Summary
यह लेख कृंतक मस्तिष्क में सेलुलर grafts के का उपयोग करने के बहुविध इमेजिंग के लिए घटनाओं की एक अनुकूलित अनुक्रम का वर्णन: (i) vivo में bioluminescence और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में, और (ii) पोस्टमार्टम ऊतकीय विश्लेषण. एक ही जानवर पर इन इमेजिंग रूपात्मकता के संयोजन उच्च संकल्प, संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ सेलुलर भ्रष्टाचार के मूल्यांकन की अनुमति देता है.
Protocol
1. सेल तैयार
- प्रयोगों पूर्व vivo सुसंस्कृत स्टेम सेल आनुवंशिक luciferase और EGFP संवाददाता प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर आबादी का उपयोग शुरू किया जाना चाहिए. यहाँ हम / luciferase EGFP व्यक्त murine व्युत्पन्न अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं (BMSC-Luc/eGFP) के रूप में पहले से Bergwerf एट अल. 2, 5 के द्वारा वर्णित का उपयोग करें.
- सेल, 15 मिलीलीटर पूरा विस्तार मध्यम (यूके) 1 μg / Puromycine मिलीलीटर के साथ पूरक में 8 एक्स 5 10 T75 संस्कृति फ्लास्क प्रति कोशिकाओं के घनत्व पर लेबलिंग प्लेट BMSC-Luc/eGFP कोशिकाओं से दो दिन पहले.
- कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 37 पर विकसित करने के लिए अनुमति दें डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- 5 जोड़ें x 10 6 हिमनदों ब्लू माइक्रोन आकार के लोहे के आक्साइड (जीबी MPIO) प्रति मिलीलीटर संस्कृति बढ़ती सेल संस्कृति माध्यम कणों (कुल: 75 x 10 T75 संस्कृति फ्लास्क में 6 15 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम के प्रति कण).
- 16 घंटा के लिए सेते हैं endocytosis के माध्यम से कण तेज की अनुमति है.
- दूर शेष कणों धोऔर कोशिकाओं एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए विकसित करने के लिए सेल जीबी MPIO confluency और सजातीय वितरण प्राप्त करने की अनुमति देते हैं.
- कण तेज नेत्रहीन EGFP + कोशिकाओं की कुल राशि के लिए EGFP + और तक जीबी MPIO + कोशिकाओं का अनुपात की गणना के द्वारा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग मान्य.
- धो जीबी MPIO लेबल BMSC-Luc/eGFP कोशिकाओं को दो बार 10 मिली और पीबीएस trypsin - EDTA के इलाज (T75 संस्कृति फ्लास्क प्रति 5 मिनट के लिए 5 मिलीग्राम) बाद फसल कोशिकाओं के साथ.
- 133 x 6 कोशिकाओं 10 / पीबीएस में मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में काटा कोशिकाओं और resuspend धो लें.
- कोशिकाओं प्रत्यारोपण जब तक बर्फ पर रखें.
2. सेल चूहे से CNS में आरोपण
- Ketamine की intraperitoneal इंजेक्शन (80 मिलीग्राम / किग्रा) मिश्रण + xylazine (16 मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा चूहों बेहोश करना.
- 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए चूहों सो गिर करने के लिए अनुमति देते हैं.
- माउस सिर दाढ़ी बनाने को बाँझ जोड़तोड़ के लिए अनुमति.
- माउस एक stereotactic फ्रेम में रखें.
- Desinfectत्वचा और चूहों की आंखों निर्जलीकरण को रोकने के लिए गीला.
- Midline खोपड़ी खोपड़ी बेनकाब चीरा, और दिया निर्देशांक में एक दंत ड्रिल गड़गड़ाहट का उपयोग खोपड़ी में एक छेद ड्रिल: 2 पीछे मिमी और 2 मिमी शीर्षस्थान के लिए पार्श्व.
- सेल निलंबन संक्षिप्त भंवर और सिरिंज में सेल निलंबन महाप्राण (व्यंजन).
- ड्यूरा के तहत 2.5 मिमी की गहराई में सिरिंज सुई प्लेस और 1 मिनट के लिए दबाव संतुलन के लिए अनुमति देते हैं.
- ड्यूरा के तहत 2 मिमी की गहराई में और 0.70 μl / मिनट की गति से एक 3 μl सेल निलंबन (4 एक्स 5 10 कोशिकाओं) एक स्वचालित सूक्ष्म इंजेक्शन पंप का उपयोग कर इंजेक्षन.
- एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए इंजेक्शन सेल निलंबन की backflow को रोकने के लिए.
- धीरे धीरे वापस लेना सुई और त्वचा suturing से पहले त्वचा सीमाओं कीटाणुरहित.
- 300 μl 0.9% NaCl समाधान subcutaneously को इंजेक्षन क्रम में निर्जलीकरण को रोकने के लिए, और एक हीटिंग दीपक संज्ञाहरण से उबरने के अंतर्गत माउस जगह है. पी wh? Ngongoसंस्थागत मानकों के अनुसार. ost को - ऑपरेटिव एनाल्जेसिक.
3. Vivo bioluminescence में
- 3 isoflurane और ऑक्सीजन का एक मिश्रण द्वारा चूहों बेहोश करना.
- Imager के फोटॉन चूहों में रखें और 1.5 isoflurane और ऑक्सीजन के लिए संज्ञाहरण के स्तर को कम.
- 150 डी luciferin मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन के नसों इंजेक्षन.
- 5 मिनट के लिए फोटो विजन सॉफ्टवेयर का उपयोग छवि मोल.
- M3vision सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि प्रसंस्करण प्रदर्शन करते हैं. मनाया संकेत हित के निश्चित क्षेत्रों का उपयोग यों.
4. Vivo चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में
- एन ओ 2 (03:07): 3% 2 हे का एक मिश्रण में isoflurane के साथ चूहों बेहोश करना.
- एक क्षैतिज 9.4T एमआर प्रणाली की restrainer में चूहों प्लेस और संज्ञाहरण स्तर 1% 2 हे का एक मिश्रण में isoflurane कम: एन ओ 2 (3:07).
- Dehydra रोकने के चूहों की आंखों गीलेtion, माउस पेट के नीचे एक सेंसर रखकर एक गुदा जांच करने के लिए शरीर के तापमान पर नजर रखने और साँस लेने की दर पर नज़र रखने के लिए देते हैं.
- 110 ± प्रति मिनट 10 साँस में साँस लेने की दर बनाए रखने और 37 0.5 ± ° सी. के एक संकीर्ण सीमा के भीतर शरीर के तापमान को स्थिर रखने के लिए
- सतह आरएफ तार माउस सिर और चुंबक के बीच में माउस की स्थिति के शीर्ष पर रखें.
- मोल 10 राज्याभिषेक टी 2 भारित स्पिन गूंज (एसई) के लिए विशिष्ट संरचनात्मक जानकारी और टी 2 * - भारित ढाल गूंज छवियाँ (जीई) प्राप्त करने के क्रम में 70 2 माइक्रोन के एक विमान में संकल्प के साथ स्टेम सेल प्रवास के अध्ययन छवियों का एक सेट. अनुक्रम पैरामीटर सेट के रूप में निम्नानुसार है: पुनरावृत्ति समय (टी.आर.): 500 MS, गूंज समय (ते): 8 (जीई अनुक्रम) एमएस और पुनरावृत्ति समय (टी.आर.): 4200 MS, गूंज समय (ते): 12.16 एमएस (एसई अनुक्रम); 18x18 मिमी 2, मैट्रिक्स: 256x256, 1 मिमी टुकड़ा मोटाई और 1 मिमी टुकड़ा जुदाई (Paravision 5.1 सॉफ्टवेयर) (FOV) देखने के क्षेत्र.
- डाटा प्रोसेसिंग प्रदर्शनअमीरा 4.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.
5. डाक पोस्टमार्टम प्रोटोकॉल
- चूहों isofluorane (4%), (0.5 एल / मिनट) ऑक्सीजन और नाइट्रोजन (1 एल / मिनट) 2 मिनट के लिए मिश्रण का साँस लेना द्वारा बहुत गहरा बेहोश करना. गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था से चूहों बलिदान.
- माउस मस्तिष्क खोपड़ी से निकालें और मस्तिष्क के ऊतकों, पीबीएस में 2 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde की fixate.
- 2 घंटा पीबीएस में 10% sucrose के, पीबीएस में 20% sucrose में रात भर में PBS, 2 घंटा में 5% sucrose में: मस्तिष्क बाद में sucrose के अलग gradients में रखने से मस्तिष्क के ऊतकों निर्जलीकरण.
- मस्तिष्क द्रव नाइट्रोजन का उपयोग ऊतक रुक और -80 डिग्री सेल्सियस सेक्शनिंग जब तक ऊतक की दुकान.
- धारा 10 माइक्रोन मोटी वर्गों एक cryostat का उपयोग करने में मस्तिष्क के ऊतकों.
- जीबी MPIO कणों और EGFP व्यक्त एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कोशिकाओं से हरी प्रतिदीप्ति से नीले रंग प्रतिदीप्ति के लिए स्क्रीन cryosections बेदाग.
- स्क्रीन के लिए cryosections बेदागभड़काऊ कोशिकाओं से हरी / लाल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति.
- के अंतर्जात सेल (microglia जैसे, astrocytes, टी कोशिकाओं, ...) आबादी सेलुलर grafts के साथ बातचीत की पहचान और आगे immunohistochemical और immunofluorescent stainings के प्रदर्शन करना.
6. प्रतिनिधि परिणाम
हम यहाँ नेत्रहीन luciferase / EGFP-व्यक्त (स्टेम) चूहों के CNS में सेल आबादी के सफल बहुविध इमेजिंग के लिए घटनाओं के एक अनुकूलित दृश्य प्रस्तुत किया. पहली बार में वर्णित जीबी BMSC-Luc/eGFP कोशिकाओं है, जो आसानी से मान्य किया जा सकता है की अत्यधिक कुशल लेबलिंग में MPIO लेबलिंग प्रक्रिया परिणाम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (2A चित्रा) का उपयोग कर. आगे, जीबी MPIO की कलम बांधने का काम पर चूहों के CNS में BMSC-Luc/eGFP लेबल, सेलुलर भ्रष्टाचार के अस्तित्व के आधार पर luciferase गतिविधि (चित्रा 2B) vivo में BLI में द्वारा नजर रखी जा सकता है. इसके अतिरिक्त, grafted कोशिकाओं के सटीक स्थानीयकरण vivo में द्वारा नजर रखी जा सकती है (चित्रा 2C) की लौह सामग्री पर आधारित है. अंत में, ऊतकीय विश्लेषण है BLI और एमआरआई द्वारा प्राप्त परिणामों के सत्यापन की अनुमति देता है. स्थिर अस्तित्व के समय में एक स्थिर EGFP अभिव्यक्ति (चित्रा 2 डी) के द्वारा पुष्टि की गई. इस के लिए, की colocalization EGFP नीला फ्लोरोसेंट MPIO साथ कोशिकाओं व्यक्त स्थानीयकरण और grafted कोशिकाओं के अस्तित्व का सही निर्धारण के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, स्टेम सेल के इस दोहरी फ्लोरोसेंट लेबलिंग झूठी सकारात्मक पृष्ठभूमि भड़काऊ 5 कोशिकाओं द्वारा बनाया प्रतिदीप्ति पर आधारित परिणामों का निरीक्षण करने की संभावना को कम कर देता है.
चित्रा 1 से निपटने के अनुक्रम का अवलोकन.
- सेल लेबलिंग BMSC-Luc/eGFP 5 एक्स 10 मिलीलीटर संस्कृति मध्यम प्रति 6 जीबी MPIO कणों के साथ लेबल रहे हैं. ऊष्मायन 16 घंटा और 24 घंटे की एक के बाद बाकी अवधि के बाद, कोशिकाओं के लिए harvested रहे हैंintracerebral आरोपण.
- सेल आरोपण: जीबी MPIO लेबल BMSC-Luc/eGFP माउस मस्तिष्क में निम्नलिखित निर्देशांक पर grafted हैं: शीर्षस्थान -2 मिमी, 2 midline और ड्यूरा के तहत 2 मिमी से एक मिमी सही है.
- Vivo में BLI में: 150 मिलीग्राम D-luciferin/kg शरीर के वजन के बाद नसों में प्रशासन, उत्पन्न प्रकाश 5 मिनट फोटॉन Imager का उपयोग के दौरान अधिग्रहण कर लिया था.
- Vivo में एमआरआई में: 10 राज्याभिषेक टी 2 भारित स्पिन गूंज (एसई) और 70 2 माइक्रोन में विमान का एक संकल्प के साथ छवियों टी 2 * - भारित ढाल गूंज छवियाँ (जीई) का एक सेट प्राप्त कर लिया गया. अनुक्रम मापदंडों थे के रूप में निम्नानुसार है: पुनरावृत्ति समय (टी.आर.): एमएस 500, गूंज समय (ते): 8 (जीई अनुक्रम) एमएस और पुनरावृत्ति समय (टी.आर.): 4200 MS, गूंज समय (ते): 12.16 एमएस (एसई अनुक्रम); 18x18 मिमी 2, मैट्रिक्स: 256x256, 1 मिमी टुकड़ा मोटाई और 1 मिमी टुकड़ा जुदाई (FOV) देखने के क्षेत्र.
- पोस्टमार्टम ऊतक विज्ञान: 10μm मोटी cryosection व्यक्त EGFP और नीले fluorescently लेबल BMSC यू के लिए जांच की गईएक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन गाना.
आंकड़ा 2. स्टेम सेल grafts के मल्टीमॉडल इमेजिंग
- हिमनदों नीला MPIO (जीबी) का प्रत्यक्ष immunofluorescence माइक्रोस्कोपी BMSC-Luc/eGFP लेबल.
- 5 4x10 साथ इंजेक्शन चूहों के vivo BLI में जीबी MPIO 1 सप्ताह और आरोपण के बाद 2 सप्ताह में BMSC-Luc/eGFP कोशिकाओं लेबल. 1 सप्ताह और 2 आरोपण के बाद सप्ताह में पता चला BLI संकेतों के सांख्यिकीय विश्लेषण. डेटा वर्ग सेंटीमीटर प्रति एक 5 मिनट की समय अवधि से प्रति सेकंड steradian प्रति photons की औसत संख्या (पीएच है / / / sr 2 सेमी) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं + / - मानक त्रुटि एक स्पष्ट BLI संकेत दिखा चूहों में ब्याज की एक निश्चित क्षेत्र से गणना इंजेक्शन स्थल पर.
- और unlabeled BMSC एल: कोरोनल दो आयामी जीबी MPIO की एमआरआई ((i) टी 2 भारित स्पिन गूंज छवि और (ii) टी 2 * ढाल भारित गूंज छवि के बाईं पैनल) BMSC-Luc/eGFP लेबलUC / EGFP (सही पैनल: (iii) टी 2 भारित स्पिन गूंज छवि और (vi) टी 2 * ढाल भारित गूंज छवि) माउस मस्तिष्क में grafts के.
- जीबी MPIO के histological विश्लेषण पर 2 सप्ताह के बाद आरोपण BMSC-Luc/eGFP प्रत्यारोपण लेबल. (मैं) EGFP व्यक्त जीबी और MPIO लेबल BMSC-Luc/eGFP grafts के स्थानीयकरण के लिए प्रत्यक्ष immunofluorescence विश्लेषण. (Ii) उच्च वृद्धि का विस्तार (मैं). (Iii) प्रतिजन लिए GFAP Immunofluorescent धुंधला, जीबी MPIO के आसपास में astrocytic निशान ऊतक के विकास का संकेत BMSC-Luc/eGFP लेबल. (Vi) मोबाइल-1 प्रतिजन के लिए Immunofluorescent धुंधला, आक्रमण का संकेत है और जीबी MPIO के आसपास microglia द्वारा BMSC-Luc/eGFP लेबल है.
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Discussion
इस रिपोर्ट में, हम CNS में प्रतिरक्षा सक्षम चूहों के सेलुलर प्रत्यारोपण की विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए तीन पूरक इमेजिंग रूपात्मकता के संयोजन (BLI, एमआरआई और ऊतक विज्ञान) के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन. संवाददाता कोशिकाओं के जीन लेबलिंग, संवाददाता जुगनू luciferase और EGFP जीन, और जीबी MPIO के साथ एक सीधा सेल लेबलिंग के साथ आनुवंशिक संशोधन के आधार पर, का एक संयोजन vivo में स्टेम सेल grafts के सही आकलन करने के लिए होता है.
कण लेबलिंग BMSC के लिए, anionic सतह (carboxyl के विकल्प) के साथ संयोजन में जीबी MPIO कण आकार (1.63μm) गैर phagocytic कोशिकाओं 16-18 के द्वारा इन कणों endocytotic तेज की सुविधा के लिए सुझाव दिया है. हालांकि, यह उल्लेख किया जा सकता है कि ऊष्मायन उच्च लेबलिंग दक्षता प्राप्त करने के समय सेल प्रकार निर्भर है की जरूरत है. उदाहरण के लिए, phagocytic कोशिकाओं (मेक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं की तरह) इन कणों को भली और अधिक तेजी से कर रहे हैं (के 0.5 ऊष्मायन समय - 1 घंटा) के रूप में गैर phaghocytic सेल (BMSC या तंत्रिका स्टेम सेल की तरह) प्रकार है, जो कम से कम 16 घंटे के एक कुशल लेबलिंग के लिए ऊष्मायन समय की जरूरत है की तुलना में. इस को ध्यान में रखा जा सकता है, जबकि सेल लेबलिंग प्रयोगों और लेबलिंग की दक्षता का प्रदर्शन हमेशा अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और / या प्रवाह cytometric विश्लेषण का उपयोग करने की जरूरत है. जीबी MPIOs के साथ सेल आबादी की लेबलिंग सेल व्यवहार्यता, सेल प्रसार या सेल phenotype के 5 प्रभावित नहीं करता, लोहा और इन कणों में एक fluorophore ऑक्साइड के संयोजन इसलिए उन्हें दोनों एमआरआई और ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा कल्पना के लिए एक आदर्श अवसर बनाता है. इसके अलावा, उच्च लौह सामग्री और बड़े कण आकार के कारण, MPIO कणों एमआरआई द्वारा एकल में 12,19,20 सेल और एक कण इमेजिंग 21 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह बेहद दिलचस्प है जब यह सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए एकल कक्षों के रूप में देखा जा सकता है आता है. हालांकि, उच्च लौह सामग्री में प्रयुक्त जीबी MPIOकण भी कुछ नुकसान जब एमआरआई द्वारा भ्रष्टाचार साइट के सटीक आकार चित्रित करना लक्ष्य है. बहुत उच्च MPIOs की लौह सामग्री प्रत्यारोपण स्थल पर न केवल चुंबकीय inhomogeneities बनाता है, लेकिन यह भी सेलुलर प्रत्यारोपण के आसपास में, प्रत्यारोपण साइट मात्रा और प्रत्यारोपित कोशिकाओं और आसपास के ऊतकों के बीच एक कम सटीक भेदभाव के एक overestimation में जिसके परिणामस्वरूप. नतीजतन, कण के प्रकार, सेल लेबलिंग के लिए आवश्यक है, अध्ययन डिजाइन पर निर्भर करेगा. जब स्टेम सेल प्रवास, एक बहुत ही उच्च संवेदनशीलता और इस प्रकार उच्च लौह युक्त MPIOs की जरूरत होगी निर्धारित करने के लिए लक्ष्य. दूसरी ओर, जब एक कम लौह सामग्री के साथ स्टेम सेल grafts के छोटे SPIOs की सटीक स्थानीयकरण के लिए लक्ष्य एक बेहतर 22 विकल्प हो सकता है. इसके अलावा, लोहे के कणों को नकारात्मक एक और समस्या के विषय में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के बीच भेदभाव और खून बह रहा है के बाद कलम बांधने का काम सेल शुरू विपरीत उत्पन्न करते हैं. इसलिए अनुसंधान के एक बहुत कुछ जा रहा हैपर सेल लेबलिंग के लिए सकारात्मक विपरीत एजेंटों के उपयोग की दिशा में. अगले कण प्रकार, अनुक्रम के प्रकार की एमआरआई अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया भी अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है. जब एमआरआई प्रत्यारोपण चित्रित करना प्रत्यारोपण के स्थान और प्रत्यारोपण की मात्रा, टी 2 अनुक्रम पर सही जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है (स्पिन गूंज) अनुकूल है के रूप में यह उच्च सटीकता के साथ संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है. दूसरी ओर, टी 2 * अनुक्रम (ढाल गूंज) एक अनुक्रम इस अनुक्रम के रूप में खाते में चुंबकीय क्षेत्र के चुंबकीय क्षेत्र को प्रभावित यौगिकों की दिशा में एक उच्च संवेदनशीलता प्रतिपादन सभी inhomogenities लेता grafted कोशिकाओं के संभावित प्रवास अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया है. इस क्रम बिल्कुल आवश्यक है जब यह कोशिकाओं है कि प्रत्यारोपित क्षेत्र के बाहर चले गए हो सकता है की एक छोटी राशि का पता लगाने के लिए आता है. इस दृश्य का उपयोग कर हम निष्कर्ष है कि BMSC-Luc/eGFP कोशिकाओं striatal आरोपण के बाद चूहों के CNS में उत्प्रवासित नहीं कर रहे थे.
जबएमआरआई सेल प्रत्यारोपण स्थानीयकरण के बारे में डेटा प्रदान करता है, अतिरिक्त BLI विश्लेषण सेल प्रत्यारोपण 2,4,11 अस्तित्व के बारे में डेटा प्रदान करता है. के रूप में luciferase एंजाइम और सब्सट्रेट luciferin के बीच enzymatic प्रतिक्रिया 2 हे और एटीपी की उपस्थिति की जरूरत है, यह सेल अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है. परिगलित कोशिकाओं luciferase एंजाइम और कोई 2 हे व्यक्त नहीं और एटीपी उपस्थित होना होगा. इसके अलावा, केवल luciferase एंजाइम व्यक्त कोशिकाओं की प्रतिक्रिया उत्प्रेरित, प्रकाश है, जो तकनीक की उच्च संवेदनशीलता जैसा दिखता है के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप के लिए कर रहे हैं. BLI एक मात्रात्मक तरीके में किया जा सकता है क्योंकि उत्पादन प्रकाश की राशि luciferase व्यक्त कोशिकाओं की राशि के साथ आनुपातिक है. हालांकि, महत्वपूर्ण विचार को ध्यान में रखा जा सकता है जबकि BLI सेल मात्रा की तुलना में कई अन्य कारकों luciferase अभिव्यक्ति के स्तर या पता चला प्रकाश की मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में मात्रात्मक प्रदर्शन की जरूरत है. उदाहरण के लिए anesthesi,एक स्तर luciferase एंजाइम और / या luciferin 23 उपलब्धता को प्रभावित करने के लिए, विभिन्न कारकों और यौगिकों सब्सट्रेट उपलब्धता और / या 24-26 या प्रमोटर तेज 27-30 गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप संकेत उत्पादन में मतभेद में कर सकते हैं. इसके अलावा BLI का उपयोग छोटे जानवरों के लिए सीमित है तकनीक के रूप में प्रकाश की कम ऊतक प्रवेश प्रतिबंधित है. नतीजतन, जब मात्रात्मक BLI प्रदर्शन के प्रत्यारोपण के बाद सेल अस्तित्व का पालन करने के लिए, सभी मापदंडों संभवतः संकेत विविधताओं को प्रभावित करने के लिए लक्ष्य संभव के रूप में मानक के रूप में रखा जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, सेलुलर grafts, संज्ञाहरण के स्तर और प्रशासन / मार्ग BLI अधिग्रहण से पहले प्रशासित सब्सट्रेट की राशि, पशुओं की त्वचा की उचित हजामत बनाने का काम, आदि का आरोपण गहराई
आण्विक इमेजिंग वर्णित फायदे और नुकसान से ऊपर खाते में ले रहा है, प्राप्त परिणामों को हमेशा के लिए ऊतकीय विश्लेषण से मान्य होना चाहिए. इसके द्वारा varioहमें सेलुलर phenotypes और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत सेलुलर उच्चतम संवेदनशीलता पोस्टमार्टम के साथ देखे जा सकते हैं. तथ्य यह है कि इस तकनीक को पसंद के सत्यापन उपकरण, पृष्ठभूमि भड़काऊ कोशिकाओं के आसपास और / या भ्रष्टाचार साइट पर हमला करने के लिए माना जाता है, के रूप में यह झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की जरूरत है के द्वारा बनाई गई प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के बावजूद. हालांकि, EGFP के रूप में एक फ्लोरोसेंट संवाददाता जीन, और एक फ्लोरोसेंट जांच, जीबी MPIO के रूप में, के साथ एक दोहरी लेबलिंग का उपयोग misidentification (यानी grafted कोशिकाओं दोनों विशिष्ट fluorescences के अप्रासंगिक प्रकाश में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदर्शित किए बिना प्रदर्शित करना चाहिए की संभावना को कम कर देता है ) चैनल.
सारांश, जबकि BLI बहुत ही उच्च संवेदनशीलता लेकिन कम संकल्प के साथ एक मात्रात्मक तरीके में समय में सेल अस्तित्व पर नजर रखने के लिए एक अनूठा तकनीक है, एमआरआई पसंद BLI साथ प्राप्त करने के लिए कम संकल्प पर काबू पाने की तकनीक है. इनमें से vivo में तकनीक में संयोजनसवाल पर्याप्त अस्तित्व और एक गैर आक्रामक तरीके से grafted कोशिकाओं के vivo में स्थानीयकरण के बारे में जानकारी renders. अंत में, आसपास के ऊतकों और / या अंतर्जात भड़काऊ कोशिकाओं के साथ सेलुलर भ्रष्टाचार बातचीत को आसानी से पोस्टमार्टम नजर रखी जा सकता है ऊतक विज्ञान का उपयोग कर. हालांकि, इस समय, बाद अभी भी लिए ऊतकीय विश्लेषण के द्वारा किया जा जरूरत है, भविष्य के लिए मुख्य चुनौतियों vivo में आणविक इमेजिंग तौर तरीकों में मौजूदा मापदंडों के समान संकल्प और संवेदनशीलता के साथ वास्तविक समय में मूल्यांकन के रूप में प्राप्त का उपयोग की अनुमति के सुधार होगा ऊतकीय विश्लेषण.
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Disclosures
लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Lonza Inc. | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Puromycine | Invitrogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega Corp. | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer AG | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter Internationl Inc. | ||
| paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Corporation | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton Co | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton Co | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Corporation | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
References
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