Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

Summary

מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפיות.

Abstract

במהלך העשור האחרון, השתלת צברה עניין גובר כמו מודאליות טיפולית ראשונית או משנית עבור מגוון רחב של מחלות, הן במחקרים פרה קליניים. עם זאת, עד כה התוצאות לגבי תוצאה תפקודית ו / או התחדשות רקמות להשתלה הבאה לתאי גזע הם מגוונים למדי. באופן כללי, היתרון הקליני הוא ציין, ללא הבנה מעמיקה של המנגנון הבסיסי (ים) ^1. לכן, מאמצים רבים הובילו לפיתוח שיטות שונות הדמיה מולקולרית כדי לפקח על תא גזע השתלת במטרה הסופית כדי להעריך באופן מדויק, הישרדות הגורל ופיזיולוגיה של בתאי גזע מורכבים ו / או סביבת המיקרו שלהם. השינויים שנצפו אחד או יותר פרמטרים שנקבעו על ידי הדמיה מולקולרית עשוי להיות קשור לאפקט קליני הנצפה. בהקשר זה, מחקרים שלנו להתמקד שימוש בשילוב של הדמיה ביולומינציה (BLI), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) ואת analysi היסטולוגיתזה להעריך השתלת תא גזע.

BLI נפוץ הלא פולשני לבצע מעקב תא ולפקח הישרדות התא בזמן בעקבות השתלת ^2-7, בהתבסס על התגובה הביוכימית שבה תאים לבטא את הגן כתב בלוציפראז, מסוגלים לפלוט אינטראקציה הבאה אור עם המצע שלה (למשל D- luciferin) ^{8, 9.} MRI לעומת זאת היא טכניקה לא פולשנית אשר ישים מבחינה קלינית ¹⁰ והוא יכול לשמש כדי לאתר במדויק שתלי סלולריים עם רזולוציה גבוהה מאוד ^11-15, אם כי הרגישות שלה מאוד תלוי בניגוד שנוצר לאחר סימון התא עם חומר ניגוד MRI . לבסוף, ניתוח שלאחר המוות היסטולוגית היא השיטה של ​​בחירה כדי לאמת את תוצאות המחקר שהתקבלו עם פולשנית טכניקות עם הרזולוציה הגבוהה ביותר וברגישות. יתר על כן הקצה נקודת ניתוח היסטולוגית מאפשר לנו לבצע ניתוח מפורט פנוטיפי של תאים מורכבים ו / או הרקמה שמסביב, תואר ראשוןsed על השימוש של חלבונים הכתב ניאון ו / או תיוג התא ישיר עם נוגדנים ספציפיים.

לסיכום, אנחנו כאן חזותית להדגים את complementarities של BLI, MRI ו היסטולוגיה לפענח תא גזע שונה ו / או בסביבה הקשורים המאפיינים הבאים השתלת תא גזע של מערכת העצבים המרכזית של עכברים. כך, למשל, מח עצם שמקורם בתאי סטרומה, מהונדסים גנטית כדי לבטא משופרת גרין פלורסנט חלבון (eGFP) ו גחלילית בלוציפראז (fLuc), ומסומן בכחול ניאון מיקרון בגודל חלקיקי תחמוצת ברזל (MPIOs), יהיו מורכבים ב מערכת העצבים המרכזית של המערכת החיסונית המוסמכות עכברים והתוצאות יהיה פיקוח על ידי BLI, MRI ו היסטולוגיה (איור 1).

Protocol

1. תא הכנה

1. ניסויים יש ליזום שימוש בתרבית לשעבר ב vivo לתאי גזע אוכלוסיות מהונדסים גנטית כדי לבטא את החלבונים הכתב בלוציפראז ו eGFP. כאן אנו משתמשים בלוציפראז / eGFP-לבטא Murine מח עצם שמקורם בתאי סטרומה (BMSC-Luc/eGFP) כפי שתואר קודם לכן על ידי Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. יומיים לפני סימון התא, BMSC-Luc/eGFP תאים צלחת בצפיפות של 8 x 10 ⁵ תאים לכל בקבוק T75 התרבות ב 15 מ"ל בינוני שלם הרחבה (CEM) בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מ"ל Puromycine.
3. לאפשר לתאים לגדול במשך שעה 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
4. הוסף 5 x 10 ⁶ קרחוני כחול מיקרון בגודל תחמוצת ברזל חלקיקים (GB MPIO) לכל מ"ל בינוני מתרבות לתרבות התא גדל (סה"כ: 75 x 10 ⁶ בינוני 15 חלקיקים לכל תרבות מ"ל בבקבוק T75 התרבות).
5. דגירה של 16 שעות על מנת לאפשר ספיגת החלקיקים באמצעות אנדוציטוזה.
6. לשטוף את החלקיקים שנותרוולאפשר לתאים לגדול במשך שעה 24 נוסף כדי להשיג חלוקת התא confluency והומוגני של MPIO GB.
7. לאמת את ספיגת החלקיקים ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי ספירת היחס בין eGFP + ו GB MPIO + תאים לסכום כולל של eGFP + תאים.
8. שטפי גיגבייט MPIO, שכותרתו תאים BMSC-Luc/eGFP פעמיים עם 10 מ"ל PBS ותאי הקציר לאחר טריפסין-EDTA טיפול (5 מ"ל לכל בקבוק T75 התרבות במשך 5 דקות).
9. לשטוף את התאים נקצרו resuspend בריכוז הסופי של 133 x 10 ⁶ תאים למ"ל ב PBS.
10. שמור על תאים על הקרח עד להשתלה.

2. תא השרשה של מערכת העצבים המרכזית של עכברים

1. לטשטש את העכברים בזריקה intraperitoneal של קטמין (80 מ"ג / ק"ג) + xylazine (16 מ"ג / ק"ג) תערובת.
2. המתן 5 דקות כדי לאפשר עכברים להירדם.
3. לגלח את הראש העכבר כדי לאפשר מניפולציות סטריליים.
4. מניחים את העכבר בתוך מסגרת stereotactic.
5. Desinfectהעור רטוב בעיני העכברים כדי למנוע התייבשות.
6. לעשות חתך בקרקפת קו האמצע לחשוף את הגולגולת, לקדוח חור בגולגולת באמצעות תרגיל בר שיניים על קואורדינטות נתון: 2 מ"מ אחורי ו 2 מ"מ לרוחב גבחת.
7. המערבולת ההשעיה התא קצרות לשאוב ההשעיה תא המזרק.
8. מכניסים את המחט במזרק בעומק של 2.5 מ"מ מתחת דורה ולאפשר איזון הלחץ במשך דקה 1.
9. להזריק תרחיף תאים μl 3 (4 x 10 ⁵ תאים) בעומק של 2 מ"מ מתחת דורא במהירות של μl 0.70 / min באמצעות משאבה אוטומטית הזרקת מיקרו.
10. להמתין כ 5 דקות נוספות כדי למנוע backflow ההשעיה התא שהוחדר.
11. לאט לאט חוזר בי את המחט ולחטא את גבולות העור לפני תפירת העור.
12. להזריק 300 μl פתרון NaCl 0.9% מתחת לעור על מנת למנוע התייבשות, ומניחים את העכבר תחת מנורת חימום להתאושש מן ההרדמה. ניהול עמ 'ost הניתוח כאבים בהתאם לתקני מוסדיים.

3. ב ביולומינציה vivo

1. לטשטש את העכברים על ידי תערובת של 3% isoflurane וחמצן.
2. מניחים את העכברים Imager פוטון ולהפחית את רמת ההרדמה ל -1.5% isoflurane וחמצן.
3. להזריק 150 מ"ג D-luciferin לכל ק"ג ממשקל הגוף דרך הווריד.
4. לרכישת התמונה במשך 5 דקות באמצעות תוכנת Vision התמונה.
5. לבצע עיבוד תמונה באמצעות תוכנת M3vision. לכמת את האות הנצפית באמצעות אזורים קבועים של עניין.

4. בתחום ההדמיה vivo תהודה מגנטית

1. לטשטש את העכברים עם 3% isoflurane בתערובת של O _2: N ₂ O (03:07).
2. מניחים את עכברים עוצר של מערכת אופקית MR 9.4T ולהפחית את רמת הרדמה% 1 isoflurane בתערובת של O _2: N ₂ O (03:07).
3. להרטיב את העיניים של העכברים כדי למנוע dehydration, חבר בדיקה רקטלית כדי לפקח על טמפרטורת הגוף ולעקוב אחר קצב הנשימה על ידי הצבת חיישן מתחת לבטן העכבר.
4. לשמור על קצב הנשימה של 110 ± 10 נשימות בדקה ולשמור על חום גוף קבוע בטווח צר של 37 ± 0.5 ° C.
5. מניחים את משטח RF סליל על הראש העכבר ומיקום העכבר במרכז המגנט.
6. לרכוש סט של 10 העטרה T2 משוקלל הד ספין (SE) תמונות כדי לקבל מידע אנטומי ספציפי ו-T2 * משוקלל הדרגתיים הד (GE) תמונות כדי ללמוד התא הגירה גזע עם רזולוציה ב-מטוס של 70 מיקרומטר ^2. הגדרת פרמטרים רצף כדלקמן: זמן החזרה (TR): 500 MS זמן, הד (TE): 8 MS (רצף GE) וזמן החזרה (TR): 4200 שניה, הפעם הד (TE): 12.16 ms (SE ברצף); שדה הראייה (FOV): 18x18 מ"מ ^2, מטריקס: 256x256, 1 פרוסת מ"מ עובי 1 מ"מ ההפרדה פרוסה (פאראוויזיון 5.1 תוכנה).
7. לבצע עיבוד נתוניםבאמצעות תוכנה עמירה 4.0.

5. פוסט מורטם היסטולוגיה

1. לטשטש את העכברים מאוד עמוקות שאיפה של חמצן isofluorane (4%), (0.5 ליטר / דקה) וחנקן (1 L / min) התערובת במשך 2 דקות. להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם.
2. הסר את המוח העכבר מן הגולגולת לקבע את רקמת המוח paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 2 שעות.
3. מייבשים את רקמת המוח על ידי הנחת המוח לאחר מכן הדרגתיים שונים של סוכרוז: 2 שעות של סוכרוז 5% ב PBS, 2 שעות של סוכרוז 10% PBS, לילה סוכרוז 20% ב PBS.
4. הקפאת רקמת המוח באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן את הרקמה ב -80 ° C עד אחד בלבד.
5. סעיף המוח רקמת ב 10 חלקים עבים מיקרומטר באמצעות cryostat.
6. מסך cryosections בלא כתם כחול על הקרינה מן חלקיקים MPIO GB ו פלואורסצנטי ירוק את התאים המבטאים eGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
7. מסך בלא כתם cryosections עבורירוק / אדום רקע הקרינה של תאים דלקתיים.
8. בצע stainings immunohistochemical נוסף immunofluorescent לזהות אוכלוסיות תאים פנימיים (למשל microglia, האסטרוציטים, התאים T, ...) אינטראקציה עם שתלי סלולריים.

6. נציג תוצאות

אנחנו כאן הציג ראייה רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal מוצלח של בלוציפראז / eGFP-לבטא (גזע) אוכלוסיות תאים של מערכת העצבים המרכזית של עכברים. בתחילה, תיאר את הליך גיגבייט MPIO תיוג תוצאות תיוג היעילה ביותר של תאים BMSC-Luc/eGFP, אשר יכול בקלות להיות מאומת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א). לאחר מכן, על השתלת של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP את מערכת העצבים המרכזית של עכברים, ההישרדות של השתל הסלולר יכול להיות פיקוח על ידי in vivo BLI מבוסס על פעילות בלוציפראז (2B איור). בנוסף, איתור מדויק של תאים מורכבים יכול להיות פיקוח על ידי in vivo (איור 2 ג). לבסוף, ניתוח היסטולוגית מאפשר אימות של התוצאות שהושגו על ידי BLI ו-MRI. הישרדות יציבה אושרה על ידי ביטוי eGFP יציבה בזמן (איור 2 ד). לשם כך, colocalization של eGFP-להביע תאים עם כחול ניאון MPIO מאפשר להגדרה המדויקת של לוקליזציה ההישרדות של תאים מורכבים. בנוסף, זה תיוג ניאון כפולה של בתאי גזע מקטין את האפשרות לצפות לתוצאות חיוביות שגויות המבוססות על הקרינה רקע נוצר על ידי תאים דלקתיים ^5.

באיור 1. סקירת רצף הטיפול

1. תיוג נייד: BMSC-Luc/eGFP מסומנים עם 5 x 10 ⁶ חלקיקים גיגבייט MPIO בכל מדיום תרבות מ"ל. אחרי 16 שעות של דגירה ועל תקופת מנוחה הבאה של 24 שעות, התאים נקצרים עבורintracerebral ההשתלה.
2. השתלת תאים: GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP הם מורכבים במוח העכבר על נקודות הציון הבאות: גבחת -2 מ"מ, 2 מ"מ ימינה של קו האמצע ו - 2 מ"מ מתחת דורה.
3. In vivo BLI: עירוי לוריד להלן של 150 מ"ג D-luciferin/kg משקל הגוף, האור שנוצר נרכשה במהלך 5 דקות באמצעות Imager פוטון.
4. In vivo MRI: סט של 10 העטרה T2 משוקלל הד ספין (SE) תמונות ו-T2 * משוקלל הד שיפוע (GE) תמונות ברזולוציה של מטוס של 70 מיקרומטר ² נרכשו. פרמטרים רצף היו: זמן החזרה (TR): 500 MS זמן, הד (TE): 8 MS (רצף GE) וזמן החזרה (TR): 4200 שניה, הפעם הד (TE): 12.16 ms (רצף SE); שדה הראייה (FOV): 18x18 מ"מ ^2, מטריקס: 256x256, 1 פרוסת מ"מ עובי 1 מ"מ ההפרדה פרוסה.
5. פוסט מורטם היסטולוגיה: cryosection עבה 10μm הוקרנו eGFP להביע וכחול שכותרתו fluorescently BMSC uלשיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. איור multimodal הדמיה של שתלי בתאי גזע

1. מיקרוסקופיה immunofluorescence ישירה של קרחוני כחול (GB) MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP.
2. In vivo BLI של עכברים שהוזרק עם 4x10 ⁵ GB MPIO שכותרתו תאים BMSC-Luc/eGFP בשבוע 1 ו 2 שבוע לאחר ההשתלה. ניתוח סטטיסטי של אותות BLI שהתגלו בשבוע 1 ו - 2 בשבוע שלאחר ההשתלה. הנתונים באים לידי ביטוי כמספר הממוצע של פוטונים לשנייה לכל steradian לסנטימטר מרובע (pH / S / SR / cm ²⁾ מהתקופה זמן 5 דקות + / - סטיית התקן המחושבת מאזור קבוע עניין בעכברים מראה איתות ברור BLI במקום ההזרקה.
3. העטרה דו מימדי MRI של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP (לוח לשמאל: (i) T2 משוקלל הד ספין התמונה (ב) T2 * משוקלל הד תמונת צבע) ו-L ללא תווית BMSCמאוניברסיטת קליפורניה / eGFP (הפאנל הימני: (ג) T2 משוקלל הד ספין התמונה (ו ') T2 * משוקלל הד דימוי שיפוע) שתלי במוח העכבר.
4. ניתוח היסטולוגית של GB MPIO שכותרתו שתלים BMSC-Luc/eGFP 2 בשבוע שלאחר ההשתלה. (א) ניתוח immunofluorescence ישיר לוקליזציה של eGFP-לבטא ו GB שתלי MPIO BMSC-Luc/eGFP שכותרתו. (ב) הגדלה פירוט גבוהה של (אני). (Iii) מכתים Immunofluorescent עבור אנטיגן GFAP, המציין את התפתחותה astrocytic ב המקיף של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP. (Vi) מכתים Immunofluorescent עבור אנטיגן-1 איבא, המציין את הפלישה והסביבה של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP ידי microglia.

Discussion

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור שילוב של שלוש שיטות הדמיה משלימים (BLI, MRI ו היסטולוגיה) לאפיון מפורט של שתלים הסלולר את מערכת העצבים המרכזית של עכברים המוסמכות החיסונית. שילוב של תיוג כתב הגן של תאים, המבוססת על הנדסה גנטית עם גנים הכתב גחלילית בלוציפראז ו eGFP, ואת תיוג התא ישיר עם GB MPIO, מוביל להערכה מדויקת של שתלים בתאי גזע in vivo.

תיוג החלקיקים של BMSC, גודל החלקיקים MPIO GB (1.63μm) בשילוב עם משטח anionic (תחליפי carboxyl) מוצע לאפשר ספיגת endocytotic של חלקיקים אלה על ידי אי - phagocytic תאים ^16-18. עם זאת, יש לציין כי זמן הדגירה להשיג יעילות גבוהה תיוג הוא סוג התא תלוי. לדוגמה, תאים phagocytic (כמו מקרופאגים ותאים דנדריטיים) מסוגלים להפנים חלקיקים אלה במהירות רבה יותר (זמן הדגירה של 0.5-1 שעה) לעומת הלא phaghocytic סוגי תאים (כמו בתאי גזע BMSC או עצבית), אשר צריך זמן דגירה של 16 שעות מינימום תיוג יעיל. זה צריך להילקח בחשבון בעת ​​ביצוע תיוג תא ניסויים ויעילות של תיוג תמיד צריך לקבוע מראש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו / או ניתוח תזרים cytometric. כמו תיוג של אוכלוסיות תאים עם GB MPIOs אינו משפיע על כדאיות התא, התפשטות תאים או פנוטיפ התא ^5, השילוב של תחמוצת ברזל fluorophore של חלקיקים אלה ולכן יוצר הזדמנות פז להמחיש את שניהם על ידי הדמיה MRI אופטיות. יתר על כן, בשל תכולת ברזל גבוהה גודל החלקיקים הגדול, חלקיקים MPIO יכול לשמש תא בודד ^12,19,20 והדמיה חלקיק יחיד ²¹ על ידי בדיקת MRI. זה מעניין ביותר כשמדובר ללמוד נדידת תאים כמו תאים בודדים ניתן לצפות. עם זאת, תוכן ברזל גבוהה של שימוש GB MPIOחלקיקים יש גם חסרונות מסוימים, כאשר במטרה לשרטט את הגודל המדויק של האתר השתל על ידי בדיקת MRI. תוכן ברזל גבוהה מאוד של MPIOs לא רק יוצר inhomogeneities מגנטיים במקום השתל, אלא גם סביב השתל הסלולר, וכתוצאה מכך אומדן של נפח השתל האתר אפליה פחות מדויק בין התאים המושתלים לבין הרקמה שמסביב. כתוצאה מכך, את סוג החלקיקים, צריך תיוג תא, תלויה בתכנון המחקר. כאשר במטרה לקבוע בתאי גזע הגירה, רגישות גבוהה מאוד, ולכן ברזל גבוהה המכיל MPIOs יהיה צורך. מצד שני, כאשר מכוון לוקליזציה מדויק של תאים שתלי גזע, SPIOs קטנים יותר עם ​​תוכן ברזל נמוך יכול להיות חלופה עדיפה ^22. יתר על כן, חלקיקי ברזל ליצור ניגוד שלילי מציגה בעיה נוספת לגבי אפליה בין התאים המושתלים לבין דימום לאחר השתלת תאים. לכן הרבה מחקר הולךב כלפי שימוש סוכנים בניגוד חיוביות תיוג התא. לצד סוג החלקיקים, סוג של רצף משמש לרכישת MRI תלויה גם המטרה של המחקר. כאשר MRI משמש להתוות את השתל כדי להשיג מידע מדויק על מיקומו של השתל ואת נפח השתל, רצף T2 (ספין הד) היא חיובית כפי שהוא מספק מידע אנטומי עם דיוק גבוה. מצד שני, T2 * רצף (שיפוע הד) הוא רצף בשימוש ללמוד הגירה אפשרית של תאים מורכבים כרצף זה לוקח בחשבון את כל inhomogenities של השדה המגנטי עיבוד רגישות גבוהה יותר כלפי חומרים המשפיעים על השדה המגנטי. רצף זה הוא הכרחי כשמדובר זיהוי של כמות קטנה של תאים שאולי היגרו אל מחוץ לאזור המושתל. שימוש ברצף הצלחנו להגיע למסקנה כי תאים BMSC-Luc/eGFP לא להעביר לאחר ההשתלה striatal את מערכת העצבים המרכזית של עכברים.

בעודMRI מספק נתונים לגבי לוקליזציה השתל התא, ניתוח נוסף BLI מספק נתונים לגבי השתל התא הישרדות ^2,4,11. כל תגובה אנזימטית בין האנזים בלוציפראז ו luciferin המצע צריך נוכחות של O ₂ ו-ATP, זוהי טכניקה אמין ללמוד הישרדות התא. תאים נמקי לא להביע את האנזים בלוציפראז ולא O ₂ ו-ATP יהיה נוכח. יתר על כן, רק התאים המבטאים את האנזים בלוציפראז יכולים לזרז את התגובה, וכתוצאה מכך ייצור של אור, אשר דומה רגישות גבוהה של הטכניקה. BLI יכול להתבצע באופן כמותי בגלל כמות האור המיוצר הוא יחסי עם כמות של בלוציפראז-לבטא תאים. עם זאת, שיקולים חשובים צריכים להילקח בחשבון בעת ​​ביצוע BLI כמותית כמו גורמים אחרים מלבד הסכומים סלולריים יכולים להשפיע על רמת הביטוי של בלוציפראז או את כמות האור זוהה. לדוגמה, anesthesiרמת יכולים להשפיע על אנזים בלוציפראז ו / או זמינות luciferin ^23, גורמים שונים ותרכובות יכולים להשפיע על זמינות התשתית ו / או פעילות ספיגת ^24-26 או ^27-30 האמרגן, וכתוצאה מכך ההבדלים פלט האות. יתר על כן השימוש BLI מוגבל חיות קטנות כמו טכניקה מוגבלת חדירה לרקמות נמוכה של אור. כתוצאה מכך, כאשר במטרה לבצע BLI כמותית לעקוב הישרדות התא לאחר ההשתלה, כל הפרמטרים ואולי להשפיע על וריאציות של האות צריך להיות כל הזמן כסטנדרט ככל האפשר. לדוגמה, השתלת שתלי עומק הסלולר, רמת הרדמה המסלול ממשל / כמות המצע מנוהל לפני הרכישה BLI, גילוח נכון של עור של בעלי חיים וכו '

אם ניקח בחשבון מעל היתרונות והחסרונות המתוארים של הדמיה מולקולרית, התוצאות שהתקבלו תמיד צריך להיות מאומת על ידי ניתוח היסטולוגית. בזאת הוריולנו פנוטיפים סלולריים אינטראקציות הסלולר בין סוגי תאים שונים ניתן דמיינו עם הפוסט מורטם הרגישות הגבוהה ביותר. למרות העובדה כי טכניקה זו היא כלי האימות של בחירה, נוכחות של הקרינה רקע נוצר על ידי תאים דלקתיים סביב ו / או פלישה האתר שתל צריך להיחשב, שכן הדבר עלול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות. עם זאת, השימוש של תיוג כפול עם הגן כתב ניאון, כגון eGFP, וכן בדיקה ניאון, כגון GB MPIO, מקטין את האפשרות של מזיהוי שגוי (כלומר תאים מורכבים צריך להציג את שני fluorescences ספציפיים, מבלי להציג פלואורסצנציה הרקע באור לא רלוונטי ערוצי).

לסיכום, בעוד BLI היא טכניקה מיוחדת כדי לפקח על הישרדות התא בזמן בצורה כמותית עם רגישות גבוהה מאוד, אבל ברזולוציה נמוכה, MRI היא שיטה של ​​בחירה להתגבר על רזולוציה נמוכה שהושג עם BLI. שילוב של אלה in vivo techniques מעבד מידע מספיק לגבי הישרדות ולוקליזציה של תאים מורכבים in vivo בצורה לא פולשנית. לבסוף, אינטראקציות שוחד סלולריים עם הרקמה שמסביב ו / או תאים דלקתיים אנדוגני יכול בקלות להיות במעקב אחרי מות באמצעות היסטולוגיה. אמנם, כרגע, זו האחרונה עדיין צריכה להיעשות על ידי ניתוח היסטולוגית, האתגרים העיקריים לעתיד יהיה לשפר את הקיים in vivo שיטות מולקולריות הדמיה כדי לאפשר בזמן אמת הערכת הפרמטרים עם רזולוציה רגישות דומה, כפי שמתקבלות באמצעות היסטולוגית ניתוח.