתמשיך לשלב לעיל.
- משוך את המכשיר זקוף לאורך הקירות של דיואר כדי לגרוף את תיבת במקפיא מתוך הטנק.
- תפוס את תיבת לאחזר מהחלק התחתון של דיואר.
- לאחזור cryovials, בעדינות לגרד את תחתית דיואר עם cryoscoop מצויד עם מסננת (איור 9).
- בדומה cryobox אחזור, למשוך את המכשיר זקוף לתפוס את מבחנות שנאספו מסננת.
4. נציג תוצאות
אתגר מרכזי במחקרים התבטאות גנים היא שאיכות RNA תלוי בתנאי האחסוןהן דגימות רקמה קפואים איור חילוץ RNA 4. 10 מראה את ההשפעה של הטיפול על שלמות מדגם של רנ"א הכל. סך הכל RNA ממקור רקמות זהה (השומן האנושי) היה נתון בטיפול מדגם שונה. לפני הניסוי, ללא שינוי סך RNA פרפרט מראה ברורים 28S ו 18s rRNA להקות עם הלהקה 28S rRNA בערך פי שניים אינטנסיבי כלהקה 18s rRNA (איור 10, מסלול 1). זה ביחס של 2:1 (28S: 18s) הוא אינדיקציה לכך RNA לא נפגע, ואילו RNA מושפל חלקית מופיע כתם, או 28S שלה: 18s יחס יוצא מן העוצמה 02:01 5. מסלולים 3-4 מתאר דגימות רנ"א עם ירידה משמעותית. דגימות אלה רנ"א היו נתונים defreezing חלקי חזר ידי לטווח קצר retrievals של דיואר (שיטה), ובכך דוגמנות אחסון ארוך טווח עם תקופתי decanting בשל הצורך אחזור של צלוחיות וקופסאות (איור 10, ליין 3-4 ). עם זאת, דגימות מאוחסנים דיואר שירותבאמצעות המכשיר עשה זאת בעצמך (שיטה ב '), ולכן, לא defreezing חלקית, מכילים RNA תמימים (איור 10, ליין 2).
באיור 1. א) הבסיס מורכב משני 3 חזק עניבה של ממדים צדדית המוצגים. כל העניבה חזק מכיל חור אחד גדול מראש קדח (החץ מוצק) ו חורים קטנים רבים (חץ קטן) על פני כל אחד. זה מספק אפשרות לאפשר לחיזוק עם אגוזים ברגים. גם את החורים הקטנים לאפשר ניקוז מהיר של חנקן נוזלי במשך אחזור לדוגמה. ב) צד אחד של כל אחד העניבה חזק הוא יישר בעזרת פלייר כדי להפוך ל 'בצורת חזק, עניבה.
איור 2. חזק עניבה רצועת T משמש להבטחת חזק הקשר יחד. כמו חזק, עניבה, T-רצועת יש חור אחד גדול קדח מראש (החץ מוצק) ושני חורים קטנים יותר (smalאני חץ) בכל פינה. זה מאפשר להבטיח חזק קשרים לאורכו של טי - רצועה באמצעות אגוזים הבריח. הוא גם מאפשר הידוק T-הרצועה לצלחת מחוררת.
איור 3. א) הקשר חזק כל נצמדת בפינה אחת של רצועת-T, לאורכו באמצעות הבריח הכתר אגוזים, ברגים מכונות כביסה. ב ') שני חזק קשרים מאובטחים סמוכים זה לזה כדי לאחזר 5 ½ 5 ½ פנימה X cryoboxes פנימה. עבור cryoboxes קטנים יותר כגון 2 X 2 פנימה פנימה, אחד חזק הקשר יכול להתהדק ישירות צלחת מחוררת ללא רצועת-T.
איור 4. מחוררת צלחת שטוחה משמשת הידית. אורך צלחת מחוררת תלוי בעומק של דיואר. במקרה זה, 4 כפות של צלחת מחוררת היה בשימוש. עובי צלחת מחוררת הוא קריטיאינס צלחות חריץ דק (<14 מדדים) להפוך את המכשיר דקיק תוך אחזור דגימות חנקן נוזלי מלא דיואר.
איור 5. בסיס שטוח המורכב חזק עניבות רצועת T מאובטח אז בקצה אחד של צלחת מחוררת. חור גדול בפינת הנותר של הרצועה T מיושר עם החריץ בצלחת שטוחה הידק באמצעות בורג אגוז hex ו. מכשיר זה יכול לשמש כעת לאחזר cryoboxes של דיואר.
איור 6. קצה אחד של צלחת שטוחה מחוררת כפופה באמצעות צבת, מכוסה קצף כדי לספק אחיזה טובה במיוחד Dewars עמוקים, כפי שמוצג במקרה זה.
איור 7. מסננת עם רשת התיל ידית נירוסטההמשמש לאחזור cryovials של דיואר. אם הידית לא מסופק עם חריץ, לקדוח עם קצת קרביד יידרש קידוח חור.
איור 8. כדי להקל על שליפת cryovials, מסננת כפופה לאורך הצוואר באמצעות צבת לקבל מצקת מסננת בצורת. אם מסננת מסופק עם השפה כמו במקרה זה, צבת ניתן לכופף אותו. זה מבטיח מסננת לא להיתפס בתוך דיואר.
איור 9. מסננת מאובטח על צלחת שטוחה מחוררת בקצה אחד באמצעות אגוז hex ו הבריח.
איור 10. שלמות המדגם של רנ"א הכל נתון בתנאים טיפול שונים לדוגמה. לחקור כיצד איכות RNA מושפע מדגם טיפול גonditions, סט של דגימות רנ"א מאותו המקור היה נתון שתי שיטות handlings. השיטה כללה אחסון של RNA ב דיואר נתון retrievals מדגם באמצעות המכשיר עשה זאת בעצמך, ובכך לא defreezing חלקי. שיטה ב 'כוללת אחסון של RNA של דיואר נתון defreezing חלקי חזר על ידי לטווח קצר retrievals של דיואר, ובכך דוגמנות אחסון ארוך טווח עם תקופתי decanting לאחזור דגימות שנפלו. סה"כ שלמות RNA נותח ולאחר מכן על ידי ג'ל אלקטרופורזה. Lane1: לדוגמא לפני אחסון דיואר, ליין 2: דוגמה של דיואר נתון אחזור בשיטה, ליין 3, 4: דוגמה של דיואר נתון אחזור על ידי שיטה ב, ז: 100 סולם BP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחת השיטות הנפוצות ביותר של אחזור cryoboxes ו cryovials מהחלק התחתון של הטנק דיואר היא למזוג חנקן נוזלי לתוך מיכל רזרבי ולשלוף את הדגימות שנותרו בבקבוק או צף חנקן נוזלי יצק. זהו, עם זאת, בפועל לא בטוח שעלול לגרום לכוויות קריוגני או מחנק עקב חשיפה ממושכת אדי חנקן נוזלי 2. דרך מקובלת אחרת של שליפת cryovials חללי כרוך השימוש מלקחיים cryovial 3. עם זאת, הראות מוגבלת בתוך המרחב האפל של טנק מלא חנקן נוזלי מגבילה את יכולת התמרון שלהם.
מכשיר אחזור Cryotolerant DIY לעיל מספק חלופה זולה יותר, בטוח יותר וקל יותר לאחזור cryoboxes שנפלו cryovials מהחלק התחתון של צלוחיות עמוקות עם ראות מוגבלת. קלות הטיפול במכשיר אחזור DIY עוקף את הצורך לרוקן את צלוחיות שקדמו אחזור. יתר על כן, retrieval של cryovial בעזרת אמר המכשיר יכול להתבצע על ידי אדם אחד. בנוסף, השימוש של המכשיר אחזור DIY באופן משמעותי מקצר את משך זמן מדגמים אחרים המאוחסנים באותה יחידה להוציא תחת בטמפרטורות הסביבה, ובכך לשפר את תנאי האחסון מדגם 6,7.
חומרים נפוצים רבים כגון פלסטיק, מתכת וגומי פחמן הופכות פריכות בחנקן נוזלי, ולא פעם שבר תחת לחץ 8,9,10. את נירוסטה או מגולוון רכיבים המשמשים למכשיר DIY עמידים בפני נזקי תת הקפאת טמפרטורות של נוזלי קירור. יתר על כן, רכיבים אלו זמינים בקלות בחנויות החומרה המקומית של עלות נמוכה עם בנייה של המכשיר עשה זאת בעצמך בהיקף של פחות מ 50.00 $. ידית ארוכה מסייעת למנוע המפעיל מכל מגע ישיר עם נוזלי קירור וכן בסיס מחורר מסננת לאפשר ניקוז מיידי של חנקן נוזלי במהלך ההתאוששות המדגם. R מהירהetrieval מאפשרת חשיפה מינימלית אדי חנקן נוזלי עושים אחזור מדגם תהליך בטוח יותר. בשל העיצוב המודולרי שלו, את המכשיר אחזור עשה זאת בעצמך יש את הגמישות להשתמש בהם גם עבור תיבות או צלוחיות. יתר על כן, את הפשטות של העיצוב מאפשר למכשיר להיות מותאמים עבור Dewars של בצורות ובגדלים שונים ואולי גם לעבוד עם סוגים אחרים של נוזלים קריוגני. השימוש במכשיר זה עשוי, עם זאת, מוגבלת במקרה של מיכלי קירור שאין להם קרקעית שטוחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עשה זאת בעצמך מכשיר קריוגני אחזור נבדקו במהלך הפרויקטים "חלבון חיידקי דוגמנות prenylation בתאים האיקריוטים באמצעות ביואינפורמטיקה גישות מולקולריות" בחסות פרס מרי לואיז אנדרוז תוכנית לחקר הסרטן, וירג'יניה האקדמיה למדעים ", כלומר הפיזיולוגי של עריכת רנ"א בפלסמה תאים דנדריטים "בחסות פ תומאס Jeffress וקייט מילר Jeffress הזיכרון אמון חוזה המדינה 16.740.11.0364 (משרד המדע החינוך, רוסיה). אנו רוצים להודות בית המשקיפים על הסיוע בניסוי שלמות RNA.
References
- Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. , Springer. 41 (1996).
- Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , Plenum Press. New York. (1996).
- Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , National Academies Press. (2011).
- Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
- Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).
- Crawford, R. J. Plastics Engineering. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
- Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. , University of New South Wales Press. (1996).
- Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. , (2003).
