Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes

Published: August 31, 2012 doi: 10.3791/3910
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

Summary

Nanodiscs zijn kleine discoïde deeltjes die membraaneiwitten te nemen in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. We een visuele protocol dat de stap-voor-stap opname van de MalFGK2 transporter in een schijf toont.

Abstract

De nanodisc is een schijfvormige deeltje (~ 10 tot 12 nm groot) die val membraaneiwitten in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. De nanodisc is zeer aantrekkelijk voor het bestuderen membraaneiwitten, met name in de context van ligand-receptor interacties. De methode ontwikkeld door Sligar en collega's is gebaseerd op de amfipatische eigenschappen van een sterk ontwikkelde a-helix scaffold eiwitten die afkomstig apolipoproteïne A1. De hydrofobe oppervlakken van de scaffold proteïne interactie met de vetacylgroepen zijketens van de lipide dubbellaag terwijl de poolgebieden maken het waterige milieu. Analyses van membraaneiwitten in nanodiscs duidelijk voordelen bieden liposoom omdat de deeltjes klein, homogeen en water oplosbaar. Bovendien kunnen biochemische en biofysische methoden gewoonlijk gereserveerd oplosbare eiwitten worden toegepast en aan beide zijden van het membraan. In deze visuele protocol we een stap-voor-stap reconstitutie van een goed tekensgekarakteriseerd bacteriële ABC transporter, de man-MalFGK 2 complex. De vorming van de schijf een zelf-assemblage proces dat afhangt van hydrofobe interacties die plaatsvinden tijdens de geleidelijke verwijdering van het detergens. We beschrijven de essentiële stappen en we wijzen op het belang van het kiezen van een juiste eiwit-lipide naar verhouding om de vorming van aggregaten en grotere polydisperse liposoom-achtige deeltjes te beperken. Eenvoudige kwaliteitscontroles zoals gelfiltratiechromatografie, native gel elektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie ervoor dat de schijven correct zijn opgelost.

Protocol

Algemeen Reconstitutie Proces

De reconstitutie proces begint met het mengen van het membraan scaffold proteïne (MSP) met het gezuiverde MalFGK 2 complex in de aanwezigheid van detergens-gesolubiliseerde fosfolipiden. De stap wordt gevolgd door de langzame verwijdering van het detergens door een adsorberend polystyreen materiaal genaamd Bio-Beads of Amberlite (figuur 1). De auto-assemblageproces komt meest waarschijnlijk door de apolaire interacties tussen de hydrofobe fosfolipiden, de MalFGK 2 complex en het oppervlak van de MSP amfipatische eiwit. Het eindproduct is een schijfvormige deeltjes uit twee moleculen MSP wikkelen rond de MalFGK 2 complex. De deeltjes worden gescheiden van de adducten en aggregaten door ultra-centrifugatie en analytische size-exclusion chromatografie. De deeltjes worden gekenmerkt door natieve gelelektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie.

titel "> 1. Voorbereiding van de membraan steiger Protein, MSP

  1. De his-gelabeld MSP (versie MSP1D1 1) wordt geproduceerd uit plasmide in E. pMSP1D1 coli BL21 (DE3) geïnduceerd bij OD600 ~ 0,5 met 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  2. De cellen worden geoogst door centrifugatie bij 5000 g gedurende 10 min bij 4 ° C en geresuspendeerd in TSG10 buffer die 100 uM phenylmethanesulfonyl fluoride.
  3. De cellen worden gelyseerd met een Franse pers (3x) bij 8.000 psi en het onoplosbare materiaal wordt verwijderd door centrifugeren bij 5000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. De oplosbare fractie die het MSP geïsoleerd door ultra-centrifugatie bij 125.000 xg gedurende 45 minuten.
  4. Het MSP wordt gezuiverd door nikkel-chelerende chromatografie met ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP in TSG10 buffer. Verontreinigingen worden weggespoeld met TSG10 buffer die 50 mM imidazool. Het MSP wordt geëlueerd met TSG10 buffer bevattende 600 mMimidazool. Het gezuiverde eiwit wordt gedialyseerd in TSG10 buffer en opgeslagen in -70 ° C bij een eiwitconcentratie van ~ 10-15 mg / ml.

2. Voorbereiding van de MalFGK 2 Complex

  1. De MalFGK 2 complex, his-tag aan de C-terminus van MÄLK, uitgedrukt uit plasmide pBAD22-FGK in E. coli BL21 (DE3) en geïnduceerd bij OD 600 ~ 0,5 met 0,2% L-arabinose gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  2. Na cellysis en centrifugeren zoals in stap 1.3, wordt het membraan pellet geresuspendeerd in TSG20 buffer bij een eindconcentratie van 5 mg / ml. Het materiaal wordt opgelost met 1% w / v n-dodecyl-β-maltopyranoside (DDM) gedurende 3 uur bij 4 ° C onder zachtjes schudden.
  3. Het onoplosbare materiaal wordt verwijderd door ultra-centrifugatie zoals in stap 1.3 en de supernatant met het opgeloste MalFGK 2 complex wordt verzameld en gezuiverd zoals in stap 1.4, zonder dialyse.
  4. Further zuivering wordt bereikt door gelfiltratiechromatografie in TSGD buffer op een Superdex 200 HR 10/300 kolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min.

3. Bereiding van Fosfolipiden

  1. Een E. coli totale lipide extract opgelost in chloroform wordt gescheiden in 1000 nmol porties in schroefdop microcentrifugebuizen. Het oplosmiddel wordt verdampt onder een zachte stikstofstroom en vervolgens een nacht gedroogd in een vacuüm exsiccator.
  2. De lipidefilm werd opgelost in TS buffer bij 5 nM eindconcentratie en gevortext krachtig en gesoniceerd. De opgeloste lipiden ziet er iets ondoorzichtige vanwege hun algemene onoplosbaarheid in water TS buffer, maar blijven in suspensie. DDM wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% (~ 10 mM), waarbij de oplossing helder wordt.
  3. Het lipidemengsel wordt in een waterbad en pulse gesonificeerd 5 keer ~ 5 sec. Het lipidemengsel wordt opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.

4. Voorbereiding van Bio-Beads

  1. Ongeveer 10-15 ml (droog volume) Bio-Beads is geplaatst in een 50 ml buis.
  2. De kralen worden achtereenvolgens gewassen met 50 ml 100% methanol, 95% ethanol, milliQ H 2 O en tenslotte TS buffer (tweemaal elk).
  3. De gewassen korrels werden bewaard bij 4 ° C in ongeveer 10 ml TS buffer.

5. Nanodisc Reconstitutie

  1. Het MSP wordt verdund in buffer TSGD de eindconcentratie van ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
  2. ~ 2 nmol gezuiverd MalFGK 2 complex worden gemengd bij een eiwit: MSP: lipide-verhouding van 1:3:60 of 1:3:400 in TSGD buffer. De eindconcentratie is 6 uM MalFGK 2, 18 uM MSP en 360 uM lipiden (1:3:60) of 2,4 mM lipiden (1:3:400). Het eindvolume is 300 pl. De uiteindelijke concentratie DDM 0,08% (~ 1,6 mM). De eindconcentratie van glycerol afhankelijk van de hoeveelheid lipide toegevoegd maar blijft ongeveer 5-10% v / v. ~ 50 pi Bio-Bead suspensie wordt aangebracht op de buis en het mengsel wordt een nacht geïncubeerd op een schommelende tafel bij 4 ° C.
  3. De kralen worden gesedimenteerd door zwaartekracht en de oplossing wordt gepipetteerd door een smalle punt zoveel Bio-Beads vermijden mogelijk.
  4. Grote precipitaten worden verwijderd door ultra-centrifugatie bij 100.000 xg gedurende 20 minuten. De schijven worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie zoals in stap 2.4 in TSG10 buffer. Fracties die de schijven worden samengevoegd en een monster opnieuw worden geïnjecteerd op dezelfde gelfiltratiekolom de stabiliteit van het prepareren.
  5. De gezuiverde schijven kunnen bij -70 ° C gedurende langere tijd. Na ontdooien op ijs, moet de schijven worden onderworpen aan ultra-centrifugeren zoals in stap 5,5 tot verwijdering van potentiële neerslaat. Een aliquot wordt geanalyseerd door gelfiltratiechromatografie opdat significante aggregatie of precipitatie niet tijdens het ontdooienproces.

6. Inheemse Gel Elektroforese

  1. 1 uM nanodiscs (-0,2 mg / ml) worden geanalyseerd door natieve PAGE 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) de kwaliteit van de reconstitutie (figuur 3A) te beoordelen.
  2. De binding van MalE (1 uM) aan de MalFGK 2-complex opgelost in nanodiscs wordt ook beoordeeld via natieve-PAGE (Figuur 3A).
  3. Na elektroforese wordt de gel gekleurd met Coomassie blauw gedurende 10 minuten, en ontkleurd voor ~ 1 uur.

7. Dynamic Light Scattering (DLS)

  1. Nanodiscs worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie zoals in stap 2.4 in TSG10 buffer met een Superdex 200 HR 10/300 kolom met een stroomsnelheid van 0,1 ml / min. Fracties die nanodiscs worden samengevoegd en geconcentreerd tot ~ 10 mg / ml met een Amicon centrifugaal filter.
  2. Het monster wordt twee keer gefilterd (0,22 urn filter) vóór analyse met behulp DLSeen Dynapro nanostar instrument (Wyatt Technology) in een 1 ul inwendig volume quartz cuvette. Gegevens worden bevestigd met de DYNAMICS software (Wyatt Technology) de diameter en het molecuulgewicht van de deeltjes schatten.

8. ATPase Afmetingen

  1. De ATPase-activiteit van MalFGK 2-gereconstitueerde nanodiscs wordt bepaald met een colorimetrische assay 8.
  2. 1 uM gezuiverd discs en 1 mM ATP gemengd met toenemende hoeveelheden MalE en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. De vrijgave van anorganisch fosfaat wordt gemeten bij 660 nm.
  3. De hoeveelheid afgegeven fosfaat vergeleken met een standaardcurve gegenereerd met een fosfor standaardoplossing.

9. Representatieve resultaten

De nanodiscs worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie (Figuur 2A links). Het chromatogram toont aan dat de meerderheid van de gereconstitueerde dISC (zwarte trace) elueren als een enkele piek, terwijl schijven gemaakt met overmaat lipiden (rood spoor) elueren in het lege volume en als een reeks van brede pieken. De kwaliteit van de nanodiscs wordt verder geanalyseerd door natieve gelelektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie (DLS). Goed opgeloste discs migreren als een scherpe band op de gel dat de gereconstitueerde in aanwezigheid van een overmaat lipiden migreren als uitstrijkje (Figuur 2A rechts). Analyse door DLS blijkt dat de disc populatie homogeen met een gemiddelde diameter van 11,4 nm (Figuur 2B). De gereconstitueerde schijven hebben een schijnbaar molecuulgewicht van 215 kDa op basis van de onderlinge DLS. Monsters gereconstitueerd in aanwezigheid van overmaat lipiden vertoning wijdverspreid radii ongeveer 100 nm, typisch voor niet-homogene monsters.

De kwaliteit van de MalFGK 2 complex wordt bepaald door native gel elektroforese en ATPase activiteit doormetingen (figuur 3). De maltosebindingsproteïne MalE bindt met een hoge affiniteit aan de MalFGK 2 transporter 9, 10. Behulp van niet-denaturerende gelelektroforese, is het mogelijk te detecteren een complex tussen mannelijke en MalFGK 2 (Figuur 3A). Het stimuleren van de MÄLK 2 ATPase activiteit van MalE wordt getoond in figuur 3B.

Figuur 1
Figuur 1. Typisch stroomschema voor de reconstitutie-protocol.

Figuur 2
Figuur 2. Kwaliteitscontrole van de nanodisc voorbereiding. A. Gelfiltratie-analyse (Superdex 200 HR 10/300 kolom) van de nanodiscs opgelost bij lage lipide-ratio (1/3/60; zwart spoor) of hoge lipide ratio (1/3/400; rode spoor). Natieve gelelektroforese van dezelfde schijf preparaat. Molecular gewicht markers in kDa zijn aangegeven. B. Dynamische lichtverstrooiing analyse van dezelfde disc voorbereiding. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Analyse van de MalFGK 2-nanodisc deeltjes. A. Gel shift analyse van MalE geïncubeerd met toenemende hoeveelheden MalFGK 2-nanodisc deeltjes. B. ATPase activiteit van de MalFGK 2-nanodisc deeltjes als functie van MalE concentratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de reconstructie van de maltose transporter in nanodiscs. De transporteur is ATPase actief en de interactie met de oplosbare bindingspartner MalE opnieuw kunnen worden (figuur 3). De succesvolle reconstructie van de vervoerder in nanodiscs opent de weg voor extra biofysische en biochemische analyse. Van bijzonder belang is de systematische analyse zijn de MÄLK ATPase en maltose transport activiteit in wasmiddel, liposoom en nanodiscs. ABC-transporters wijzigen conformaties tijdens het transport cyclus, maar de bijdrage van lipiden om deze conformationele veranderingen moeten nog worden onderzocht.

Het maken van de nanodisc is relatief eenvoudig, maar toch kleine afwijkingen van optimale condities kan leiden tot eiwitaggregatie onomkeerbare. In dit rapport hebben we benadrukken het belang van het kiezen van een juiste eiwit: vet-verhouding, omdat een overmaat lipiden zal leiden tot de production grote polydisperse liposoom-achtige deeltjes die niet reageren op de biofysische kwalificatie van een nanodisc. Een eerdere analyse toegepast hoge MSP: lipiden verhouding voor de reconstitutie van de maltose transporter (1/120 ten opzichte van 1/20 in de analyse), maar gevormde deeltjes werden niet verder gekarakteriseerd 11. In ieder geval is het cruciaal om zorgvuldige analyse van de kwaliteit van het bereide materiaal met andere technieken dan gelfiltratie, zoals lichtverstrooiing spectroscopie, analytische ultracentrifugatie of eenvoudiger, native gel elektroforese. Het belang van deze kwaliteitscontrole werd benadrukt tijdens de reconstructie van bacteriorhodopsin en P-glycoproteïne 12. Twee andere parameters kunnen grote invloed hebben het succes van de reconstitutie: 1) de zuiverheid van het doelwit membraan eiwit en de afwezigheid van aggregaten en 2) de juiste verhouding tussen membraaneiwit en scaffold proteïne. Bovendien het type fosfolipide opgenomen into de schijf, en de lengte van het membraan scaffold proteïne kan bijdragen aan de efficiëntie van de reconstitutie. Andere parameters zoals oplosbaarheid en stabiliteit van de membraaneiwit in reinigingsmiddel het buffersysteem, de temperatuur en tijd-lengte van de reconstitutie kan ook moeten worden aangepast wanneer optimale reconstitutie protocol. Bijvoorbeeld membraan scaffold proteïnen van verschillende lengtes produceren nanodiscs van verschillende grootte 1, dat de reconstitutie van grotere membraaneiwit complexen membraaneiwit oligomeren kan helpen.

De nanodisc is met succes gecombineerd met biofysische methoden zoals SPR, ITC, en fluorescentie spectroscopie 12 tot 16 te membraan onderzoek dat kampt met kwantitatieve methodologie te helpen. Recent is de nanodisc gecombineerd met kwantitatieve massaspectrometrie helpen bij het identificeren membraaneiwit interactomen betere dekking en nauwkeurigheid17. De farmaceutische industrie wordt beperkt door dezelfde problemen die pest in academische studie membraaneiwitten, hoewel het feit dat de meest voorgeschreven geneesmiddelen doel membraaneiwitten (receptoren, kanalen, transporters, sensoren). Het kan worden voorspeld dat de nanodisc zal de ontwikkeling van drug screening strategieën die werken met membraan ingebedde eiwitten helpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institute of Health Research. CSC werd gefinancierd door een postdoctoraal fellowship van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada. FD is een Tier II Canada Research Chair.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter Millipore UFC805008 Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent Bio-Rad 152-3920
E. coli total lipids Avanti Polar Lipids 100500C Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin GE Healthcare 17-5268-01
Phosphorous standard solution Sigma-Aldrich P3869
pMSP1D1 Addgene 20061
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare 17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments
DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C
MalFGK2 stock 1-2 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at -70 °C after purification
MSP stock 10-15 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles
Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids
0.5% w/v (10 mM) DDM
50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C for 1 week
TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C
TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8
100 mM NaCl
20% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at 4 °C and add DDM just before use

Table II. Solution recipes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).
  2. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).
  3. Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment. J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).
  4. Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA. EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).
  5. Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs. Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).
  6. Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).
  7. Dalal, K., Duong, F. Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs. Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).
  8. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).
  9. Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).
  10. Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action. Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).
  11. Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).
  12. Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs. Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).
  13. Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies. Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).
  14. Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks. Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).
  15. Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs. Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).
  16. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Cytochromes P450 in Nanodiscs. Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).
  17. Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome. J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).

Tags

Probleem 66 nanodiscs membraan eiwitten lipiden ABC transporter maltose transporter MalFGK
Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A… More

Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. J. Vis. Exp. (66), e3910, doi:10.3791/3910 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter