Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

Summary

Questo articolo descrive una sequenza ottimizzata di eventi per l'imaging multimodale di innesti cellulari nel cervello di roditori utilizzando: (i) in bioluminescenza vivo e la risonanza magnetica, e (ii) post mortem l'analisi istologica. La combinazione di queste modalità di imaging su un singolo animale consente la valutazione del trapianto cellulare ad alta risoluzione, sensibilità e specificità.

Abstract

Nel corso dell'ultimo decennio, il trapianto di cellule staminali ha acquisito un crescente interesse come primario o secondario modalità terapeutica per una varietà di malattie, sia negli studi preclinici e clinici. Tuttavia, ad oggi i risultati per quanto riguarda i risultati funzionali e / o la rigenerazione dei tessuti a seguito di trapianto di cellule staminali sono molto diverse. In generale, un beneficio clinico si osserva senza profonda comprensione del meccanismo sottostante (s) ^1. Pertanto, gli sforzi multipli hanno portato allo sviluppo di diverse modalità di imaging molecolare per monitorare cellule staminali innesto con l'obiettivo finale di valutare con precisione la sopravvivenza, destino e fisiologia delle cellule staminali innestate e / o loro micro-ambiente. I cambiamenti osservati in uno o più parametri determinati dalla imaging molecolare potrebbe essere correlato all'effetto clinico osservato. In questo contesto, i nostri studi si concentrano sull'uso combinato di imaging bioluminescenza (BLI), risonanza magnetica (MRI) e l'analisi dell istologicas per valutare cellule staminali innesto.

BLI viene comunemente utilizzato per non invasivo eseguire il monitoraggio delle cellule e la sopravvivenza cellulare monitorare in tempo successivo trapianto ^2-7, basato su una reazione biochimica in cui le cellule che esprimono il gene reporter luciferasi sono in grado di emettere luce seguente interazione con il suo substrato (per esempio D- luciferina) ^{8, 9.} MRI invece è una tecnica non invasiva che è clinicamente applicabile ¹⁰ e può essere utilizzata per localizzare con precisione innesti cellulari ad altissima risoluzione ^11-15, sebbene la sua sensibilità dipende fortemente dal contrasto generato dopo marcatura delle cellule con un agente di contrasto MRI . Infine, post-mortem analisi istologica è il metodo di scelta per convalidare i risultati della ricerca ottenuti con tecniche non invasive con la più alta risoluzione e sensibilità. Inoltre end-point analisi istologica ci permette di eseguire una dettagliata analisi fenotipica delle cellule innestate e / o il tessuto circostante, based sull'uso di proteine ​​reporter fluorescenti e / o etichettatura diretto di cellule con anticorpi specifici.

In sintesi, siamo qui visivamente dimostrare la complementarietà di BLI, MRI e istologia di svelare cellule staminali e diversi / o l'ambiente associate le seguenti caratteristiche innesto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi. Come esempio, midollo osseo, le cellule stromali geneticamente ingegnerizzati per esprimere la proteina fluorescente verde maggiore (EGFP) e luciferasi di lucciola (Fluc), e marcato con blu di ferro particelle fluorescenti dimensioni micron di ossido (MPIOs), verrà innestata nella SNC di topi immuno-competenti ei risultati saranno monitorati da BLI, MRI e istologia (Figura 1).

Protocol

1. Preparazione cellulare

1. Gli esperimenti deve essere iniziato con ex vivo in coltura popolazioni di cellule staminali geneticamente modificate per esprimere le proteine ​​reporter della luciferasi e eGFP. Qui usiamo Luciferase / eGFP-murine esprimono osseo cellule stromali derivate dal midollo (BMSC-Luc/eGFP) come precedentemente descritti da Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. Due giorni prima marcatura delle cellule, le cellule BMSC-Luc/eGFP piastra ad una densità di 8 x 10 ⁵ cellule per T75 pallone coltura in 15 ml di terreno di espansione completa (CEM) supplementato con 1 pg / ml Puromycine.
3. Permettere alle cellule di crescere per 48 ore a 37 ° C e 5% CO _2.
4. Aggiungere 5 x 10 ⁶ glaciali Blu micron di dimensioni particelle di ossido di ferro (GB MPIO) per la cultura media ml per la coltura cellulare in crescita (totale: 75 x 10 ⁶ particelle per 15 ml di mezzo di coltura in un pallone T75 cultura).
5. Incubare per 16 ore per consentire l'assorbimento di particelle tramite endocitosi.
6. Lavare via le particelle rimanentie permettere alle cellule di crescere per altre 24 ore per ottenere distribuzione di celle confluenza e omogenea del MPIO GB.
7. Convalida assorbimento particelle visivamente utilizzando microscopia a fluorescenza contando il rapporto di eGFP + e GB MPIO + cellule alla quantità totale di EGFP + cellule.
8. Lavare GB-MPIO cellule marcate BMSC-Luc/eGFP due volte con 10 ml di PBS e cellule raccolto successivo trattamento tripsina-EDTA (5 ml per beuta T75 cultura per 5 minuti).
9. Lavare le cellule raccolte e risospendere alla concentrazione finale di 133 x 10 ⁶ cellule / ml in PBS.
10. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al trapianto.

2. L'impianto delle cellule nel sistema nervoso centrale di topi

1. Anestetizzare topi da una iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg / kg) + xilazina (16 mg / kg) miscela.
2. Attendere 5 minuti per consentire i topi di addormentarsi.
3. Radersi la testa del mouse per consentire manipolazioni sterili.
4. Posizionare il mouse in un frame stereotassico.
5. Disinfettare l'pelle bagnata e gli occhi dei topi per prevenire la disidratazione.
6. Eseguire un'incisione mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio, e praticare un foro nel cranio con un trapano dentistico bava alla coordinate date: 2 mm posteriormente e 2 mm laterale Bregma.
7. Vortex la sospensione cellulare brevemente e aspirare la sospensione di cellule nella siringa.
8. Posizionare l'ago della siringa ad una profondità di 2,5 mm sotto la dura e consentire equilibrio di pressione per 1 minuto.
9. Iniettare a 3 microlitri di sospensione cellulare (4 x 10 ⁵ cellule) ad una profondità di 2 mm sotto la dura e ad una velocità di 0,70 microlitri / min usando un sistema automatizzato micro-pompa di iniezione.
10. Attendere per altri 5 minuti per impedire il riflusso della sospensione cellulare iniettata.
11. Lentamente ritirare l'ago e disinfettare i confini della pelle prima di suturare la pelle.
12. Iniettare 300 ml soluzione di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea per prevenire la disidratazione, e posizionare il mouse sotto una lampada di riscaldamento per il recupero dall'anestesia. Amministrare post-operatorio analgesico in conformità con gli standard istituzionali.

3. In Bioluminescence vivo

1. Anestetizzare i topi da una miscela del 3% di ossigeno e isoflurano.
2. Mettere i topi nel Imager Photon e ridurre il livello di anestesia al 1,5% isofluorano e ossigeno.
3. Iniettare 150 mg D-luciferina per kg di peso corporeo per via endovenosa.
4. Acquisisci immagine per 5 minuti utilizzando il software Vision Photo.
5. Eseguire l'elaborazione delle immagini utilizzando il software M3vision. Quantificare il segnale osservato con le regioni di interesse fisso.

4. In vivo Risonanza Magnetica

1. Anestetizzare il topi con 3% isoflurano in una miscela di O _2: N ₂ O (3:7).
2. Posizionare i topi nel dispositivo di immobilizzazione di un sistema orizzontale 9.4T MR e ridurre il livello di anestesia al 1% isoflurano in una miscela di O _2: N ₂ O (3:7).
3. Bagnare gli occhi dei topi per evitare disidratazionezione, collegare una sonda rettale per monitorare la temperatura corporea e monitorare la frequenza respiratoria inserendo un sensore sotto la pancia del mouse.
4. Mantenere la frequenza respiratoria a 110 ± 10 respiri al minuto e mantenere la temperatura corporea costante entro una gamma ristretta di 37 ± 0,5 ° C.
5. Posizionare la bobina RF sulla superficie superiore della testa mouse e posizionare il mouse al centro del magnete.
6. Acquisire una serie di 10 coronali T2-pesate di spin echo (SE) immagini per ottenere specifiche informazioni anatomiche e T2 * ponderati eco di gradiente (GE) immagini al fine di studiare la migrazione delle cellule staminali con una risoluzione in piano di 70 micron ^2. Impostare i parametri di sequenza, come segue: tempo di ripetizione (TR): 500 ms, tempo di eco (TE): 8 ms (sequenza GE) e il tempo di ripetizione (TR): 4200 ms, tempo di eco (TE): 12,16 ms (SE sequenza); campo di vista (FOV): 18x18 mm ^2, matrice: 256x256, spessore 1 mm e 1 fetta di separazione fetta mm (5,1 ParaVision software).
7. Eseguire elaborazione datiAmira utilizzando software 4.0.

5. Post Mortem Istologia

1. Anestetizzare il topi profondamente per inalazione di un isofluorano (4%), ossigeno (0,5 L / min) e azoto (1 L / min) miscela per 2 minuti. Sacrificare i topi mediante dislocazione cervicale.
2. Togliere il cervello di topo dal cranio e fissare il tessuto cerebrale in 4% paraformaldeide in PBS per 2 ore.
3. Disidratare il tessuto cerebrale mettendo il cervello in seguito a diversi gradienti di saccarosio: 2 ore in 5% di saccarosio in PBS, 2 ore nel 10% di saccarosio in PBS, durante la notte nel 20% di saccarosio in PBS.
4. Congelare il tessuto cerebrale con azoto liquido e conservare il tessuto a -80 ° C fino al sezionamento.
5. Sezione del tessuto cerebrale in 10 sezioni micron di spessore utilizzando un criostato.
6. Schermo macchiata criosezioni per fluorescenza blu dalle particelle MPIO GB e fluorescenza verde dalle cellule esprimenti EGFP usando un microscopio a fluorescenza.
7. Schermo senza macchia per criosezioniverde / rosso fluorescenza di fondo a partire da cellule infiammatorie.
8. Eseguire ulteriori colorazioni immunoistochimiche e di immunofluorescenza per identificare popolazioni di cellule endogene (per esempio microglia, astrociti, cellule T, ...) che interagiscono con innesti cellulari.

6. Risultati rappresentativi

Noi qui visivamente presentato una sequenza ottimizzata di eventi per il successo di imaging multimodale della luciferasi / eGFP che esprimono (staminali) le popolazioni di cellule nel sistema nervoso centrale di topi. Dapprima, i risultati descritti GB MPIO etichettatura procedura di etichettatura altamente efficiente di cellule BMSC-Luc/eGFP, che possono facilmente essere convalidati utilizzando microscopia a fluorescenza (Figura 2A). Successivamente, su innesto di GB MPIO etichettati BMSC-Luc/eGFP nel SNC di topi, sopravvivenza del trapianto cellulare può essere controllata in vivo BLI sulla base di attività di luciferasi (Figura 2B). Inoltre, la localizzazione delle cellule innestate può essere monitorato in vivo (Figura 2C). Infine, l'analisi istologica consente la validazione dei risultati ottenuti da BLI e risonanza magnetica. Sopravvivenza stabile è stata confermata da una espressione di eGFP stabile nel tempo (Figura 2D). Per questo, colocalizzazione di eGFP cellule che esprimono con fluorescente blu MPIO consente di determinare con esattezza la localizzazione e la sopravvivenza delle cellule trapiantate. Inoltre, questo etichettatura duplice fluorescente delle cellule staminali riduce la possibilità di osservare falsi risultati positivi basati sulla fluorescenza di fondo creato da cellule infiammatorie ^5.

Figura 1. Panoramica della sequenza di movimentazione

1. Cella etichettatura: BMSC-Luc/eGFP sono etichettati con 5 x 10 ⁶ GB particelle MPIO per mezzo di coltura ml. Dopo 16 ore di incubazione e di un successivo periodo di riposo di 24 ore, le cellule vengono raccolti perimpianto intracerebrale.
2. Impianto Cell: GB MPIO etichettato BMSC-Luc/eGFP si innestano nel cervello del mouse le seguenti coordinate: bregma -2 mm, 2 mm a destra dalla linea mediana e 2 mm sotto dura.
3. In vivo BLI: Dopo la somministrazione endovenosa di 150 mg D-luciferin/kg peso corporeo, la luce generata è stata acquisita per 5 minuti con il Photon Imager.
4. In vivo MRI: Un insieme di 10 coronali T2-pesate di spin echo (SE) immagini e T2 * ponderati eco di gradiente (GE) le immagini con una risoluzione in piano di 70 micron ^due sono state acquisite. Parametri della sequenza sono i seguenti: tempo di ripetizione (TR): 500 ms, tempo di eco (TE): 8 ms (sequenza GE) e tempo di ripetizione (TR): 4200 ms, tempo di eco (TE): 12,16 ms (sequenza SE); campo di vista (FOV): 18x18 mm ^2, matrice: 256x256, spessore 1 mm e 1 fetta di separazione fetta di mm.
5. Post-mortem istologia: 10 pm cryosection spessore sono stati sottoposti a screening per eGFP esprimere e blu fluorescente etichettati BMSC ucantare un microscopio a fluorescenza.

Figura 2. L'imaging multimodale di innesti di cellule staminali

1. Microscopia di immunofluorescenza diretta Glacial blu (GB) MPIO etichettato BMSC-Luc/eGFP.
2. In vivo BLI di topi iniettati con 4x10 ⁵ GB MPIO etichettato cellule BMSC-Luc/eGFP alla settimana 1 e 2 settimane dopo l'impianto. L'analisi statistica dei segnali rilevati BLI alla settimana 1 e 2 settimane post-impianto. I dati sono espressi come numero medio di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato (ph / s / sr / cm ²⁾ da un periodo di tempo 5 minuti + / - errore standard calcolato da una regione di interesse fisso in topi mostrano un chiaro segnale BLI al sito di iniezione.
3. Coronale bidimensionale RM GB MPIO marcato BMSC-Luc/eGFP (a sinistra del pannello: (i) T2-pesata spin echo e (ii) T2 *-pesata gradient echo) e senza etichetta BMSC-Luc / eGFP (riquadro di destra: (iii) pesata in T2 immagine spin echo e (vi) T2 *-pesata gradient echo) innesti di cervello di topo.
4. L'analisi istologica di GB MPIO marcato impianti BMSC-Luc/eGFP alla settimana 2 post-impianto. (I) analisi di immunofluorescenza diretta per la localizzazione di eGFP-esprimere e GB innesti BMSC-Luc/eGFP MPIO etichettati. (Ii) dettaglio Alto ingrandimento: (i). (Iii) la colorazione immunofluorescenza per l'antigene GFAP, indicando lo sviluppo di tessuto cicatriziale astrociti nei dintorni di GB MPIO etichettato BMSC-Luc/eGFP. (Vi) colorazione per immunofluorescenza Iba-1 antigene, indicando l'invasione e circostante di GB MPIO etichettati BMSC-Luc/eGFP da microglia.

Discussion

In questo rapporto, descriviamo un protocollo ottimizzato per la combinazione di tre modalità di imaging complementari (BLI, MRI e istologia) per la caratterizzazione dettagliata degli impianti cellulari nel SNC di topi immuni competenti. Una combinazione di etichettatura gene reporter di cellule, basata sulla modificazione genetica con i geni reporter lucciola, luciferasi e eGFP, e una cella di etichettatura diretta con GB MPIO, porta ad una valutazione accurata degli innesti di cellule staminali in vivo.

Per particelle di etichettatura BMSC, la dimensione delle particelle GB MPIO (1.63μm) in combinazione con la superficie anionica (sostituti carbossilici) è suggerito per facilitare l'assorbimento intracellulare di queste particelle non fagocitiche ^16-18. Tuttavia, va ricordato che il tempo di incubazione per ottenere l'etichettatura ad alta efficienza è del tipo a cella dipendente. Ad esempio, fagociti (come macrofagi e cellule dendritiche) sono in grado di interiorizzare queste particelle più rapidamente (tempo di incubazione di 0,5 - 1 ora) rispetto ai non-phaghocytic tipi di cellule (come le cellule staminali BMSC o neurale), che necessitano di un tempo di incubazione di minimo 16 ore per l'etichettatura efficiente. Questo deve essere preso in considerazione durante l'esecuzione di esperimenti di marcatura delle cellule e l'efficienza di etichettatura dovrebbe essere sempre determinato in anticipo, utilizzando la microscopia a fluorescenza e / o analisi di citometria di flusso. Come etichettatura di popolazioni di cellule con GB MPIOs non influenza la vitalità cellulare, proliferazione cellulare o fenotipo cella ^5, la combinazione di ossido di ferro ed un fluoroforo in queste particelle crea quindi una opportunità ideale per visualizzare entrambi da MRI e ottico. Inoltre, a causa del contenuto di ferro e particelle di grandi dimensioni, le particelle MPIO può essere utilizzato per singola cella ^12,19,20 e di imaging singola particella ²¹ con MRI. Questo è estremamente interessante quando si tratta di studiare la migrazione cellulare come singole cellule possono essere osservati. Tuttavia, l'alto contenuto di ferro della utilizzato GB MPIOparticelle ha anche alcuni svantaggi quando si punta a delineare la dimensione esatta del sito di innesto alla risonanza magnetica. Il contenuto di ferro molto elevato di MPIOs non solo crea disomogeneità magnetici nel sito di impianto, ma anche nei dintorni dell'impianto cellulare, causando una sovrastima del volume sito di impianto e una discriminazione meno accurata tra cellule impiantate e il tessuto circostante. Di conseguenza, il tipo di particella, necessaria per l'etichettatura cella, dipenderà dal disegno dello studio. Quando lo scopo di determinare la migrazione delle cellule staminali, una sensibilità molto elevata e quindi ferro alta contenente MPIOs saranno necessari. D'altra parte, quando l'obiettivo per la localizzazione precisa di innesti di cellule staminali piccoli SPIOs con un contenuto di ferro inferiore potrebbero essere un'alternativa preferibile ^22. Inoltre, particelle di ferro generare contrasto negativo l'introduzione di un altro problema riguardante la discriminazione tra cellule impiantate e sanguinamento delle cellule dopo l'innesto. Quindi un sacco di ricerca sta andandoverso l'uso di agenti di contrasto per la marcatura delle cellule positive. Accanto al tipo di particella, il tipo di sequenza utilizzata per l'acquisizione MRI dipende anche lo scopo dello studio. Quando MRI è usato per delineare l'impianto di ottenere informazioni precise sulla localizzazione dell'impianto e del volume dell'impianto, la sequenza T2 (spin echo) è favorevole in quanto fornisce informazioni anatomiche con elevata precisione. D'altra parte, la sequenza T2 * (gradiente echo) è una sequenza utilizzato per studiare migrazione di cellule innestate come questa sequenza tiene conto di tutte le disomogeneità del campo magnetico rendere una maggiore sensibilità verso composti che influenzano il campo magnetico. Questa sequenza è assolutamente necessaria quando si tratta di rilevamento di una piccola quantità di cellule che avrebbe migrati dalla regione impiantata. Utilizzando questa sequenza abbiamo potuto concludere che le cellule BMSC-Luc/eGFP non migrano dopo l'impianto striatale nel sistema nervoso centrale di topi.

MentreLa RM fornisce dati riguardanti la localizzazione delle cellule dell'impianto, ulteriori analisi BLI fornisce i dati relativi all'impianto sopravvivenza cellulare ^2,4,11. Poiché la reazione enzimatica tra l'enzima luciferasi e il substrato luciferina richiede la presenza di O ₂ e ATP, è una tecnica affidabile per studiare la sopravvivenza cellulare. Cellule necrotiche non esprimono l'enzima luciferasi e non O ₂ e ATP sarà presente. Inoltre, solo le cellule che esprimono l'enzima luciferasi sono in grado di catalizzare la reazione, con conseguente produzione di luce, che assomiglia l'elevata sensibilità della tecnica. BLI può essere eseguita in modo quantitativo perché la quantità di luce prodotta è proporzionale alla quantità di luciferasi cellule esprimenti. Tuttavia, considerazioni importanti devono essere presi in considerazione durante l'esecuzione BLI quantitativamente come diversi fattori diversi quantità di cellule può influenzare il livello di espressione della luciferasi o la quantità di luce rilevata. Ad esempio, anesthesiun livello può influenzare l'enzima luciferasi e / o la disponibilità luciferina ^23, e composti diversi fattori possono influenzare la disponibilità substrato e / o attività di assorbimento ^24-26 o ^27-30 promotore, con conseguente differenze di segnale. Inoltre l'uso di BLI è limitata a piccoli animali come la tecnica è limitata alla penetrazione del tessuto bassa di luce. Di conseguenza, quando l'obiettivo è di eseguire BLI quantitative di seguire la sopravvivenza delle cellule dopo il trapianto, tutti i parametri può influenzare le variazioni del segnale deve essere mantenuto il più standard possibile. Ad esempio, la profondità di impianto innesti livello cellulare, anestesia e via di somministrazione / quantità del substrato somministrata prima acquisizione BLI, rasatura corretta della pelle dell'animale, ecc

Tenuto conto di quanto sopra descritto i vantaggi e gli svantaggi di imaging molecolare, i risultati ottenuti sempre bisogno di essere convalidato mediante analisi istologica. Con la presente varionoi fenotipi cellulari e le interazioni cellulari tra diversi tipi di cellule possono essere visualizzati con post mortem la massima sensibilità. Nonostante il fatto che questa tecnica è lo strumento di convalida della scelta, la presenza di fluorescenza di fondo creato da cellule infiammatorie circostanti e / o invadere il sito di innesto deve essere considerato, in quanto questo potrebbe portare a falsi risultati positivi. Tuttavia, l'uso di una doppia etichettatura con un gene reporter fluorescente, come eGFP, e una sonda fluorescente, come GB MPIO, riduce la possibilità di errori di identificazione (cioè cellule innestate dovrebbe visualizzare entrambi fluorescenze specifiche, senza mostrare fluorescenza di fondo in luce irrilevante canali).

Riassumendo, mentre BLI è una tecnica unica per monitorare la sopravvivenza cellulare nel tempo in maniera quantitativa con elevata sensibilità, ma bassa risoluzione, RM è la tecnica di scelta per superare la bassa risoluzione ottenuta con BLI. Combinazione di queste tecniche in vivoquestione rende sufficienti informazioni riguardanti la sopravvivenza e la localizzazione delle cellule trapiantate in vivo in un modo non invasivo. Infine, le interazioni cellulari innesto con tessuto circostante e / o endogeni cellule infiammatorie possono essere facilmente controllati post mortem utilizzando istologia. Anche se, al momento, quest'ultimo deve ancora essere fatto mediante analisi istologica, le principali sfide per il futuro sarà quello di migliorare esistente in modalità di imaging molecolare in vivo per permettere valutazione in tempo reale dei parametri con risoluzione simile e sensibilità ottenuti utilizzando analisi istologica.