Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Published: June 13, 2012 doi: 10.3791/3906

Summary

In vivo biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntüleme (i) ve (ii) post mortem histolojik analiz: Bu makale ile kemirgen beyinde hücresel greft multimodal görüntüleme için optimize edilmiş olaylar dizisi anlatılmaktadır. Tek bir hayvan bu görüntüleme yöntemleri birleştirerek, yüksek çözünürlüklü, duyarlılık ve özgüllük ile hücresel greft değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Abstract

Son on yıl içinde, kök hücre nakli preklinik ve klinik çalışmalarda her iki hastalığın, çok çeşitli birincil veya ikincil tedavi yöntemi olarak artan bir ilgi kazandı. Ancak, fonksiyonel sonuç ve / veya doku rejenerasyonu aşağıdaki kök hücre nakli ile ilgili sonuçlar oldukça çeşitlidir bugüne kadar. Genellikle bir klinik fayda altta yatan mekanizma (lar) 1 derin bir anlayış olmadan görülmektedir. Bu nedenle, birden çabaları doğru bir yaşam, kader ve aşılı kök hücre ve / veya mikro-çevre fizyolojisi değerlendirmek için nihai amacı ile aşılama kök hücre izlemek için farklı moleküler görüntüleme yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Moleküler görüntüleme tarafından belirlenen bir veya daha fazla parametre gözlenen değişiklikler gözlenen klinik etkisi ile ilişkili olabilir. Bu kapsamda çalışmalarımız biyolüminesans görüntüleme kombine kullanımı (BLI), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve histolojik analysi odaklanmaks aşılama kök hücre değerlendirmek.

BLI yaygın olarak non-invaziv hücreler Lusiferaz-raportör gen ifade eden bir biyokimyasal reaksiyon dayalı nakli 2-7, ardından hücre izleme gerçekleştirmek ve zamanla hücre sağkalım izlemek için kullanılır substratına ışık aşağıdaki etkileşimi yayabilir (örn. D- lusiferin) 8, 9. Diğer taraftan MR duyarlılığı yüksek bir MRG kontrast madde ile hücre etiketleme sonra oluşturulan kontrast bağlı olmasına rağmen, 10 klinik olarak uygulanabilen ve kesin bir şekilde çok yüksek çözünürlüklü 11-15 hücresel greftler bulmak için kullanılan bir non-invaziv bir tekniktir . Son olarak, post-mortem histolojik analiz en yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile non-invaziv teknikler ile elde edilen araştırma sonuçları doğrulamak için tercih edilen yöntemdir. Ayrıca son nokta histolojik analiz bize aşılı hücreleri ve / veya çevre dokulara, ba detaylı fenotipik analizi yarabilirsinizflüoresan raportör protein ve / veya spesifik antikorlar ile doğrudan hücre etiketleme kullanımı sed.

Özetle, burada görsel olarak farklı kök hücre ve / veya çevre ile ilişkili farelerin MSS aşılama kök hücre aşağıdaki özellikleri çözmeye BLI, MRI ve histoloji tamamlayıcılık göstermektedir. Örnek olarak, kemik iliği kaynaklı genetik olarak geliştirilmiş Yeşil floresan proteini (EGFP) ve ateşböceği Lusiferaz (değişimlerine) ve mavi floresan mikron büyüklüğünde demir oksit parçacıkları (MPIOs) ile etiketlenmiş ifade mühendislik stromal hücreleri, aşılanmış olacak Bağışıklık yetkili fareler ve sonucu MSS BLI, MRI ve histoloji (Şekil 1) tarafından izlenecektir.

Protocol

1. Hücre Hazırlık

  1. Deneyler genetik Lusiferaz ve EGFP muhabiri proteinleri ifade mühendislik ex vivo kültüre kök hücre popülasyonları ile başlanmalıdır. Burada daha önce Bergwerf ve ark. 2, 5 tarafından tarif / Lusiferaz EGFP-ifade fare kemik iliği kaynaklı stromal hücreler (BMSC-Luc/eGFP) kullanın.
  2. 1 ug / ml Puromycine ile desteklenmiş 15 mL komple genişletme ortamı (CEM) içinde kültüre T75 şişeye başına 8 x 10 5 hücre yoğunluğunda hücre etiketleme, plaka BMSC-Luc/eGFP hücreler iki gün önce.
  3. Hücreler 37 az 48 saat büyümeye izin ° C ve% 5 CO 2.
  4. 5 Ekle x 10 6 Buzul Mavi mikron büyüklüğünde demir oksit parçacıkları (GB MPIO) artan hücre kültürüne başına ml kültür ortamı (toplam: 75 x 10 T75 kültür şişelerinde 15 ml kültür ortamı başına 6 parçacıklar).
  5. Endositoz ile partikül uptake izin verecek şekilde 16 saat boyunca inkübe.
  6. Kalan parçacıkları yıkayıpve hücreler GB MPIO hücre konfluent ve homojen bir dağılım elde etmek için ek bir 24 saat boyunca büyümeye izin verir.
  7. EGFP + hücrelerin toplam tutarı EGFP + ve GB MPIO + hücrelerin oranı sayarak floresan mikroskobu kullanarak görsel parçacık alımı doğrulayın.
  8. Yıkama GB MPIO-etiketli BMSC-Luc/eGFP hücreleri iki kez tripsin-EDTA tedavisi (5 dakika boyunca kültürün T75 şişeye başına 5 mi) takiben 10 ml PBS ile hasat hücrelerle.
  9. 133 x 10 6 hücre / ml PBS içinde nihai konsantrasyonu hasat hücreleri ve Pastör pipetiyle yıkayın.
  10. Transplantasyonu kadar buz üzerinde hücreleri tutun.

2. Farelerde MSS Hücre İmplantasyonu

  1. Bir ketamin bir intraperitonal enjeksiyon (80 mg / kg) + Xylazine (16 mg / kg) karışımı ile farelerde uyuşturmak.
  2. Farelerin uykuya için 5 dakika bekleyin.
  3. Steril manipülasyon izin vermek için fare başını tıraş.
  4. Bir stereotaktik çerçeve fare yerleştirin.
  5. Desinfectderi ve farelerin gözleri su kaybını önlemek için ıslak.
  6. Kafatası ortaya çıkarmak için bir orta hat skalp insizyonu olun ve verilen koordinatlarda bir diş matkap tur kullanımı kafatasında bir delik: posterior 2 mm ve bregma lateral 2 mm.
  7. Kısaca vorteks hücre süspansiyonu ve şırınga içinde hücre süspansiyonu aspire.
  8. Dura altında 2,5 mm derinlikte şırınga iğnesinin koyun ve 1 dakika basınç dengeleme sağlar.
  9. Otomatik bir mikro-enjeksiyon pompası kullanılarak dura altında 2 mm arasında bir derinliğe ve 0.70 ul / dak 'lık bir hızda bir 3 ul hücre süspansiyonu (4 x 10 hücre 5) enjekte edilir.
  10. Enjekte hücre süspansiyonu geri akmasını önlemek için ek bir 5 dakika beklenir.
  11. Yavaşça geri iğne ve cilt sütür önce cildin sınırları dezenfekte edin.
  12. Dehidratasyonu önlemek için subkutan 300 ul% 0.9 NaCl solüsyonu enjekte edilir, anestezi kurtarmak için bir ısıtma lambası altında fare yerleştirin. P yönetmekurumsal standartlara uygun olarak ost-operatif ağrı kesici.

3. Vivo olarak Biyolüminesens

  1. Izofluran oksijen ve% 3 arasında bir karışımı ile farelerde uyuşturmak.
  2. Foton Imager fareler yerleştirin ve izofluran ve oksijen% 1,5 anestezi seviyesini azaltır.
  3. Intravenöz kg vücut ağırlığı başına 150 mg D-lusiferin enjekte edilir.
  4. Fotoğraf Vision yazılımı kullanarak 5 dakika için görüntü elde edin.
  5. M3vision yazılımı kullanarak görüntü işleme gerçekleştirin. Ilgi sabit bölgeleri kullanarak gözlenen sinyal ölçmek.

4. Vivo Manyetik Rezonans Görüntüleme yılında

  1. N 2 O (03:07): O 2 oluşan bir karışım içerisinde izofluran% 3 ile farelerde uyuşturmak.
  2. Bir yatay 9.4T MR sisteminin restrainer içinde farelerin yerleştirmek ve anestezi seviyesi O 2 oluşan bir karışım içerisinde izofluran% 1 ila azaltmak: N 2 O (03:07).
  3. Dehidratasyona önlemek için, farelerin gözler ıslatmayaTION, fare göbek altında bir sensör koyarak vücut sıcaklığını izlemek ve solunum hızını izlemek için bir rektal prob takın.
  4. 110 ± dakikada 10 nefes az solunum hızını korumak ve ± 0.5 ° C 37 dar bir aralık içinde vücut sıcaklığının sabit tutulması
  5. Fare kafa ve mıknatıs ortasında pozisyonu fare üst yüzeyi RF bobin yerleştirin.
  6. 70 mikron 2 bir düzlem çözünürlüğü ile kök hücre göçü çalışmak için belirli anatomik bilgi ve T2 *-ağırlıklı gradient eko (GE) görüntüler elde etmek için 10 koronal T2 ağırlıklı spin eko (SE) görüntü kümesi elde edin. Tekrarlama zamanı (TR): şöyle sıra parametreleri ayarla 500 ms, eko zamanı (TE): 8 ms (GE dizisi) ve tekrarlama zamanı (TR): 4200 ms, eko zamanı (TE): 12.16 ms (SE dizisi); 18x18 mm 2, matriks: 256x256, 1 mm kesit kalınlığı 1 mm kesit ayrılması (Paravision 5.1 yazılımı) (FOV) alanında.
  7. Veri işleme gerçekleştirinAmira 4.0 yazılımını kullanarak.

5.. Post Mortem Histoloji

  1. Bir isofluorane (% 4), oksijen (0.5 L / dk) ve azot (1 L / dk) 2 dakika boyunca karışımı Solunduğunda çok derinden fareler uyuşturan. Servikal dislokasyon ile fareler kurban.
  2. Kafatası fare beyin kaldırmak ve 2 saat süreyle PBS içinde% 4 paraformaldehit beyin doku sabitleştirmek.
  3. PBS içinde% 20 sukroz gece boyunca PBS içinde% 10 sukroz, PBS içerisinde, 2 saat içinde% 5 sükroz içinde 2 saat: sakaroz, farklı gradyanlar, müteakiben beyin yerleştirerek beyin doku kurutmak.
  4. Sıvı azot kullanarak beyin dokusu dondurun ve kesit gününe kadar -80 ° C'de doku saklayın.
  5. Bir kriyostat kullanılarak 10 mikron kalınlığında kesitler bölümünde beyin dokusunun.
  6. Ekran GB MPIO parçacıklar ve bir floresan mikroskop kullanılarak EGFP ifade hücrelerden yeşil floresan gelen mavi floresan için cryosections lekesiz.
  7. Ekran için cryosections lekesizinflamatuar hücreler kırmızı / yeşil arka plan floresans.
  8. Hücresel greftleri ile etkileşen endojen hücre popülasyonu (örneğin mikroglia, astrositler, T hücreleri, ...) tanımlamak için daha immünohistokimyasal ve immünofloresan boyamalar yapın.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Burada görsel farelerin MSS Lusiferaz / EGFP-anlatımla (kök) hücre popülasyonlarının başarılı multimodal görüntüleme için optimize edilmiş olaylar dizisi sundu. İlk başta, kolayca doğrulanabilir BMSC-Luc/eGFP hücreleri, yüksek verimli etiketleme açıklanan GB MPIO etiketleme prosedürü sonuçları floresan mikroskobu (Şekil 2A) kullanarak. Sonraki, GB MPIO grefti üzerine farelerin MSS BMSC-Luc/eGFP etiketli, hücresel greft sağkalım lusiferaz aktivitesi (Şekil 2B) dayanan in vivo BLI olarak izlenebilir. Buna ek olarak, aşılı hücrelerinin tam Lokalizasyon in vivo izlenebilir (Şekil 2C) ve demir içeriğine dayalı MR. Son olarak, histolojik analiz BLI ve MRG ile elde edilen sonuçların doğrulama sağlar. Stabil yaşam süresi istikrarlı bir EGFP ifade (Şekil 2B) tarafından doğrulandı. Bunun için, bir ko-EGFP ifade mavi floresan MPIO hücrelerin lokalizasyonu ve aşılı hücrelerin hayatta kalma kesin belirlenmesi için olanak sağlar. Buna ek olarak, kök hücrelerin bu ikili floresan etiketleme inflamatuar hücreler 5 tarafından oluşturulan eşiğe dayalı yalancı pozitif sonuç gözlemlemek olasılığını azaltır.

Şekil 1..
Şekil 1. Işleme sekansı bakış

  1. Hücre etiketleme: BMSC-Luc/eGFP ml kültür ortamı başına 5 x 10 6 GB MPIO parçacıkları ile etiketlenir. 16 inkübasyon saat ve 24 saatlik bir dinlenme süresi aşağıdaki sonra, hücreler için biçilenintraserebral implantasyonu.
  2. Hücre implantasyonu: bregma -2 mm, dura altında orta hat ve 2 mm den 2 mm sağ: GB MPIO BMSC-Luc/eGFP aşağıdaki koordinatları fare beyninde eklemlendiği etiketli.
  3. In vivo BLI olarak: vücut ağırlığı D-luciferin/kg 150 mg takiben intravenöz, oluşturulan ışık Foton Imager kullanarak 5 dakika boyunca elde edildi.
  4. In vivo MRG: 70 mikron 2 bir düzlem çözünürlükte 10 koronal T2 ağırlıklı spin eko (SE) görüntüleri ve T2 *-ağırlıklı gradient eko (GE) görüntü kümesi elde edildi. Tekrarlama zamanı (TR): şöyle Sıra ölçümlerdi 500 ms, eko zamanı (TE): 8 ms (GE dizisi) ve tekrarlama zamanı (TR): 4200 ms, eko zamanı (TE): 12.16 ms (SE dizisi); 18x18 mm 2, matriks: 256x256, 1 mm kesit kalınlığı 1 mm kesit ayrılması (FOV) alanında.
  5. Post-mortem histoloji: 10μm kalınlığında cryosection ifade EGFP ve mavi floresan ile işaretlenmiş BMSC u için tarandıbir floresan mikroskop şarkı.

Şekil 2.
Kök hücresi greftlerinin Şekil 2. Multimodal görüntüleme

  1. Buzul mavi (GB) MPIO arasında İmmunflorasan mikroskopi BMSC-Luc/eGFP etiketli.
  2. 4x10 5 ile enjekte edilen farelerde in vivo BLI yılında GB MPIO haftada 1 ve implantasyon sonrası haftada 2 BMSC-Luc/eGFP hücreleri etiketli. 1. hafta ve haftada 2 implantasyon sonrası tespit BLI sinyallerin istatistiksel analizi. Veriler 5 dakika süre gelen santimetre kare başına steradyan başına saniyede fotonların ortalama sayısı (ph / s / sr / cm 2) olarak ifade edilmiştir + / - net bir BLI sinyali gösteren farelerde ilgi sabit bir bölge hesaplanan standart hata enjeksiyon yerinde.
  3. Ve etiketsiz BMSC-L: GB MPIO koronal iki boyutlu MR BMSC-Luc/eGFP ((i) T2-ağırlıklı spin eko görüntü ve (ii) T2 *-ağırlıklı gradient eko görüntüde sol panel) etiketliuc / EGFP (sağ panel: (iii) T2-ağırlıklı spin eko görüntü ve (vi) T2 *-ağırlıklı gradient eko görüntüde) fare beyin greft.
  4. GB MPIO histolojik analiz haftada 2 post-implantasyon BMSC-Luc/eGFP implantlar etiketli. EGFP-ifade ve GB MPIO etiketli BMSC-Luc/eGFP greft lokalizasyonu için (i) İmmunflorasan analizi. (Ii) Yüksek büyütmede ayrıntılı olarak, (i). GB MPIO ve çevresindeki astrositik skar dokusu gelişimi gösteren GFAP antijen (iii) immünofloresan boyama, BMSC-Luc/eGFP etiketli. Iba-1 antijeni (vi) immünofloresan boyama, işgal gösteren ve GB MPIO çevresi mikroglia tarafından BMSC-Luc/eGFP etiketli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, immün yetenekli farelerin MSS hücresel implantların detaylı karakterizasyonu için üç tamamlayıcı görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu (BLI, MRI ve histoloji) için optimize edilmiş bir protokol tanımlamaktadır. Muhabir genler ateş böceği Lusiferaz ve EGFP, ve GB MPIO ile doğrudan hücre etiketleme ile genetik modifikasyona bağlı hücrelerin raportör gen etiketleme, kombinasyonu in vivo kök hücre greftler doğru bir değerlendirme yol açar.

BMSC parçacık etiketlenmesi için, anyonik yüzey (karboksil ikameleri) ile kombinasyon halinde GB MPIO partikül boyutu (1.63μm) non-fagositik hücreleri 16-18 bu parçacıkların endositoksik alınmalarını kolaylaştırmak üzere sürülmektedir. Bununla birlikte, yüksek etiketleme verimliliği elde etmek için inkübasyon süresi hücre türüne bağlı olduğunu bahsedilen gerekir. Örneğin, fagositik hücreler (makrofajlar ve dendritik hücreler gibi) daha hızlı bir şekilde bu parçacıkların içselleştirmek edebiliyoruz (0.5 inkübasyon süresi - 1 saat) etkin etiketleme için asgari 16 saat bir kuluçka süresi gerekir olmayan phaghocytic hücre tipleri (BMSC veya nöral kök hücreler gibi), ile karşılaştırıldığında. Bu hücre etiketleme deneyler ve etiketleme etkinliği gerçekleştirirken, her zaman floresan mikroskobu ve / veya akım sitometri analizi ile önceden tespit edilmelidir dikkate alınması gerekir. GB MPIOs ile hücre popülasyonlarının etiketleme hücre canlılığı, hücre çoğalması veya hücre fenotipi 5 etkilemez gibi, bu parçacıklar demir oksit ve bir fluorofor kombinasyonu nedenle hem MRG ve optik görüntüleme ile onları görselleştirmek için ideal bir fırsat oluşturur. Dahası, yüksek demir içeriği ve büyük bir tanecik boyutuna bağlı olarak, parçacıklar MPIO MRI ile tek bir hücre 12,19,20 ve tek parça 21 görüntüleme için de kullanılabilir. Bu tek hücre görüleceği üzere hücre göçü çalışmaya geldiğinde bu son derece ilginç. Bununla birlikte, kullanılan GB MPIO yüksek demir içeriğiMRG ile greft sitenin tam boyutunu tasvir amaçlayan Parçacık dezavantajları da vardır. MPIOs çok yüksek demir içeriği implant hacmi ve implante hücreleri ve çevre doku arasında daha az doğru bir ayrımcılık abartılması sonucu, hücresel implantın çevresinde de implant yerinde manyetik homojen olmayan düzensizlikleri yaratır, sadece o değil. Sonuç olarak, partikül tipi, hücre etiketlenmesi için ihtiyaç duyulan, çalışma tasarımı bağlı olacaktır. Kök hücre göçü, çok yüksek bir duyarlılık ve böylece MPIOs gerekli olacak içeren yüksek demir belirlemek amacıyla zaman. Öte yandan, bir düşük değerli demir içeriğine sahip kök hücre greftleri, küçük SPIOs doğru lokalizasyonunu amaçlayan olduğunda tercih edilen bir alternatif 22 olabilir. Ayrıca, demir partikülleri implante hücreleri arasındaki ayrımcılığa ilişkin ve aşılama sonrası hücre kanayan bir başka sorun tanıtan negatif kontrast oluşturur. Bu nedenle bir çok araştırma gidiyorhücre etiketleme için pozitif kontrast ajanların kullanımı konusunda üzerinde. Partikül tipi yanında, MRI elde edilmesi için kullanılan sekansının tipi de çalışmanın amacı bağlıdır. Yüksek doğruluk ile anatomik bilgi sağlar MRG implant konumu ve implant hacmi, T2 sırası hakkında doğru bilgi elde etmek için implant tanımlamak için kullanıldığı zaman (spin eko) uygundur. Diğer taraftan, T2 * sekansı (gradient eko) bu sıra dikkate manyetik alanın etkileyen bileşikler doğru bir şekilde daha hassas hale manyetik alan bütün inhomogenities alır gibi aşılanmış hücre göçü mümkün araştırmak için kullanılan bir sekansıdır. Bu implante bölgenin dışına göç olabilir hücrelerinin küçük bir miktarının saptanması için söz konusu olduğunda, bu sekans kesinlikle gereklidir. Bu dizi kullanmamız bizim BMSC-Luc/eGFP hücreleri farelerin MSS striatal implantasyonu sonrası göç olmadığına karar başardık.

SüreMR hücre implant lokalizasyonu açısından veri sağlayan, ek BLI analizi hücre implant sağkalımı 2,4,11 ilgili verileri sağlar. Lusiferaz enzim ve substrat lusiferin arasındaki enzimatik reaksiyon O 2 ve ATP varlığı gerekir olarak, hücre canlılığı incelemek için güvenilir bir tekniktir. Nekrotik hücre lusiferaz enzim ve hiçbir O 2 ifade olmaz ve ATP mevcut olacaktır. Dahası, lusiferaz enzimi ifade yalnızca hücreleri tekniğin yüksek hassasiyetli benzer ışık, üretimi ile sonuçlanan, reaksiyon katalize etmek mümkündür. Üretilen ışık miktarını lusiferaz-salgılayan hücrelerin miktarı ile orantılı olduğundan BLI nicel bir şekilde gerçekleştirilebilir. Ancak, önemli hususlar hücre miktarda başka faktörlerle lusiferaz ifadesi seviyesi veya algılanan ışık miktarını etkileyebilir gibi kantitatif BLI yapılırken dikkate alınması gerekir. Örneğin, anesthesiBir seviye, lusiferaz enzim ve / veya lusiferin durumu 23 etkileyebilecek çeşitli faktörler ve bileşikleri sinyal çıkışı farklılıklar sonucu, yüzey durumu ve / veya alımı 24-26 veya promotor aktivitesi 27-30 etkileyebilir. Tekniği ışık düşük doku penetrasyon ile sınırlıdır Dahası BLI kullanımı küçük hayvan ile sınırlıdır. Sonuç olarak, tüm parametreleri muhtemelen sinyal değişimleri etkileyen, transplantasyon sonrası hücre sağkalım takip nicel BLI gerçekleştirmek amacıyla, mümkün olduğu standart olarak tutulması gerekmektedir. Örneğin, hücresel greftler, anestezi düzeyi ve uygulama yolu / BLI edinim öncesi uygulanan substrat miktarı, hayvanın deri düzgün tıraş, vb implantasyonu derinliği

Moleküler görüntüleme açıklanan avantaj ve dezavantajları yukarıda dikkate alındığında, elde edilen sonuçlar her zaman histolojik analizi ile doğrulanması gerekiyor. İşbu variobize hücre fenotipleri ve farklı hücre tipleri arasında hücresel etkileşimleri en yüksek duyarlılık otopsi ile görüntülenebilmekte. Bu tekniği tercih doğrulama aracı, ve / veya greft işgalci Bu yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir gibi, üzerinde düşünülmesi gereken çevreleyen inflamatuar hücreler tarafından oluşturulan arka floresans varlığı olmasına rağmen. Bununla birlikte, bu tür GB MPIO gibi EGFP gibi bir flüoresan raportör geni, ve flöresanlı bir prob ile ikili bir etiketleme kullanımı misidentifikasyon olasılığı (yani, aşılı hücreleri ilgisiz ışığında arka floresans göstermeden, her iki belirli bir floresan görüntülemelidir azaltır kanal).

BLI çok yüksek hassasiyet ama düşük çözünürlüklü sayısal bir şekilde zaman içinde hücre sağkalım izlemek için benzersiz bir teknik ise, özetleme, MRI BLI ile elde edilen düşük çözünürlüklü aşmak için tercih edilen tekniktir. İn vivo teknik içinde bunların kombinasyonuQues hayatta kalma ve invaziv olmayan bir şekilde in vivo aşılı hücrelerin lokalizasyonu ile ilgili yeterli bilgi vermektedir. Son olarak, çevre doku ve / veya endojen inflamatuar hücreler ile hücre greft etkileşimleri kolayca histoloji kullanarak post mortem izlenebilir. An, ikincisi hala histolojik analizi yapılması gerektiğini, ancak gelecek için önemli zorluklar elde edilen benzer çözünürlük ve hassasiyet ile parametrelerin gerçek zamanlı değerlendirme kullanarak izin vivo moleküler görüntüleme yöntemleri mevcut geliştirmek olacaktır histolojik analizi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışma beyan ederim.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Lonza Inc. BE12-722F Component of the cell growth medium CEM
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 10270-106 Component of the cell growth medium CEM
Horse serum GIBCO, by Life Technologies 1605-122 Component of the cell growth medium CEM
Penicillin-streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140 Component of the cell growth medium CEM
Fungizone GIBCO, by Life Technologies 15290-018 Component of the cell growth medium CEM
PBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Puromycine Invitrogen ant-pr-1
trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300
GB MPIO Bangs Laboratories ME04F/7833
D-luciferin Promega Corp. E1601
Ketamine (Ketalar) Pfizer Pharma GmbH
Xylazine (Rompun) Bayer AG
Isoflurane Isoflo 05260-05
0.9% NaCl solution Baxter Internationl Inc.
paraformaldehyde Merck & Co., Inc. 1.04005.1000
sucrose Applichem A1125
Micro-injection pump KD scientific KDS100
Photon imager Biospace Lab
9.4T MR scanner Bruker Corporation Biospec 94/20 USR
BX51 microscope Olympus Corporation BX51
Mycrom HM cryostat Prosan HM525
syringe Hamilton Co 7635-01
30 gauge needle Hamilton Co 7762-03
Photo Vision software Biospace Lab
M3vision software Biospace Lab
Paravision 5.1 software Bruker Corporation
Amira 4.0 software Visage Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. Molecular imaging of stem cells. , (2008).
  2. Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).
  3. Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
  4. Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
  5. De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
  6. Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
  7. Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
  8. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
  9. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
  10. Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
  11. Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
  12. Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
  13. Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
  14. Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
  15. Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
  16. Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
  17. Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
  18. Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
  19. Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
  20. Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
  21. Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
  22. Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
  23. Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
  24. Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
  25. Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
  26. Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
  27. Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
  28. Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
  29. Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
  30. Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).

Tags

Nörobilim Sayı 64 Kök hücre biyolojisi Hücre etiketleme Hücre Nakli Beyin Biyolüminesens Görüntüleme Manyetik Rezonans Görüntüleme Histoloji
Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Vocht, N., Reekmans, K.,More

De Vocht, N., Reekmans, K., Bergwerf, I., Praet, J., Hoornaert, C., Le Blon, D., Daans, J., Berneman, Z., Van der Linden, A., Ponsaerts, P. Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice. J. Vis. Exp. (64), e3906, doi:10.3791/3906 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter