Imagerie multimodale d'implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

Summary

Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

Abstract

Au cours de la dernière décennie, la transplantation de cellules souches a suscité un intérêt croissant en tant que modalité thérapeutique primaire ou secondaire pour une variété de maladies, à la fois dans les études précliniques et cliniques. Toutefois, à ce jour les résultats concernant les résultats fonctionnels et / ou la régénération des tissus après la transplantation de cellules souches sont très variés. En règle générale, un bénéfice clinique est observé sans une profonde compréhension du mécanisme sous-jacent (s) ^1. Par conséquent, des efforts multiples ont conduit à l'élaboration des différentes modalités d'imagerie moléculaire pour contrôler la greffe de cellules souches dans le but ultime d'évaluer avec précision la survie, le destin et la physiologie des cellules souches greffées et / ou de leur micro-environnement. Les changements observés dans un ou plusieurs paramètres déterminés par l'imagerie moléculaire pourrait être liée à l'effet observé clinique. Dans ce contexte, nos études portent sur l'utilisation combinée de l'imagerie par bioluminescence (BLI), imagerie par résonance magnétique (IRM) et histologiques analysis pour évaluer les cellules souches de greffage.

BLI est couramment utilisé pour effectuer de façon non invasive suivi de cellules et de surveiller la survie des cellules dans le temps après une transplantation ^2-7, basé sur une réaction biochimique dans laquelle les cellules exprimant le gène de la luciférase-rapporteur sont capables d'émettre de la lumière d'interaction suivant avec son substrat (par exemple D- luciférine) ^{8, 9.} IRM d'autre part est une technique non invasive qui est cliniquement applicable ¹⁰ et peut être utilisé pour localiser précisément des greffes cellulaires à très haute résolution ^11-15, même si sa sensibilité dépend fortement le contraste généré après marquage des cellules avec un agent de contraste IRM . Enfin, post-mortem analyse histologique est la méthode de choix pour valider les résultats de recherche obtenus avec des techniques non invasives avec la plus haute résolution et la sensibilité. Par ailleurs point final analyse histologique nous permet d'effectuer une analyse détaillée des phénotypique des cellules greffées et / ou les tissus environnants, based sur l'utilisation des protéines rapporteurs fluorescents et / ou d'étiquetage directe de la cellule avec des anticorps spécifiques.

En résumé, nous avons ici démontrer visuellement les complémentarités de BLI, l'IRM et l'histologie de démêler les cellules souches et différente / ou de l'environnement associée à des caractéristiques suivantes sur les cellules souches de greffage dans le SNC de la souris. A titre d'exemple, la moelle osseuse de cellules dérivées du stroma, génétiquement modifiées pour exprimer la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et la luciférase de luciole (fluctuations), et étiquetés avec le bleu fluo de taille micronique des particules d'oxyde de fer (MPIOs), seront greffés dans le SNC de souris immuno-compétentes et les résultats seront suivis par BLI, l'IRM et l'histologie (figure 1).

Protocol

1. Préparation des cellules

1. Les expériences doivent être initiée à l'aide de culture ex vivo des populations de cellules souches génétiquement modifiées pour exprimer des protéines rapporteur de la luciférase et eGFP. Ici, nous utilisons la luciférase / eGFP exprimant murins de moelle osseuse des cellules dérivées du stroma (BMSC-Luc/eGFP) tels que décrits précédemment par Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. Deux jours avant le marquage cellulaire, les cellules BMSC-Luc/eGFP plaque à une densité de 8 x 10 ⁵ cellules par flacon de culture T75 dans 15 ml d'expansion à moyen complet (CEM) supplémenté avec 1 ug / ml. Puromycine
3. Laisser les cellules à croître pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO _2.
4. Ajouter 5 x 10 ⁶ glaciaires bleus de taille micronique des particules d'oxyde de fer (GB MPIO) moyen par ml de culture à la culture cellulaire de plus en plus (total: 75 x 10 ⁶ particules par 15 ml du milieu de culture dans un flacon T75 culture).
5. Incuber pendant 16 heures pour permettre l'absorption de particules par endocytose.
6. Laver les particules restanteset permettent aux cellules de se développer pour une période supplémentaire de 24 heures pour obtenir une répartition cellulaire confluence et homogène de la MPIO Go.
7. Valider l'absorption des particules visuellement en utilisant la microscopie par fluorescence en comptant le rapport de la EGFP + et GB MPIO + de cellules à la quantité totale de la EGFP + cellules.
8. Laver les cellules Go BMSC-Luc/eGFP MPIO-étiquetés à deux reprises avec 10 ml de PBS et les cellules de récolte à la suite de trypsine-EDTA de traitement (5 ml par flacon T75 culture pendant 5 minutes).
9. Laver les cellules récoltées et remettre en suspension à une concentration finale de 133 x 10 ⁶ cellules / ml dans du PBS.
10. Gardez les cellules sur de la glace jusqu'à la transplantation.

2. L'implantation de cellules dans le SNC de souris

1. Anesthésiez souris par une injection intrapéritonéale d'une kétamine (80 mg / kg) + xylazine (16 mg / kg) mélange.
2. Attendre 5 minutes pour permettre à des souris à s'endormir.
3. Rasage de la tête de la souris pour permettre les manipulations stériles.
4. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique.
5. Désinfecter l'la peau et les yeux mouillés de la souris pour éviter la déshydratation.
6. Faire une incision du cuir chevelu ligne médiane pour exposer le crâne, et percer un trou dans le crâne à l'aide d'une perceuse fraise dentaire aux coordonnées données: 2 mm en arrière et 2 mm latéralement à Bregma.
7. Vortex de la suspension cellulaire brièvement et aspirer la suspension cellulaire dans la seringue.
8. Placez l'aiguille de seringue à une profondeur de 2,5 mm sous la dure-mère et permettre d'équilibrage de pression pendant 1 minute.
9. Injecter une suspension à 3 cellules ul (4 x 10 ⁵ cellules) à une profondeur de 2 mm sous la dure-mère et à une vitesse de 0,70 l / min en utilisant un système automatisé de micro-injection de la pompe.
10. Attendez 5 minutes supplémentaires pour empêcher le reflux de la suspension cellulaire injectée.
11. Lentement retirer l'aiguille et à désinfecter les frontières de la peau avant de suturer la peau.
12. Injecter 300 ul solution NaCl 0,9% sous-cutanée afin d'éviter la déshydratation, et placez la souris sous une lampe chauffante pour récupérer de l'anesthésie. Administrer post-opératoire analgésique en conformité avec les normes institutionnelles.

3. Dans bioluminescence in vivo

1. Anesthésier les souris par un mélange de 3% d'isoflurane et l'oxygène.
2. Placez la souris dans le Photon Imager et réduire le niveau de l'anesthésie à l'isoflurane 1,5% et de l'oxygène.
3. Injecter 150 mg D-luciférine par kg de poids corporel par voie intraveineuse.
4. Acquérir l'image pendant 5 minutes en utilisant le logiciel Vision photo.
5. Effectuer le traitement d'image en utilisant le logiciel M3vision. Quantifier le signal observé à l'aide des régions d'intérêt fixes.

4. Dans l'imagerie par résonance magnétique in vivo

1. Anesthésier les souris avec 3% d'isoflurane dans un mélange de O _2: N ₂ O (3:7).
2. Placez la souris dans le dispositif de retenue d'un système horizontal 9.4T MR et réduire le niveau de l'anesthésie à l'isoflurane 1% dans un mélange de O _2: N ₂ O (3:7).
3. Mouiller les yeux des souris afin de prévenir la déshydratationtion, attacher une sonde rectale pour surveiller la température du corps et surveiller le taux de respiration en plaçant un capteur en dessous du ventre de la souris.
4. Maintenir le taux de respiration à 110 ± 10 respirations par minute et maintenir la température corporelle constante dans une fourchette étroite de 37 ± 0,5 ° C.
5. Placer la bobine RF surface au-dessus de la tête de la souris et la position de la souris dans le milieu de l'aimant.
6. Acquérir un ensemble de 10 coronales pondérées en T2 écho de spin (SE) des images pour obtenir des informations spécifiques à l'anatomie et pondérées T2 * écho de gradient (GE) des images afin d'étudier la migration de cellules souches avec une résolution dans le plan de 70 um ^2. Définissez les paramètres de séquence comme suit: temps de répétition (TR): 500 ms, temps d'écho (TE): 8 ms (séquence GE) et temps de répétition (TR): 4200 ms, temps d'écho (TE): 12,16 ms (SE séquence); champ de vision (FOV): 18x18 mm ^2, la matrice: 256x256, une épaisseur de 1 mm et 1 tranche de séparation tranche mm (5,1 Paravision logiciel).
7. Effectuer le traitement des donnéesutilisant Amira 4,0 logiciel.

5. Post Mortem Histologie

1. Anesthésier les souris très profondément par l'inhalation de l'oxygène isofluorane (4%), (0,5 L / min) et de l'azote (1 L / min) le mélange pendant 2 minutes. Sacrifiez les souris par dislocation cervicale.
2. Retirez le cerveau de souris à partir du crâne et fixer le tissu cérébral dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 2 heures.
3. Déshydrater les tissus du cerveau en plaçant le cerveau par la suite dans différents gradients de saccharose: 2 h dans 5% de saccharose dans du PBS, 2 heures dans du saccharose à 10% dans du PBS, pendant la nuit dans du saccharose à 20% dans du PBS.
4. Congeler le tissu cérébral utilisant de l'azote liquide et stocker le tissu à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe.
5. Section du tissu cérébral dans 10 um d'épaisseur à l'aide des sections d'un cryostat.
6. Écran souillé cryosections pour la fluorescence bleue des particules MPIO Go et de la fluorescence verte à partir des cellules exprimant eGFP l'aide d'un microscope à fluorescence.
7. Écran souillé cryosections pourfluorescence de fond vert / rouge à partir de cellules inflammatoires.
8. Effectuer des colorations immunohistochimiques et plus immunofluorescence pour identifier les populations cellulaires endogènes (par exemple les microglies, les astrocytes, des cellules T, ...) qui interagissent avec des greffes cellulaires.

6. Les résultats représentatifs

Nous avons ici présenté visuellement une séquence optimisée des événements pour l'imagerie multimodale réussie de la luciférase / eGFP-populations de cellules exprimant (tige) dans le SNC de la souris. Dans un premier temps, les résultats décrits Go MPIO procédure de labellisation en matière d'étiquetage très efficace des cellules BMSC-Luc/eGFP, qui peuvent facilement être validées en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 2A). Ensuite, au moment de greffage de Go MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP dans le SNC de la souris, la survie de la greffe cellulaire peut être contrôlée par in vivo BLI basée sur l'activité luciférase (figure 2B). En outre, la localisation exacte des cellules greffées peuvent être surveillés par in vivo (figure 2C). Enfin, l'analyse histologique permet de valider les résultats obtenus par BLI et de l'IRM. La survie stable a été confirmé par une expression de l'EGFP stable dans le temps (figure 2D). Pour cela, colocalisation des cellules exprimant eGFP avec bleu fluorescent MPIO permet la détermination exacte de la localisation et la survie des cellules greffées. En outre, ce double étiquetage fluorescent des cellules souches réduit la possibilité d'observer des résultats faussement positifs basés sur la fluorescence de fond créé par les cellules inflammatoires ^5.

Figure 1. Vue d'ensemble de la séquence de traitement

1. Marquage des cellules: BMSC-Luc/eGFP sont marqués avec 5 x 10 ⁶ particules MPIO GB par ml du milieu de culture. Après 16 heures d'incubation et une période de repos qui suit de 24 h, les cellules sont récoltées pourl'implantation intracérébrale.
2. L'implantation de cellules: GB MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP sont greffés dans le cerveau de la souris aux coordonnées suivantes: bregma -2 mm, 2 mm à droite de la ligne médiane et 2 mm sous-mère.
3. In vivo BLI: Après l'administration intraveineuse de 150 mg D-luciferin/kg poids corporel, la lumière générée a été acquis pendant 5 minutes en utilisant le Photon Imager.
4. En IRM in vivo: Un ensemble de 10 coronales pondérées en T2 écho de spin (SE) et des images pondérées T2 * écho de gradient (GE) des images avec une résolution dans le plan de 70 um ont été acquis ^2. Paramètres de la séquence étaient les suivants: temps de répétition (TR): 500 ms, temps d'écho (TE): 8 ms (séquence GE) et temps de répétition (TR): 4200 ms, temps d'écho (TE): 12,16 ms (séquence SE); champ de vision (FOV): 18x18 mm ^2, la matrice: 256x256, une épaisseur de 1 mm et 1 tranche de la séparation coupe mm.
5. Post-mortem histologie: 10 microns d'épaisseur Coupe à congélation ont été criblées pour eGFP exprimer et bleu marqué par fluorescence BMSC uchanter un microscope à fluorescence.

Figure 2. Imagerie multimodale des greffes de cellules souches

1. Immunofluorescence directe des glaciaire bleu (GB) MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP.
2. In vivo BLI des souris injectées avec 4x10 ⁵ Go MPIO a marqué les cellules BMSC-Luc/eGFP à la semaine 1 et semaine 2 après l'implantation. L'analyse statistique des signaux détectés BLI à la semaine 1 et semaine 2 post-implantation. Les données sont exprimées en nombre moyen de photons par seconde et par stéradian par centimètre carré (ph / s / sr / cm ²⁾ à partir d'une période de temps de 5 minutes + / - erreur-type calculée à partir d'une région d'intérêt fixe chez la souris montrant un signal clair BLI au niveau du site d'injection.
3. Coronale à deux dimensions IRM de GB MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP (panneau de gauche: (i) en pondération T2 écho de spin et (ii) T2 *-image pondérée en écho de gradient) et non marqué BMSC-Luc / eGFP (panneau de droite: (iii) en pondération T2 écho de spin et (vi) T2 *-image pondérée en écho de gradient) des greffes dans le cerveau de la souris.
4. L'analyse histologique de GB MPIO étiquetés implants BMSC-Luc/eGFP à la semaine 2 post-implantation. (I) l'analyse immunofluorescence directe pour la localisation de eGFP exprimant et GB greffes MPIO BMSC-Luc/eGFP étiquetés. (Ii) les informations à fort grossissement de (i). (Iii) La coloration par immunofluorescence pour antigène GFAP, indiquant le développement de tissu cicatriciel astrocytaire dans les environs de Go MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP. (Vi) La coloration par immunofluorescence pour Iba-1 antigène, ce qui indique l'invasion et l'entourant de GB MPIO marqué par la microglie BMSC-Luc/eGFP.

Discussion

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole optimisé pour la combinaison de trois modalités d'imagerie complémentaires (BLI, l'IRM et l'histologie) pour la caractérisation détaillée des implants cellulaires dans le SNC de la souris immunitaires compétentes. Une combinaison de l'étiquetage gène rapporteur de cellules, basée sur la modification génétique avec des gènes rapporteurs luciférase de luciole et eGFP, et un étiquetage directe de la cellule avec Go MPIO, conduit à une évaluation précise des greffes de cellules souches in vivo.

Pour l'étiquetage des particules de BMSC, la taille des particules Go MPIO (1.63μm) en combinaison avec la surface anionique (substituts carboxyle) est proposé pour faciliter l'absorption de ces particules endocytose par les cellules phagocytaires ^non-16-18. Toutefois, il convient de mentionner que le temps d'incubation pour obtenir une efficacité élevée est l'étiquetage type de cellule dépendante. Par exemple, les cellules phagocytaires (comme les macrophages et cellules dendritiques) sont capables d'internaliser ces particules plus rapidement (temps d'incubation de 0,5 à 1 h) par rapport à des types cellulaires non-phaghocytic (comme des cellules souches BMSC ou neural), qui ont besoin d'un temps d'incubation de 16 heures minimum pour l'étiquetage efficace. Cela doit être pris en compte lors de la réalisation d'expériences en matière d'étiquetage de cellules et de l'efficacité de l'étiquetage doit toujours être déterminé à l'avance en utilisant la microscopie à fluorescence et / ou l'analyse par cytométrie en flux. Que l'étiquetage des populations de cellules avec GB MPIOs n'influence pas la viabilité cellulaire, la prolifération cellulaire ou ⁵ phénotype cellulaire, la combinaison de l'oxyde de fer et un fluorophore dans ces particules crée donc le moment idéal de les visualiser à la fois par imagerie IRM et optiques. En outre, en raison de la forte teneur en fer et la taille des particules de grande, les particules MPIO peut être utilisé pour seule cellule ^12,19,20 et l'imagerie de particules unique ²¹ par l'IRM. C'est extrêmement intéressant quand il s'agit d'étudier la migration cellulaire forme de cellules isolées peuvent être observées. Toutefois, la forte teneur en fer de l'utiliser MPIO Goparticules a aussi certains inconvénients lorsque l'on cherche à délimiter la taille exacte du site du greffon par l'IRM. La teneur en fer très élevée de MPIOs non seulement crée des inhomogénéités magnétiques au site d'implantation, mais aussi dans les environs de l'implant cellulaire, entraînant une surestimation du volume du site d'implantation et une discrimination précise entre les moins cellules implantées et les tissus environnants. Par conséquent, le type de particule, nécessaire pour le marquage cellulaire, dépendra de la conception de l'étude. Lorsque le but de déterminer la migration de cellules souches, une très grande sensibilité et donc de fer à haute teneur en MPIOs seront nécessaires. D'autre part, lorsque l'on vise pour la localisation précise des greffes de cellules souches, les petites SPIOs avec une faible teneur en fer pourrait être une alternative préférable ^22. En outre, les particules de fer de générer contraste négatif introduisant un autre problème concernant la discrimination entre les cellules implantées et des saignements cellule après la greffe. Par conséquent beaucoup de recherches qui se passeen direction de l'utilisation d'agents de contraste positif pour l'étiquetage de cellules. Suivant le type de particules, le type de séquence utilisée pour l'acquisition IRM dépend aussi de l'objectif de l'étude. Lorsque l'IRM est utilisée pour délimiter l'implant pour obtenir des informations précises sur l'emplacement de l'implant et le volume de l'implant, la séquence T2 (écho de spin) est favorable car elle fournit des informations anatomiques avec une grande précision. D'autre part, la séquence T2 * (écho de gradient) est une séquence utilisée pour étudier la migration éventuelle de cellules greffées que cette séquence prend en compte tous les inhomogénéités du champ magnétique de rendre une plus grande sensibilité envers les composés qui influent sur le champ magnétique. Cette séquence est absolument nécessaire quand il s'agit de la détection d'une petite quantité de cellules qui peuvent avoir migré sur la région implantée. En utilisant cette séquence, nous avons pu conclure que les cellules BMSC-Luc/eGFP ne migrent pas après l'implantation du striatum dans le SNC de la souris.

Tandis queL'IRM fournit des données concernant la localisation implantation de cellules, une analyse supplémentaire des BLI fournit des données sur la survie des implants de cellules ^2,4,11. Comme la réaction enzymatique entre l'enzyme luciférase et la luciférine substrat nécessite la présence d'O ₂ et de l'ATP, il s'agit d'une technique fiable pour étudier la survie des cellules. Les cellules nécrotiques ne sera pas exprimer l'enzyme luciférase et pas O ₂ et de l'ATP seront présents. En outre, seules les cellules exprimant l'enzyme luciférase sont capables de catalyser la réaction, conduisant à la production de lumière, qui ressemble à la sensibilité de la technique. BLI peut être effectuée d'une manière quantitative parce que la quantité de lumière produite est proportionnelle à la quantité de cellules exprimant la luciférase. Cependant, des considérations importantes doivent être prises en compte lors de l'exécution BLI quantitativement que plusieurs facteurs autres que les montants de cellules peuvent influencer le niveau d'expression de la luciférase ou la quantité de lumière détectée. Par exemple, les anesthésiologistesun niveau peut influencer l'enzyme luciférase et / ou la disponibilité luciférine ^23, facteurs différents et des composés peuvent influencer la disponibilité substrat et / ou l'activité de promoteur ou absorption ^{24-26 27-30,} conduisant à des différences dans le signal de sortie. En outre l'utilisation de BLI est limitée à de petits animaux comme la technique est limitée à la pénétration tissulaire de la lumière faible. Par conséquent, lorsque l'objectif est d'effectuer BLI quantitative pour assurer le suivi la survie des cellules après la transplantation, tous les paramètres influençant les variations de signal éventuellement besoin d'être gardé aussi standard que possible. Par exemple, la profondeur d'implantation des greffes cellulaires, le niveau de l'anesthésie et la voie d'administration / quantité de substrat administré avant l'acquisition de BLI, le rasage de la bonne peau de l'animal, etc

Tenant compte de ce qui précède avantages et les inconvénients décrits de l'imagerie moléculaire, les résultats obtenus doivent toujours être validé par une analyse histologique. Par la présente varionous phénotypes cellulaires et des interactions cellulaires entre différents types de cellules peuvent être visualisées avec post mortem sensibilité la plus élevée. Malgré le fait que cette technique est l'outil de validation de choix, la présence de la fluorescence de fond créé par les cellules inflammatoires entourant et / ou d'envahir le site du greffon doit être considérée, car cela pourrait conduire à des résultats faussement positifs. Cependant, l'utilisation d'un double étiquetage avec un gène rapporteur fluorescent, comme eGFP, et une sonde fluorescente, comme Go MPIO, réduit la possibilité d'une identification erronée (c.-à-cellules greffées doivent afficher à la fois fluorescences spécifiques, sans afficher la fluorescence de fond à la lumière hors de propos canaux).

En résumé, tout en BLI est une technique unique pour surveiller la survie des cellules dans le temps d'une manière quantitative avec une très grande sensibilité, mais en basse résolution, l'IRM est la technique de choix pour surmonter la faible résolution obtenues avec BLI. Combinaison de ceux-ci in vivo techniquementques rend suffisamment d'informations concernant la survie et la localisation des cellules greffées in vivo d'une manière non-invasive. Enfin, les interactions cellulaires greffés avec des tissus environnants et / ou endogènes des cellules inflammatoires peuvent être facilement surveillés post mortem en utilisant l'histologie. Bien que, pour le moment, ce dernier doit encore être fait par l'analyse histologique, les principaux défis pour l'avenir sera d'améliorer les modalités en vigueur dans l'imagerie moléculaire in vivo pour permettre l'évaluation en temps réel des paramètres de la résolution et la sensibilité similaire obtenue à l'aide l'analyse histologique.