Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Här presenterar vi en låg kostnad, hållbar cryotolerant enhet för prov hämtning från Dewar tankar fyllda med flytande kväve. Den enkla konstruktionen och den modulära utformningen av anordningen gör processen av prov hämtning från kryogena tankar säkert och enkelt.

Abstract

Flytande kväve är färglös, luktlös, extremt kallt (-196 ° C) vätska hålls under tryck. Den används ofta som en kryogen vätska för långtidsförvaring av biologiska material såsom blod, celler och vävnader 1,2. Den kryogena natur flytande kväve, medan idealisk för förvaring av prover, kan orsaka en snabb frysning av levande vävnader vid kontakt - känd som "kryogen Bränn" 2, vilket kan leda till allvarlig köldskador hos personer engagerade i lagring och hämtning av prover från termosbehållare med låg vikt. Dessutom, såsom flytande kväve avdunstar det minskar syrekoncentrationen i luften och kan orsaka kvävning, speciellt i begränsade utrymmen 2.

I laboratorier, är biologiska prover ofta lagras i kryokärl eller cryoboxes staplade i rostfritt stål rack inom Dewar tankarna 1. Dessa lagerhyllor är försedda med en lång axel för att förhindra lådor från att glida ut ur racken och in i botten avTermosbehållare med låg vikt vid rutinmässig hantering. Alltför ofta, men lådor eller injektionsflaskor med dyrbara prover glider ut och sjunker till botten av vätskefyllda kväve tanken. I sådana fall kan prover tediously hämtas efter överföring av flytande kväve till en extra behållare eller kasta den. Lådorna och flaskor kan sedan vara relativt säkert återhämtat sig från tömmas Dewar. Men gör kryogen typ av flytande kväve och expansionstakt sjunkna farligt prov hämtning. Det är allmänt rekommenderas av Safety kontor som provet återtag aldrig utföras av en enda person. Ett annat alternativ är att använda kommersiellt tillgängliga häftiga grabbers eller tång att dra ut flaskorna 3. Men innebär begränsad sikt inom de mörka vätskefyllda termosbehållare med låg vikt en stor begränsning i användningen av dem.

I den här artikeln beskriver vi byggandet av en Cryotolerant DIY hämtning enhet, vilket gör prov hämtning från Dewar innehåller frysmedier både säkra ennd lätt.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Montering av Cryotolerant Anordning för hämtning av Cryoboxes

  1. Med en tång, räta ut en sida av 3 sidig stark-tie (figur 1 A) för att göra en L-formad stark-tien visas i figur 1B Anm. Dimensioner stark-tien kan väljas beroende på diametern av halsen på Dewar- .
  2. Säkra två sådana starka band med en stark slips T bandet (figur 2) med Crown bult mutter, bricka och skruv för att bilda Cryoscoop basen som visas i figur 3 (AB) Anm.: Är två starka band används för att tillåta hämtning av 5 ½ tum x 5 ½ i. cryoboxes.
  3. Med hjälp av en slitsad platta (Figur 4), rikta in spåren på starka slips T band med spåren på ena änden av slitsade plattan och säkra två tillsammans med hjälp av Hillman mutter och bultar (Figur 5) Anm.: Om slitsade plattan och starka band s inte samarbeta intemig med förborrade hål, måste du ha hål borras med hårdmetall borr.
  4. Böja den andra änden av den slitsade skivan med hjälp av en tång som visas i figur 6. (Detta steg är valfritt).
  5. Linda handtaget med skum för att bättre förstå enheten i flytande kväve som visas i figur 6. (Tillval) Obs: Ta bort skummet innan autoklavering.

2. Montering av Cryotolerant Anordning för hämtning av kryokärl

Den Cryotolerant DIY Borttagningsmedlet kan även anpassas för hämtning av kryokärl. Detta innebär att ersätta den platta botten med en rostfri sil som visas ändras för skopar upp flaskor från flytande kväve (Figur 7).

  1. Lossa på Crown muttrar och bultar som fäster starka band T bandet till slitsade plattan.
  2. Innan du monterar den rostfria silen till slitsade plattan, försiktigt böja halsensilen med hjälp av tång för att orientera basen i en vinkel för att likna en skänk (Figur 8) Obs: Om silen kommer med en läpp, tång att böja läppen ner, detta gör manövrering med enheten lättare..
  3. Rikta in hålet på handtaget silen tillsammans med hålen på slitsade plattan och säkra silen med hjälp av Hillman skruvar och muttrar som visas i Figur 8 Anm: Om silen inte kommer med förborrade hål, behöver du att ordna för att ha hål borrade med hårdmetall borr.

3. Hämtning Cryoboxes och kryobehållare Från Dewar

  1. Till att börja med sätta på kryogena handskarna och ta 1 eller 2 frys rack från Dewar att ge utrymme för manövrering.
  2. Försiktigt skrapa längs botten av Dewar med upprättstående Cryotolerant DIY Borttagningsmedlet försedd med starka band T remmen bas (Figur 5) och samla lådan Fallen till botten av Dewar-behållaren Anm. Flytande kväve kokar omedelbart vid kontakt med en varmare objekt, som omsluter föremålet i isolerande kvävgas (Leidenfrost effekt). Att kyla anordningen före hämtning av prover, långsamt doppa anordningen i Dewar-enheten och tillåter flytande kväve för att kyla anordningen tillräckligt innan man fortsätter med steget ovan.
  3. Dra enheten upprätt längs väggarna i Dewar att ösa frysen lådan ur tanken.
  4. Greppa lådan hämtas från botten av Dewaren.
  5. För att hämta kryobehållare, försiktigt skrapa botten av Dewar med cryoscoop försedd med en sil (figur 9).
  6. I likhet med cryobox hämtning, dra enheten upprätt och ta flaskorna samlats i silen.

4. Representativa resultat

En stor utmaning i studier genuttryck är att kvaliteten av RNA beror på lagringsförhållandenför båda frysta vävnadsprover och extraherades RNA 4. Figur 10 visar effekten av provhanteringssystemet på integriteten av totalt RNA. Totalt RNA från samma vävnad källa (humant adipos) utsattes för olika provhantering. Före experimentet visar intakt totalt RNA preparate tydliga 28S-och 18S-rRNA-banden med 28S rRNA-band ungefär dubbelt så intensiv som den 18S-rRNA-bandet (figur 10, bana 1). Detta förhållandet 2:1 (28S: 18S) är en indikation på att RNA är intakt, medan delvis försämrat RNA visas som en smet, eller dess 28S: 18S intensitetskvot avgår från 2:1 5. Lanes 3-4 skildrar RNA-prov med betydande nedbrytning. Dessa RNA-prover utsattes för upprepade delvis defreezing av kortsiktiga hämtats från det Dewar (metod A), vilket modellering långtidslagring med periodisk dekantering på grund av nödvändigheten av att hämta den fallna flaskor och lådor (Figur 10, Lane 3-4 ). Men prover lagras i Dewar serviceanvändning GDS anordning (Metod B), och sålunda ingen partiell defreezing, innehålla intakt RNA (figur 10, bana 2).

Figur 1
Figur 1. A) Basen består av två 3 dubbelsidiga visas stark tie dimensioner. Varje stark slips innehåller en stor förborrade hålet (fast pil) och flera mindre hål (liten pil) på varje ansikte. Detta ger en möjlighet att låta fastsättning med mutter och bultar. Också de mindre hålen tillåter snabb dränering av flytande kväve under provet hämtning. B) En sida av vardera av den starka-tie riktas med hjälp av en tång för att göra en vinkelformad stark-tien.

Figur 2
Figur 2. Strong-slips T band används för att säkra starka band tillsammans. Liksom starkt slips, har T-bandet en stor förborrade hålet (fast pil) och två mindre hål small pil) i varje hörn. Detta gör säkra starka band längs längden av T - Strap med nötter och bult. Det möjliggör också fastsättning T-rem på slitsade plattan.

Figur 3
Figur 3. A) Varje stark slips är fäst ett hörn av T-bandet, längs dess längd med nötter krona bult, muttrar och brickor. B) Två starka band fästs intill varandra för att hjälpa hämta 5 ½ tum x 5 ½ i. cryoboxes. För mindre cryoboxes såsom 2 tum x 2 tum, kan en enda stark-tien fästas direkt till den slitsade plattan utan en T-rem.

Figur 4
Figur 4. Slotted plan platta används som handtag. Längd av den slitsade plattan beror på djupet på Dewar. I detta fall var 4 fot från slitsad platta användes. Tjockleken på slitsade plattan är avgörande sedan tunna slitsade plattor (<14 mätare) gör att enheten tunn samtidigt som hämtar prover från flytande kväve fylld Dewar.

Figur 5
Figur 5. Den platta delen består av starka-heter och T remmen är sedan fäst vid en ände av den slitsade skivan. Det större hålet på den återstående hörnet av T remmen är i linje med slitsen på den plana plattan och förankrade med hex bult och mutter. Den här enheten kan nu användas för att hämta cryoboxes från Dewar.

Figur 6
Figur 6. En ände av det slitsade plan platta böjs med en tång och täckt med skum för att ge bättre grepp speciellt för djupa termosbehållare med låg vikt, såsom visas i detta fall.

Figur 7
Figur 7. Sil med metallnät och rostfritt stål handtaganvänds för att hämta kryokärl från Dewar. Om handtaget inte är försedd med en slits, borra med hårdmetall biten kommer att krävas för att borra ett hål.

Figur 8
Figur 8. För att underlätta hämtning av kryokärl, är silen böjd längs halsen med en tång för att få skänk formade sil. Om silen är försedd med läppen som i detta fall kan tång användas för att böja den. Detta säkerställer sil inte fastnar i Dewar.

Figur 9
Figur 9. Sil är fäst till den slitsade plan platta vid en ände med användning av muttern och bulten.

Figur 10
Figur 10. Exempel på integritet total RNA utsätts för olika förhållanden provhantering. Att utforska hur RNA kvalitet påverkas av provhantering cILLKOR tillsattes en uppsättning av RNA-prov från samma källa utsattes för två metoder för hanteringar. Metod A bestod av lagring av RNA i Dewar utsätts för prov hämtning med DIY-enhet, alltså ingen partiell defreezing. Metod B bestod av lagring av RNA i Dewar utsatts för upprepade delvis defreezing av kortsiktiga hämtats från det Dewar, vilket modellering långtidslagring med periodisk dekantering för att hämta fallna prover. Totalt RNA-integritet analyserades sedan genom gelelektrofores. Lane1: provet före lagring i Dewar, Bana 2: prov från Dewar utsätts för hämtning av metod A, bana 3, 4: prov från Dewar utsätts för hämtning av Metod B, M: 100 bp stege.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En av de vanligaste metoderna för att hämta cryoboxes och kryobehållare från botten av Dewar-behållaren är för dekantering flytande kväve till en extra behållare och dra ut proverna kvar i kolven eller flyter i dekanterades flytande kväve. Detta är dock en riskabel tillämpning, som kan orsaka kryogena brännskador eller kvävning på grund av långvarig exponering för flytande kväve ångor 2. Andra vanliga sätt att hämtning av fallna kryokärl innebär användning av köldkärlet tänger 3. Men begränsar den begränsade sikten i det mörka utrymmet av tanken fylld med flytande kväve manövreringsförmåga.

Den Cryotolerant DIY hämta enhet som beskrivs ovan ger en billigare, säkrare och enklare alternativ för att hämta fallna cryoboxes och kryokärl från botten av djupa kolvar med begränsad sikt. Det enkla handhavandet DIY inhämtningsanordningen kringgår behovet av att tömma kolvarna före hämtning. Dessutom RETrieval av köldkärlet med hjälp av nämnda anordning kan utföras av en enda person. Dessutom förkortar användandet av den själv-inhämtningsanordningen väsentligen den tid som andra prover lagrade i samma enhet tillbringar under omgivande temperaturer, vilket förbättrar prov lagringsbetingelser 6,7.

Många vanliga material som plast, kolstål och gummi blir sprött i flytande kväve, och ofta brott under stress 8,9,10. De rostfria eller galvaniserade komponenter som används i DIY-enheten är resistenta mot skador från köldgrader i frysmedier. Dessutom är dessa komponenter är lätt tillgängliga i lokala järnaffärer och låg kostnad med byggandet av DIY-enhet uppgår till mindre än $ 50,00. Det långa handtaget förhindrar föraren från direkt kontakt med de frysmedier och den perforerade basen och sil tillåter omedelbar tömning av flytande kväve under prov återhämtning. Den snabba retrieval kan minimera exponeringen för flytande kväve ångor gör provet hämtning en säkrare process. Tack vare sin modulära konstruktion, har själv inhämtningsanordningen flexibilitet som ska användas för antingen lådor eller flaskor. Vidare medger den enkla konstruktionen av anordningen för att vara anpassad för termosbehållare med låg vikt av varierande former och storlekar och eventuellt för att arbeta med andra typer av kryogena fluider. Användning av denna enhet kan dock vara begränsad i fråga om kryogena tankar som inte har en plan botten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

DIY kryogen Borttagningsmedlet hade testats i samband med projekten "Modeling bakteriellt protein prenylering i eukaryota celler med hjälp av bioinformatik och molekylär metoder" sponsrad av Mary Louise Andrews Award for Cancer Research program, Virginia Academy of Science ", fysiologisk betydelse av RNA Redigera i plasma dendritiska celler "som sponsras av Thomas F. Jeffress och Kate Miller Jeffress Memorial samverkan och statligt avtal 16.740.11.0364 (Ministeriet för vetenskap och utbildning, Ryssland). Vi vill tacka Beth Eom för hjälp med RNA integriteten experimentet.

References

  1. Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. Springer. 41 (1996).
  2. Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. Plenum Press. New York. (1996).
  3. Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. National Academies Press. (2011).
  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  6. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
  7. Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. 106-111 (2003).
  8. Crawford, R. J. Plastics Engineering. Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
  9. Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. University of New South Wales Press. (1996).
  10. Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. (2003).
Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter