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Biology

Une méthode étape par étape pour la reconstitution d'un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

Published: August 31, 2012 doi: 10.3791/3910

Summary

NANODISQUES sont de petites particules discoïdes qui incorporent des protéines membranaires dans un petit lopin de bicouche phospholipidique. Nous fournir un protocole visuelle montre que l'incorporation étape par étape du transporteur MalFGK2 dans un disque.

Abstract

Le nanodisc est une particule en forme de disque (~ 10-12 nm grande) que les protéines membranaires piège dans une petite parcelle de bicouche phospholipidique. Le nanodisc est une option particulièrement intéressante pour l'étude des protéines membranaires, en particulier dans le contexte de interactions ligand-récepteur. Le procédé mis au point par Sligar et ses collaborateurs est basée sur les propriétés amphipathiques d'une ingénierie très une hélice protéine extraite de l'échafaudage apolipoprotéines A1. Les faces hydrophobes de la protéine d'échafaudage interagir avec les acyles gras des chaînes latérales de la bicouche lipidique, alors que les régions polaires face à l'environnement aqueux. L'analyse des protéines membranaires ont NANODISQUES avantages significatifs par rapport liposome, car les particules sont petites, homogène et soluble dans l'eau. En outre, les méthodes biochimiques et biophysiques normalement réservés à des protéines solubles peuvent être appliqués, et de part et d'autre de la membrane. Dans ce protocole visuelle, nous présentons une reconstitution étape par étape, d'un caractère bientérisée transporteur ABC bactérien, le mâle-MalFGK complexe 2. La formation du disque est un processus d'auto-assemblage qui dépend des interactions hydrophobes qui ont lieu au cours de l'élimination progressive du détergent. Nous décrivons les étapes essentielles et nous soulignons l'importance de choisir un bon protéine-lipide rapport afin de limiter la formation d'agrégats et les grands polydisperses liposomes comme des particules. Contrôle qualité simples telles que la chromatographie de filtration sur gel, l'électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière en sorte que les disques ont été correctement reconstitué.

Protocol

Processus de reconstitution globale

Le processus de reconstitution commence par mélanger la protéine d'échafaudage membranaire (MSP) avec le complexe purifié MalFGK 2 en présence d'un détergent-solubilisées phospholipides. L'étape est suivie de l'élimination lente de la lessive par un matériau adsorbant en polystyrène appelé Bio-Beads ou Amberlite (figure 1). Le processus d'auto-assemblage se produit probablement en raison des interactions entre les phospholipides apolaires hydrophobes, le 2 MalFGK complexes et la surface de la protéine MSP amphipathique. Le produit final est une particule discoïde composé de deux molécules d'emballage MSP à travers le MalFGK complexe 2. Les particules sont séparées des produits d'addition et d'agrégats par ultra-centrifugation analytique et chromatographie d'exclusion stérique. Les particules sont caractérisées par une électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière.

titre "> 1. Préparation de la membrane des protéines d'échafaudage, MSP

  1. Le son MSP-marqué (version MSP1D1 1) est produit à partir du plasmide dans E. pMSP1D1 coli BL21 (DE3) induite à DO 600 ~ 0,5 avec 0,5 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside pendant 3 heures à 37 ° C.
  2. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 5000 xg pendant 10 min à 4 ° C et remises en suspension dans TSG10 tampon contenant 100 uM fluorure de phénylméthanesulfonyle.
  3. Les cellules sont lysées avec une presse française (3x) à 8.000 livres par pouce carré et l'insoluble est éliminé par centrifugation à 5000 xg pendant 10 min à 4 ° C. La fraction soluble contenant la MSP est isolé par ultracentrifugation à 125.000 g pendant 45 min.
  4. Le MSP est purifié par chromatographie de chélation nickel en utilisant ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP TSG10 tampon. Contaminants sont éliminés par lavage avec TSG10 tampon contenant 50 mM d'imidazole. Le MSP est éluée avec un tampon contenant TSG10 600 mMimidazole. La protéine purifiée est dialysée dans un tampon TSG10 et stocké dans -70 ° C à une concentration en protéine de ~ 10-15 mg / ml.

2. Préparation de la MalFGK 2 Complexe

  1. Le 2 MalFGK complexe, sa-marquées à l'extrémité C-terminale de MalK, est exprimée à partir du plasmide pBAD22-FGK dans E. coli BL21 (DE3) et induit à DO 600 ~ 0,5 avec 0,2% de L-arabinose pendant 3 heures à 37 ° C.
  2. Suite à la lyse des cellules et centrifugation comme dans l'étape 1,3, le culot est remis en suspension dans la membrane TSG20 tampon à une concentration finale de 5 mg / ml. Le matériau est solubilisé à 1% p / v de n-dodécyl-β-maltopyranoside (DDM) pendant 3 heures à 4 ° C sous agitation douce.
  3. L'insoluble est éliminé par ultra-centrifugation comme à l'étape 1.3 et le surnageant contenant le solubilisée 2 MalFGK complexe est recueilli et purifié comme à l'étape 1,4, mais sans dialyse.
  4. Further purification est réalisée par chromatographie par filtration sur gel dans un tampon TSGD sur une colonne Superdex 200 HR 10/300 de colonne à un débit de 0,5 ml / min.

3. Préparation des phospholipides

  1. Un E. coli lipidique totale extraire dissous dans du chloroforme est séparée en 1.000 nmol aliquotes dans des tubes à centrifuger de vis d'assemblage. Le solvant est évaporé sous un léger courant d'azote et séché encore pendant une nuit dans un dessiccateur sous vide.
  2. Le film lipidique est dissoute dans un tampon TS à une concentration de 5 nM final et vortexé vigoureusement et ultrasons. Les lipides dissous apparaîtra légèrement opaque en raison de leur insolubilité générale dans le tampon TS aqueuse, mais ils doivent rester en suspension. DDM est ajouté à une concentration finale de 0,5% (~ 10 mM), à laquelle la solution devient claire.
  3. Le mélange de lipides est placé dans un bain d'eau et d'impulsions ultrasons pendant 5 heures à ~ 5 sec. Le mélange de lipides est stocké à 4 ° C pendant un maximum de 1 week.

4. Préparation de Bio-Beads

  1. Environ 10-15 ml (volume sec) Bio-Beads est placé dans un tube de 50 ml.
  2. Les perles sont lavées successivement avec 50 ml de méthanol à 100%, éthanol à 95%, milliQ H 2 O, et enfin tampon TS (deux fois).
  3. Les billes lavées sont conservés à 4 ° C dans 10 ml de tampon ~ TS.

5. Reconstitution Nanodisc

  1. Le MSP est dilué dans du tampon TSGD à la concentration finale d'environ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
  2. ~ 2 nmol de 2 purifié MalFGK complexe sont mélangés à une protéine: PVC: lipide rapport 1:3:60 ou dans un tampon TSGD 1:3:400. La concentration finale est de 6 uM MalFGK 2, 18 uM MSP et les lipides pM 360 (1:3:60) ou 2,4 mM de lipides (1:3:400). Le volume final est de 300 ul. La concentration finale est DDM 0,08% (~ 1,6 mM). La concentration finale en glycérol dépend de la quantité de lipide ajouté mais reste autour de 5-10% v / v ~ 50 pi de Bio-perle suspension est ajouté dans le tube et le mélange est incubé pendant une nuit sur une table à bascule à 4 ° C.
  3. Les billes sont sédimentées par gravité et la solution est introduit à la pipette à travers une pointe étroite à éviter autant Bio-Beads que possible.
  4. Gros précipités sont éliminés par ultra-centrifugation à 100.000 xg pendant 20 min. Les disques sont purifiées par chromatographie par filtration sur gel comme à l'étape de 2,4 TSG10 tampon. Les fractions contenant les disques sont mis en commun et une partie aliquote doit être réinjecté dans la colonne de filtration sur gel même de vérifier la stabilité de la préparation.
  5. Les disques purifiés peuvent stocké à -70 ° C pendant une période de temps prolongée. Après le dégel de la glace, les disques doivent être soumis à l'ultra-centrifugation comme à l'étape 5.5 à retirer potentiel précipités. Une aliquote doit être analysé par chromatographie de filtration sur gel afin de s'assurer que l'agrégation ou une précipitation importante n'a pas eu lieu lors de la décongélationprocessus.

6. Électrophorèse sur gel natif

  1. 1 uM de NANODISQUES (~ 0,2 mg / ml) sont analysés par PAGE native 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) pour évaluer la qualité de la reconstitution (figure 3A).
  2. La liaison de l'Homme (1 uM) à la 2-complexe MalFGK reconstitué dans NANODISQUES est également évalué en natif-PAGE (figure 3A).
  3. Après électrophorèse, le gel est coloré au bleu de Coomassie pendant 10 min, et décolorés pendant ~ 1 heure.

7. Diffusion de la lumière dynamique (DLS)

  1. NANODISQUES sont purifiées par chromatographie par filtration sur gel comme dans l'étape 2,4 à l'aide d'un tampon TSG10 Superdex 200 HR 10/300 de colonne à un débit de 0,1 ml / min. Les fractions contenant NANODISQUES sont réunies et concentrées à environ 10 mg / ml avec un filtre Amicon centrifuge.
  2. L'échantillon est filtré deux fois (0,22 um filtre) avant l'analyse par DLS utilisantun DynaPro nanostar instrument (Wyatt Technology) dans un volume intérieur 1 pl cuvette en quartz. Les données s'effectue à l'aide du logiciel DYNAMIQUE (Wyatt Technology) pour estimer le diamètre et le poids moléculaire des particules.

8. Mesures ATPase

  1. L'activité ATPase de MalFGK 2-reconstituées NANODISQUES est déterminée en utilisant un dosage colorimétrique 8.
  2. 1 uM de disques purifiés et 1 mM d'ATP sont mélangés avec des quantités croissantes de MalE et incubées à 37 ° C pendant 20 minutes. La libération de phosphate inorganique est mesurée à 660 nm.
  3. La quantité de phosphate libéré est comparée à une courbe d'étalonnage générée avec une solution standard de phosphore.

9. Les résultats représentatifs

Les NANODISQUES sont purifiés par chromatographie de filtration sur gel (Figure 2A, à gauche). Le chromatogramme montre que la majorité de la reconstitution dCSI (trace noire) éluer forme d'un pic unique, tandis que les disques à base de lipides en excès (rouge trace) éluent dans le volume de vide et comme une série de pics larges. La qualité des NANODISQUES est ensuite analysée par électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie diffusion de la lumière (DLS). Disques correctement reconstitué migrer comme une bande nette sur le gel alors que ceux reconstitué en présence d'un excès de lipides comme un test de migration (figure 2A, à droite). Analyse par DLS montre que la population est homogène disque avec un diamètre moyen de 11,4 nm (Figure 2B). Les disques reconstituées ont un poids moléculaire apparent de 215 kDa sur la base de l'approximation DLS. Les échantillons reconstitués en présence d'excès de lipides affichage largement distribué rayons autour de 100 nm, ce qui est typique pour les échantillons non homogènes.

La qualité de la MalFGK complexe 2 est évaluée par électrophorèse sur gel natif et son activité ATPase parmesures (figure 3). Le mâle protéine liant le maltose se lie avec une haute affinité pour le transporteur 2 MalFGK 9, 10. Utilisation non électrophorèse sur gel dénaturant, il est possible de détecter un complexe entre l'homme et MalFGK 2 (figure 3A). La stimulation de l'activité ATPase MalK 2 par mâle est montré sur la figure 3B.

Figure 1
Figure 1. Organigramme type pour le protocole de reconstitution.

Figure 2
Figure 2. Contrôle de la qualité de la préparation nanodisc. A. Analyse par filtration sur gel (Superdex 200 HR 10/300 colonnes) des NANODISQUES reconstitué à lipide faible (03/01/60; trace noire) ou le taux de lipides élevé (1/3/400; trace rouge). Électrophorèse sur gel natif de la préparation même disque. Molmarqueurs de poids ecular à kDa sont indiquées. B. Analyse dynamique diffusion de la lumière de la préparation même disque. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. L'analyse de la MalFGK 2-nanodisc particules. A. L'analyse de retard sur gel de MalE incubés avec des quantités croissantes de MalFGK 2-nanodisc particules. B. ATPase de la MalFGK 2-nanodisc particules en fonction de la concentration de sexe masculin.

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Discussion

Nous décrivons une procédure simple pour la reconstitution du transporteur maltose en NANODISQUES. Le transporteur est ATPase active et l'interaction avec le mâle partenaire de liaison soluble peut être recréé (figure 3). La reconstitution réussie du transporteur en NANODISQUES ouvrir la voie à l'analyse biophysique et biochimique supplémentaire. D'un intérêt particulier sera l'analyse systématique de l'ATPase MalK et de l'activité de transport du maltose dans du détergent, des liposomes et NANODISQUES. Les transporteurs ABC changer conformations pendant le cycle de transport, mais la contribution des lipides à ces changements de conformation restent à explorer.

La fabrication de la nanodisc est relativement simple, mais de petits écarts par rapport aux conditions optimales peuvent engendrer des lésions irréversibles agrégation des protéines. Dans ce rapport, nous insistons sur l'importance de choisir une protéine correcte: lipide, car un excès de lipides mènera à la production polydispersées de grandes particules de type liposome qui ne répondent pas à la qualification d'un biophysique nanodisc. Une précédente analyse employées MSP très élevé: taux de lipides pour la reconstitution du transporteur du maltose (1/120 par rapport à 1/20 dans notre analyse), mais les particules formées n'ont pas été caractérisé 11. Dans tous les cas, il est essentiel de bien analyser la qualité de la matière reconstitué à l'aide de techniques autres que la filtration sur gel, comme la spectroscopie de diffusion de lumière, ultracentrifugation analytique ou, plus simplement, l'électrophorèse sur gel natif. L'importance de ce contrôle de la qualité a été soulignée lors de la reconstitution de la bactériorhodopsine et P-glycoprotéine 12. Deux autres paramètres peut grandement influer sur le succès de la reconstitution: 1) la pureté de la protéine membranaire cible et l'absence d'agrégats et 2) le rapport correct entre protéines membranaires et des protéines d'échafaudage. En outre, le type de phospholipides i intégrénto le disque, ainsi que la longueur de la protéine de membrane échafaudage, peuvent contribuer à l'efficacité de la reconstitution. D'autres paramètres tels que la solubilité et la stabilité de la protéine de la membrane dans une solution détergente, le système tampon, la température et la durée de temps de la reconstitution peut également être nécessaire d'ajuster lors de l'optimisation du protocole de reconstitution. Par exemple, protéines de la membrane d'échafaudage de différentes longueurs produire NANODISQUES de différentes tailles 1, qui peuvent aider à la reconstitution des plus grands complexes de protéines membranaires ou des oligomères de protéines membranaires.

Le nanodisc a été combiné avec succès avec des méthodes biophysiques tels SPR, le CCI et la spectroscopie de fluorescence 12-16 à aider la recherche membrane qui est aux prises avec une méthodologie quantitative. Récemment, le nanodisc a été couplée à la spectrométrie de masse quantitative pour aider à identifier interactomes protéines membranaires avec une meilleure couverture et la précision17. L'industrie pharmaceutique a été limitée par les mêmes difficultés qui affligent le monde universitaire dans l'étude des protéines membranaires, mais il est un fait que les médicaments les plus fréquemment prescrits protéines membranaires cibles (récepteurs, canaux, transporteurs, capteurs). On peut prévoir que le nanodisc contribuera au développement des stratégies de dépistage de drogue qui travaillent avec des protéines membranaires intégrées.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l'Institut canadien de recherche en santé. SCC a été financé par une bourse de recherche postdoctorale en sciences naturelles et en génie du Canada. FD est une chaire de recherche du Canada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter Millipore UFC805008 Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent Bio-Rad 152-3920
E. coli total lipids Avanti Polar Lipids 100500C Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin GE Healthcare 17-5268-01
Phosphorous standard solution Sigma-Aldrich P3869
pMSP1D1 Addgene 20061
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare 17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments
DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C
MalFGK2 stock 1-2 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM
Store at -70 °C after purification
MSP stock 10-15 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles
Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids
0.5% w/v (10 mM) DDM
50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl
Store at 4 °C for 1 week
TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl
Store at 4 °C
TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
Store at 4 °C
TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8
100 mM NaCl
20% v/v glycerol
Store at 4 °C
TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM
Store at 4 °C and add DDM just before use

Table II. Solution recipes.

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References

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Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. AMore

Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. J. Vis. Exp. (66), e3910, doi:10.3791/3910 (2012).

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