Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En trin-for-trin metode til at rekonstituere en ABC Transporter ind i Nanodisc lipidpartikler

Published: August 31, 2012 doi: 10.3791/3910
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

Summary

Nanodiscs er små skiveformede partikler, der inkorporerer membranproteiner i et lille plaster på phospholipid dobbeltlag. Vi giver en visuel protokol, der viser trin for trin inkorporering af MalFGK2 transportør til en skive.

Abstract

Det nanodisc er en skiveformede partikel (~ 10-12 nm stor) at fælde membranproteiner i et lille plaster på phospholipid dobbeltlag. The nanodisc er en særlig attraktiv mulighed for at studere membranproteiner, specielt i forbindelse med ligand-receptor-interaktioner. Fremgangsmåden udviklet af Sligar og kolleger er baseret på de amfipatiske egenskaber af et manipuleret højt a-helisk scaffold protein fra apolipoprotein A1. De hydrofobe overflader af stillads-proteinet interagerer med fedtacyl sidekæder af lipiddobbeltlaget henviser polaregnene står det vandige miljø. Analyser af membranproteiner i nanodiscs har betydelige fordele i forhold liposom fordi partiklerne er små, ensartede og vandopløseligt. Endvidere kan biokemiske og biofysiske metoder normalt forbeholdt opløselige proteiner anvendes, og fra begge sider af membranen. I denne visuelle protokol, vi præsenterer en trin-for-trin rekonstituering af et godt kendetegnterized bakteriel ABC transportvirksomheden, mandlige-MalFGK 2-kompleks. Dannelsen af ​​skiven er en selvsamling proces, der afhænger af hydrofobe interaktioner, der finder sted ved den gradvise fjernelse af detergenten. Vi beskriver de væsentlige trin, og vi fremhæver betydningen af ​​at vælge en korrekt protein-til-lipidforhold for at begrænse dannelsen af ​​aggregater og større polydisperse liposom-lignende partikler. Simple kvalitetskontrol, såsom gelfiltreringschromatografi, nativ gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi sikre, at skiverne er blevet korrekt rekonstitueres.

Protocol

Samlet Rekonstitueringsprocessen

Rekonstitueringen starter ved blanding af membranen scaffold protein (MSP) med det oprensede MalFGK 2-kompleks i nærvær af detergent-solubiliserede phospholipider. Trinnet efterfulgt af langsom fjernelse af detergenten med et adsorberende polystyren materiale kaldet Bio-Beads eller Amberlite (figur 1). Den automatiske montage proces sker sandsynligvis på grund af de apolære interaktioner mellem de hydrofobe phospholipider, den MalFGK 2 komplekse og overfladen af MSP amfipatiske protein. Slutproduktet er en skiveformet partikel fremstillet af to molekyler af MSP indpakning omkring MalFGK 2-kompleks. Partiklerne skilles fra addukterne og aggregater ved ultracentrifugering og analytiske gelpermeationskromatografi. Partiklerne er kendetegnet ved nativ gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi.

title "> 1.. Fremstillinq af membranen Scaffold Protein, MSP

  1. Den his-mærket MSP (version MSP1D1 1) er fremstillet af plasmid pMSP1D1 i E. coli BL21 (DE3) induceret ved OD600 ~ 0,5 med 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid i 3 timer ved 37 ° C.
  2. Cellerne høstes ved centrifugering ved 5.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og resuspenderet i TSG10 puffer indeholdende 100 uM phenylmethansulfonylfluorid.
  3. Cellerne lyseres med en fransk presse (3x) ved 8000 psi, og det uopløselige materiale fjernes ved centrifugering ved 5000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Den opløselige fraktion indeholdende MSP isoleres ved ultra-centrifugering ved 125.000 x g i 45 minutter.
  4. MSP renses ved nikkel-chelaterende chromatografi under anvendelse af ~ 1,5 ml Ni-Sepharose HP i TSG10 puffer. Forurenende stoffer vaskes væk med TSG10 buffer indeholdende 50 mM imidazol. MSP elueres med TSG10 puffer indeholdende 600 mMimidazol. Det oprensede protein dialyseres i TSG10 puffer og opbevaret i -70 ° C ved en proteinkoncentration på ~ 10-15 mg / ml.

2. Fremstilling af MalFGK 2 Komplekse

  1. The MalFGK 2-kompleks, His-mærket ved C-terminalen af Malk, udtrykkes fra plasmid pBAD22-FGK i E. coli BL21 (DE3) og induceret ved OD600 ~ 0,5 med 0,2% L-arabinose i 3 timer ved 37 ° C.
  2. Efter cellelyse og centrifugering som i trin 1.3 er de membranpellet resuspenderet i TSG20 puffer ved en slutkoncentration på 5 mg / ml. Materialet solubiliseret med 1% vægt / volumen n-dodecyl-β-maltopyranoside (DDM) i 3 timer ved 4 ° C under forsigtig omrystning.
  3. Det uopløselige materiale fjernes ved ultra-centrifugering som i trin 1.3 og supernatanten indeholdende det solubiliserede MalFGK 2-kompleks opsamles og renses som i trin 1.4, men uden dialyse.
  4. Further oprensning opnås ved gelfiltreringskromatografi i TSGD puffer på en Superdex 200 HR 10/300 kolonne med en strømningshastighed på 0,5 ml / min.

3. Fremstilling af Phospholipider

  1. En E. coli total lipid ekstrakt opløst i chloroform adskilles i 1000 nmol alikvoter i skruelåg mikrofugerør. Opløsningsmidlet afdampes under en svag strøm af nitrogen og tørres yderligere natten over i en vakuum-exsikkator.
  2. Lipidfilmen opløses i TS-puffer ved 5 nM slutkoncentration og omhvirvledes kraftigt og lydbehandlet. De opløste lipider vises svagt uigennemsigtig på grund af deres generelle uopløselighed i vandig TS buffer, men de bør forblive i suspension. DDM tilsættes til en slutkoncentration på 0,5% (ca. 10 mM), ved hvilken opløsningen bliver klar.
  3. Lipidblandingen anbringes i et vandbad og puls sonikeret i 5 gange for ~ 5 sek. Lipidblandingen opbevares ved 4 ° C i maksimalt 1 week.

4. Fremstilling af Bio-Beads

  1. 10-15 ml (tør volumen) Bio-perler placeres i et 50 ml rør.
  2. Perlerne successivt vasket med 50 ml 100% methanol, 95% ethanol, milliQ H2O, og endelig TS-puffer (to gange hver).
  3. De vaskede perler opbevares ved 4 ° C i ~ 10 ml TS puffer.

5. Nanodisc Rekonstituering

  1. MSP fortyndes i TSGD puffer ved en slutkoncentration på ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
  2. ~ 2 nmol af oprenset MalFGK 2-kompleks blandes ved et protein: MSP: lipid forhold på 1:3:60 eller 1:3:400 i TSGD puffer. Den endelige koncentration er 6 uM MalFGK 2, 18 uM MSP og 360 pM lipider (1:3:60) eller 2,4 mm lipider (1:3:400). Slutvolumenet er 300 gl. Den endelige DDM koncentration er 0,08% (~ 1,6 mM). Den endelige koncentration af glycerol afhænger af mængden af ​​lipid tilsat men forbliver på ca 5-10% v / v. ~ 50 ul Bio-Bead suspension sættes til røret, og blandingen inkuberes natten over på en rokkende bord ved 4 ° C.
  3. Perlerne bundfældes ved tyngdekraft, og opløsningen pipetteres gennem en smal spids for at undgå så meget Bio-Beads som muligt.
  4. Store præcipitater fjernet ved ultracentrifugering ved 100.000 x g i 20 minutter. Skiverne renses ved gelfiltreringskromatografi som i trin 2,4 i TSG10 puffer. Fraktioner indeholdende skiverne samles og en aliquot bør reinjiceres på den samme gelfiltreringssøjle for at afprøve stabiliteten af ​​præparatet.
  5. De rensede plader kan opbevares ved -70 ° C i længere tidsrum. Efter optøning på is, bør skiverne udsættes for ultra-centrifugering som i trin 5.5 til fjernelse af potentialet præcipitater. En alikvot bør analyseres ved gelfiltreringskromatografi at sikre, at væsentlig aggregering eller udfældning ikke fandt sted under optøningproces.

6. Nativ gelelektroforese

  1. 1 uM af nanodiscs (~ 0,2 mg / ml) analyseres ved nativ PAGE 6, 7 (Tris-HCI pH 8,8, 4-12%) for at vurdere kvaliteten af rekonstitution (figur 3A).
  2. Bindingen af MalE (1 uM) til MalFGK 2-kompleks rekonstitueret i nanodiscs også vurderet ved nativ PAGE (fig. 3A).
  3. Efter elektroforese er gelen farvet med Coomassie blue i 10 minutter, og affarvet i ~ 1 time.

7. Dynamisk lysspredning (DLS)

  1. Nanodiscs oprenses ved gelfiltreringskromatografi som i trin 2.4 i TSG10 puffer under anvendelse af en Superdex 200 HR 10/300 søjle ved en strømningshastighed på 0,1 ml / min. Fraktioner indeholdende nanodiscs samles og koncentreres til ~ 10 mg / ml med en Amicon centrifugal filter.
  2. Prøven filtreres to gange (0,22 um filter) før analyse ved DLS under anvendelsea DynaPro nanostar instrument (Wyatt Technology) i en 1 ul indre volumen kvartskuvette. Data er monteret ved hjælp af DYNAMICS software (Wyatt Technology) at anslå diameter og molekylvægten af ​​partiklerne.

8. ATPase Målinger

  1. ATPase-aktiviteten af MalFGK 2-rekonstituerede nanodiscs bestemmes under anvendelse af et kolorimetrisk assay 8.
  2. 1 uM af oprensede diske og 1 mM ATP blandes sammen med stigende mængder af mandlige og inkuberet ved 37 ° C i 20 min. Frigivelsen af ​​uorganisk phosphat måles ved 660 nm.
  3. Mængden af ​​frigjort phosphat i forhold til en standardkurve frembragt med en Fosfor Standardopløsning.

9. Repræsentative resultater

De nanodiscs oprenses ved gelfiltreringskromatografi (figur 2A, venstre). Chromatogrammet viser, at størstedelen af ​​den rekonstituerede dindividuelle servicekontrakter (black trace) elueres som en enkelt top, mens skiver fremstillet med overskydende lipider (red trace) eluerer i det tomme volumen og som en række brede toppe. Kvaliteten af ​​de nanodiscs yderligere analyseret ved nativ gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi (DLS). Korrekt rekonstituerede diske migrerer som et skarpt bånd på gelen mens de rekonstituerede i nærvær af et overskud af lipider migrerer som et smear (figur 2A, højre). Analyse ved DLS viser, at disken population er homogen med en gennemsnitlig diameter på 11,4 nm (figur 2B). De rekonstituerede diske har en tilsyneladende molekylvægt på 215 kDa baseret på DLS tilnærmelse. Prøver rekonstitueres i nærvær af overskydende lipider display udbredt radier omkring 100 nm, hvilket er typisk for ikke-homogene prøver.

Kvaliteten af MalFGK to komplekset bestemmes ved nativ gelelektroforese og dens aktivitet ved ATPasemålinger (figur 3). Maltosebindingsproteinet MalE binder med høj affinitet til MalFGK to transportøren 9, 10. Anvendelse af ikke-denaturerende gelelektroforese, er det muligt at detektere et kompleks mellem MalE og MalFGK 2 (figur 3A). Stimulering af Malk 2 ATPase aktivitet ved MalE er vist i figur 3B.

Figur 1
Figur 1. Typisk rutediagram for rekonstituering protokol.

Figur 2
Figur 2. Kvalitetskontrol af nanodisc præparat. A. Gelfiltreringsanalyse (Superdex 200 HR 10/300 søjle) af nanodiscs rekonstitueret ved lav lipidforhold (1/3/60, black trace) eller høj lipidforhold (1/3/400, red trace). Nativ gelelektroforese af den samme disk præparatet. Molecular vægtmarkører i kDa er indikeret. B. Dynamisk lysspredning analyse af den samme disk forberedelse. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Analyse af MalFGK 2-nanodisc partikler. A. Gel shift analyse af mandlige inkuberet med stigende mængder af MalFGK 2-nanodisc partikler. B. ATPase aktivitet af MalFGK 2-nanodisc partikler som en funktion af MalE koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en enkel procedure til rekonstituering af maltose transportør i nanodiscs. Transportvirksomheden er ATPase aktiv og samspillet med det opløselige bindingspartner MalE kan genskabes (Figur 3). Den vellykkede rekonstituering af transportøren i nanodiscs bane vej for yderligere biofysiske og biokemiske analyser. Af særlig interesse vil være en systematisk analyse af Malk ATPase og maltose transport aktivitet i vaskemiddel, liposom og nanodiscs. ABC-transportører ændrer konformationer under transporten cyklus, mens bidraget fra lipider på disse konformationelle ændringer endnu ikke blevet undersøgt.

Fremsættelsen af ​​nanodisc er relativt enkel, men alligevel små afvigelser fra optimale betingelser kan føre til uoprettelige proteinaggregering. I denne rapport understreger vi vigtigheden af ​​at vælge en korrekt protein: lipidforhold fordi en overskydende mængde af lipider vil føre til production store polydisperse liposom-lignende partikler, som ikke reagerer på den biofysiske kvalificering af en nanodisc. En tidligere analyse anvendes meget høj MSP: lipider forhold til rekonstituering af maltose transportøren (1/120 i forhold til 1/20 i analysen), men de dannede partikler ikke blev yderligere karakteriseret 11. Under alle omstændigheder er det vigtigt nøje at undersøge kvaliteten af ​​det rekonstituerede materiale ved anvendelse af andre teknikker end gelfiltrering, såsom lysspredning spektroskopi, analytisk ultracentrifugering eller mere enkelt, nativ gelelektroforese. Betydningen af denne kvalitetskontrol blev det fremhævet på rekonstituering af bacteriorhodopsin og P-glycoprotein 12. To andre parametre kan kraftigt påvirke succes opløsning: 1) renheden af ​​målmembranen protein og fravær af aggregater og 2) det korrekte forhold mellem membranprotein og stillads protein. Desuden inkorporeres typen af ​​phospholipid into disken, såvel som længden af ​​membranen scaffold protein, kan bidrage til effektiviteten af ​​rekonstituering. Andre parametre, såsom opløselighed og stabilitet af membranprotein i detergentopløsning, puffersystemet, temperatur og tid-længde rekonstitution kan også være nødvendigt at justere ved optimering af rekonstituering protokollen. For eksempel producerer membran-stillads-proteiner af forskellig længde nanodiscs af forskellig størrelse 1, som kan hjælpe til rekonstituering af store membranprotein-komplekser eller membranprotein-oligomerer.

Det nanodisc er blevet kombineret med biofysiske metoder såsom SPR, ITC, og fluorescens spektroskopi 12-16 for at hjælpe membran forskning, der kæmper med kvantitativ metode. For nylig er det nanodisc blevet kombineret med kvantitativ massespektrometri til at identificere membranprotein interactomes med bedre dækning og nøjagtighed17. Den farmaceutiske industri har været begrænset af de samme vanskeligheder, der plager den akademiske verden i at studere membranproteiner, selvom det er faktum, at de hyppigst ordineret medicin target membranproteiner (receptorer, kanaler, transportører, sensorer). Det kan forudses, at nanodisc vil hjælpe udvikling af lægemiddelscreeningsprogrammer strategier, der beskæftiger sig med membran indlejret proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institute of Health Research. CSC blev finansieret af et postdoc-stipendium fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. FD er en Tier II Canada Research Chair.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter Millipore UFC805008 Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent Bio-Rad 152-3920
E. coli total lipids Avanti Polar Lipids 100500C Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin GE Healthcare 17-5268-01
Phosphorous standard solution Sigma-Aldrich P3869
pMSP1D1 Addgene 20061
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare 17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments
DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C
MalFGK2 stock 1-2 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at -70 °C after purification
MSP stock 10-15 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles
Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids
0.5% w/v (10 mM) DDM
50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C for 1 week
TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C
TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8
100 mM NaCl
20% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at 4 °C and add DDM just before use

Table II. Solution recipes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).
  2. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).
  3. Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment. J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).
  4. Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA. EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).
  5. Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs. Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).
  6. Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).
  7. Dalal, K., Duong, F. Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs. Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).
  8. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).
  9. Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).
  10. Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action. Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).
  11. Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).
  12. Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs. Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).
  13. Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies. Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).
  14. Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks. Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).
  15. Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs. Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).
  16. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Cytochromes P450 in Nanodiscs. Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).
  17. Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome. J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).

Tags

Nanodiscs membranproteiner lipider ABC Transporter maltose transportør MalFGK
En trin-for-trin metode til at rekonstituere en ABC Transporter ind i Nanodisc lipidpartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A… More

Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. J. Vis. Exp. (66), e3910, doi:10.3791/3910 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter