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Biology

Nanodisc लिपिड कणों में एक एबीसी ट्रांसपोर्टर के पुनर्गठन के लिए एक विधि कदम दर कदम

Published: August 31, 2012 doi: 10.3791/3910
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

Summary

Nanodiscs छोटे चक्रिकाभ कणों कि फॉस्फोलिपिड bilayer के एक छोटे पैच में झिल्ली प्रोटीन को शामिल कर रहे हैं. हम एक दृश्य प्रोटोकॉल है कि एक डिस्क में MalFGK2 ट्रांसपोर्टर के समावेश कदम दर कदम से पता चलता है प्रदान करते हैं.

Abstract

nanodisc एक चक्रिकाभ (बड़े ~ 10-12 एनएम) कण कि फॉस्फोलिपिड bilayer के एक छोटे पैच में जाल झिल्ली प्रोटीन. nanodisc झिल्ली प्रोटीन ligand-रिसेप्टर बातचीत के संदर्भ में विशेष रूप से, के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक विकल्प है. विधि Sligar ने बीड़ा उठाया है और उनके सहयोगियों ने एक इंजीनियर अत्यधिक एक पेचदार पाड़ अपोलीपोप्रोटीन A1 से व्युत्पन्न प्रोटीन के amphipathic गुणों पर आधारित है. पाड़ प्रोटीन की hydrophobic चेहरे फैटी लिपिड bilayer के एसाइल पक्ष श्रृंखला के साथ बातचीत जबकि ध्रुवीय क्षेत्रों जलीय वातावरण का सामना करना पड़ता है. Nanodiscs में झिल्ली प्रोटीन का विश्लेषण liposome अधिक महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि छोटे कणों, सजातीय और पानी में घुलनशील हैं. इसके अलावा, जैव रासायनिक और biophysical घुलनशील प्रोटीन के लिए सामान्य रूप से सुरक्षित तरीके लागू किया जा सकता है और झिल्ली के दोनों ओर से. इस दृश्य प्रोटोकॉल में, हम एक अच्छी तरह से चरित्र की एक पुनर्गठन कदम दर कदम उपस्थितterized बैक्टीरियल एबीसी ट्रांसपोर्टर, पुरुष MalFGK 2 जटिल. डिस्क के गठन प्रक्रिया विधानसभा स्वयं कि hydrophobic डिटर्जेंट के प्रगतिशील हटाने के दौरान जगह लेने के बातचीत पर निर्भर करता है. हम आवश्यक कदम का वर्णन है और हम एक सही अनुपात प्रोटीन लिपिड चुनने के क्रम में करने के लिए समुच्चय और बड़े polydisperse liposome कणों की तरह के निर्माण को सीमा के महत्व पर प्रकाश डाला. सरल जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी, देशी जेल वैद्युतकणसंचलन और गतिशील प्रकाश बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में यह सुनिश्चित करें कि डिस्क ठीक से पुनर्गठन किया गया है गुणवत्ता को नियंत्रित करता है.

Protocol

कुल मिलाकर पुनर्गठन प्रक्रिया

पुनर्गठन प्रक्रिया शुद्ध MalFGK 2 जटिल साथ डिटर्जेंट solubilized phospholipids की उपस्थिति में झिल्ली पाड़ प्रोटीन (एमएसपी) के मिश्रण से शुरू होता है. कदम जैव मोती या Amberlite (1 चित्रा) नामक एक adsorbent polystyrene सामग्री से डिटर्जेंट की धीमी गति से हटाने के द्वारा पीछा किया जाता है. ऑटो विधानसभा की प्रक्रिया सबसे hydrophobic phospholipids, MalFGK 2 परिसर और एमएसपी amphipathic प्रोटीन की सतह के बीच ध्रुवहीन की वजह से बातचीत होने की संभावना होती है. अंतिम उत्पाद एक चक्रिकाभ MalFGK 2 परिसर के चारों ओर दो एमएसपी रैपिंग के अणुओं से बना कण है. कणों adducts और अल्ट्रा centrifugation और विश्लेषणात्मक आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा समुच्चय से अलग हो रहे हैं. कणों देशी जेल वैद्युतकणसंचलन और गतिशील प्रकाश बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता है.

शीर्षक "> झिल्ली की 1. तैयारी पाड़ प्रोटीन, एमएसपी

  1. उसकी टैग एमएसपी (संस्करण 1 के MSP1D1) ई. में प्लाज्मिड pMSP1D1 से उत्पादन किया जाता है BL21 (DE3) के साथ 0.5 मिमी isopropyl 3 घंटा के लिए β-D-1-thiogalactopyranoside आयुध डिपो 600 ~ 0.5 37 में प्रेरित ° सी. कोलाई
  2. 5000 XG पर कोशिकाओं centrifugation द्वारा काटा जाता है पर 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए और 100 सुक्ष्ममापी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड युक्त TSG10 बफर में resuspended.
  3. कोशिकाओं को एक फ्रांसीसी प्रेस (3x) के साथ 8,000 साई lysed कर रहे हैं और अघुलनशील सामग्री 5000 XG पर centrifugation द्वारा हटा दिया जाता है 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुलनशील न्यूनतम समर्थन मूल्य युक्त अंश अल्ट्रा centrifugation से 45 मिनट के लिए 125.000 XG में अलग है.
  4. न्यूनतम समर्थन मूल्य निकल chelating क्रोमैटोग्राफी TSG10 बफर में ~ 1.5 मिलीलीटर नी Sepharose अश्वशक्ति का उपयोग करके शुद्ध होता है. Contaminants दूर TSG10 50 मिमी imidazole युक्त बफर के साथ धोया जाता है. न्यूनतम समर्थन मूल्य 600 मिमी युक्त TSG10 बफर साथ eluted हैimidazole. शुद्ध प्रोटीन TSG10 बफर में dialyzed है और ~ 10-15 मिलीग्राम / एमएल के एक प्रोटीन एकाग्रता में -70 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत.

2. MalFGK 2 परिसर की तैयारी

  1. 2 MalFGK जटिल, malk के सी टर्मिनस में अपनी टैग, प्लाज्मिड ई. में pBAD22 FGK से व्यक्त किया जाता है BL21 (DE3) और 600 आयुध डिपो में 37 में 0.5 ~ 3 घंटा के लिए 0.2% एल arabinose साथ प्रेरित ° सी. कोलाई
  2. सेल और 1.3 कदम में lysis centrifugation के बाद झिल्ली गोली TSG20 बफर में 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में resuspended है. सामग्री 1% w / v 3 घंटा के लिए (DDM) 4 ° n-Dodecyl-β-maltopyranoside सी के साथ कोमल झटकों के साथ solubilized है.
  3. अघुलनशील सामग्री अल्ट्रा centrifugation द्वारा 1.3 चरण में के रूप में हटा दिया जाता है और सतह पर तैरनेवाला solubilized युक्त एकत्र MalFGK 2 जटिल है और 1.4 कदम में शुद्ध, लेकिन डायलिसिस के बिना.
  4. Further शुद्धि जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा TSGD बफर में हासिल की है एक Superdex 200 10 मानव संसाधन / 300 स्तंभ पर 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर.

3. Phospholipids की तैयारी

  1. एक ई. कोलाई कुल लिपिड क्लोरोफॉर्म में भंग निकालने के पेंच टोपी microfuge ट्यूबों में 1,000 nmol aliquots में विभाजित है. विलायक नाइट्रोजन का एक सौम्य धारा के तहत सुखाया जाता है और आगे एक निर्वात desiccator में रातोंरात सूख.
  2. लिपिड फिल्म टीएस बफर में 5 एनएम अंतिम एकाग्रता में भंग कर रहा है और तेजी से vortexed और sonicated. भंग lipids थोड़ा कारण उनके जलीय टीएस बफर में सामान्य अविलेयता अपारदर्शी दिखाई देते हैं, लेकिन वे निलंबन में रहना चाहिए. DDM 0.5% (~ 10 मिमी), जिस पर समाधान स्पष्ट हो जाता है की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया है.
  3. लिपिड मिश्रण एक पानी के स्नान में रखा जाता है और पल्स ~ 5 सेकंड के लिए 5 बार के लिए sonicated. लिपिड मिश्रण 1 मूत की एक अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता हैकश्मीर.

4. जैव मोतियों की तैयारी

  1. लगभग 10-15 मिलीलीटर (शुष्क मात्रा) जैव मोती एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखा गया है.
  2. मोती क्रमिक मेथनॉल 100%, 95% इथेनॉल, milliQ एच 2 हे, और अंत में टीएस बफर (दो बार) के 50 मिलीलीटर के साथ धोया जाता है.
  3. धोया मोती 4 पर जमा हो जाती ° C ~ 10 मिलीलीटर टीएस बफर में.

5. Nanodisc पुनर्गठन

  1. न्यूनतम समर्थन मूल्य TSGD बफर में ~ 7 मिलीग्राम / एमएल (~ 0.3 मिमी) के अंतिम एकाग्रता में पतला है.
  2. न्यूनतम समर्थन मूल्य:: 1:3:60 या 1:3:400 TSGD बफर में लिपिड अनुपात ~ 2 nmol शुद्ध MalFGK 2 परिसर के एक प्रोटीन में मिलाया जाता है. अंतिम एकाग्रता 6 2 MalFGK, 18 सुक्ष्ममापी न्यूनतम समर्थन मूल्य और 360 सुक्ष्ममापी (1:3:60) lipids या 2.4 मिमी lipids (1:3:400) सुक्ष्ममापी है. अंतिम मात्रा 300 μl है. अंतिम DDM एकाग्रता 0.08% (~ 1.6 मिमी) है. ग्लिसरॉल के अंतिम एकाग्रता लिपिड की मात्रा पर निर्भर करता है, लेकिन चारों ओर रहता है 5-10% v / v. ~ जैव मनका निलंबन के 50 μl ट्यूब को जोड़ा जाता है और मिश्रण रातोंरात एक कमाल की मेज पर 4 डिग्री सेल्सियस पर incubated है
  3. मोती गंभीरता से sedimented कर रहे हैं और समाधान एक संकीर्ण टिप के माध्यम से pipetted है जितना संभव हो उतना जैव मोती से बचने.
  4. Precipitates बड़े अल्ट्रा centrifugation से 20 मिनट के लिए 100.000 XG पर निकाल रहे हैं. डिस्क जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा TSG10 बफर में 2.4 कदम के रूप में शुद्ध कर रहे हैं. डिस्क युक्त Fractions जमा कर रहे हैं और एक अशेष भाजक किया जाना चाहिए और फिर से एक ही जेल छानने का काम करने के लिए तैयारी की स्थिरता परीक्षण स्तंभ पर इंजेक्शन.
  5. शुद्ध डिस्क -70 डिग्री सेल्सियस पर समय की एक विस्तारित अवधि के लिए जमा कर सकते हैं. बर्फ पर विगलन के बाद, डिस्क के रूप में 5.5 चरण में अल्ट्रा centrifugation अधीन किया जाना चाहिए हटा संभावित precipitates. एक अशेष भाजक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें कि महत्वपूर्ण एकत्रीकरण या वर्षा विगलन के दौरान घटित नहीं थाप्रक्रिया.

6. मूल निवासी जेल वैद्युतकणसंचलन

  1. 1 सुक्ष्ममापी (~ 0.2 मिलीग्राम / एमएल) nanodiscs की देशी पृष्ठ 6, 7 (Tris एचसीएल 8.8 पीएच, 4-12%) पुनर्गठन (चित्रा 3 ए) की गुणवत्ता का आकलन से विश्लेषण कर रहे हैं.
  2. पुरुष के बंधन दो जटिल MalFGK (1 सुक्ष्ममापी) nanodiscs में पुनर्गठन भी देशी पृष्ठ (चित्रा 3A) द्वारा मूल्यांकन किया है.
  3. वैद्युतकणसंचलन के बाद, जेल Coomassie नीले रंग के साथ 10 मिनट के लिए दाग है, और ~ 1 घंटा के लिए destained.

7. गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS)

  1. जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा Nanodiscs 0.1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर TSG10 एक Superdex 200 10 मानव संसाधन / 300 स्तंभ का उपयोग बफर में 2.4 कदम के रूप में शुद्ध कर रहे हैं. Fractions जमा nanodiscs युक्त और ~ 10 / मिलीग्राम मिलीग्राम एक Amicon केन्द्रापसारक फिल्टर के साथ करने के लिए ध्यान केंद्रित कर रहे हैं.
  2. नमूना दो बार फ़िल्टर्ड है (0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर) का उपयोग कर DLS विश्लेषण करने से पहलेएक 1 μl आंतरिक मात्रा क्वार्ट्ज क्युवेट में एक DynaPro nanostar साधन (Wyatt प्रौद्योगिकी). डाटा डायनामिक्स सॉफ्टवेयर (Wyatt प्रौद्योगिकी) का उपयोग करने के लिए व्यास और कणों की आणविक वजन का अनुमान लगाया है.

8. ATPase माप

  1. MalFGK nanodiscs 2-पुनर्गठन के ATPase गतिविधि एक वर्णमिति 8 परख का उपयोग निर्धारित किया जाता है.
  2. शुद्ध डिस्क और 1 मिमी एटीपी 1 सुक्ष्ममापी एक साथ 20 मिनट के लिए पुरुष और 37 में incubated डिग्री सेल्सियस की बढ़ती मात्रा के साथ मिलाया जाता है. अकार्बनिक फॉस्फेट की रिहाई के 660 एनएम पर मापा जाता है.
  3. जारी फॉस्फेट की राशि एक मानक एक फॉस्फोरस मानक समाधान के साथ उत्पन्न की अवस्था की तुलना में है.

9. प्रतिनिधि परिणाम

nanodiscs जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 2A, बाएं) द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. chromatogram से पता चलता है कि पुनर्गठन घ के बहुमतएक एकल चोटी के रूप में iscs (काले ट्रेस) elute, जबकि डिस्क अतिरिक्त (लाल ट्रेस) शून्य मात्रा में elute lipids के साथ और व्यापक चोटियों की एक श्रृंखला के रूप में की गई है. nanodiscs की गुणवत्ता और देशी जेल वैद्युतकणसंचलन और गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) स्पेक्ट्रोस्कोपी से विश्लेषण किया है. ठीक तरह से पुनर्गठन डिस्क जेल पर एक तेज बैंड के रूप में विस्थापित जबकि एक लिपिड अतिरिक्त की उपस्थिति में उन पुनर्गठन एक धब्बा (चित्रा 2A, दाएं) के रूप में विस्थापित. DLS द्वारा विश्लेषण से पता चलता है कि डिस्क जनसंख्या 11.4 एनएम (चित्रा 2B) के एक औसत व्यास के साथ सजातीय है. पुनर्गठन डिस्क DLS सन्निकटन के आधार पर 215 केडीए की एक स्पष्ट आणविक भार है. अतिरिक्त lipids की उपस्थिति में पुनर्गठन नमूने व्यापक रूप से 100 एनएम के आसपास प्रदर्शन radii वितरित की, जो गैर सजातीय नमूने के लिए विशिष्ट है.

MalFGK 2 जटिल की गुणवत्ता देशी जेल और ATPase द्वारा अपनी गतिविधि वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन किया हैमाप (3 चित्रा). maltose बाध्यकारी प्रोटीन पुरुष MalFGK 2 9 ट्रांसपोर्टर, 10 उच्च आत्मीयता के साथ बांधता है. का प्रयोग गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन, यह संभव है कि पुरुष और 2 MalFGK (चित्रा 3 ए) के बीच एक जटिल का पता लगाने. malk 2 पुरुष द्वारा ATPase गतिविधि की उत्तेजना चित्रा 3B में दिखाया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. पुनर्गठन प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट प्रवाह संचित्र.

चित्रा 2
चित्रा 2. Nanodisc तैयारी ए. की गुणवत्ता नियंत्रण या उच्च लिपिड अनुपात (1/3/400, लाल ट्रेस), जेल nanodiscs निस्पंदन विश्लेषण (Superdex 200 10 मानव संसाधन / 300 स्तंभ) कम लिपिड (काले ट्रेस 1/3/60) के अनुपात में पुनर्गठन. एक ही डिस्क की तैयारी के मूल निवासी जेल वैद्युतकणसंचलन. Molकेडीए में ecular वजन मार्कर संकेत कर रहे हैं. बी एक ही डिस्क की तैयारी के गतिशील प्रकाश बिखरने विश्लेषण. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. MalFGK 2-nanodisc कणों का विश्लेषण ए. जेल पुरुष की पारी विश्लेषण MalFGK 2 nanodisc कणों की मात्रा में वृद्धि के साथ incubated. बी MalFGK ATPase गतिविधि 2 nanodisc पुरुष एकाग्रता के एक समारोह के रूप में कण.

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Discussion

हम nanodiscs में maltose ट्रांसपोर्टर के पुनर्गठन के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन करता है. ट्रांसपोर्टर ATPase सक्रिय है और घुलनशील बाध्यकारी साथी पुरुष के साथ बातचीत (3 चित्रा) निर्मित किया जा सकता है. nanodiscs में ट्रांसपोर्टर के सफल पुनर्गठन अतिरिक्त biophysical और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए रास्ता खुला. ब्याज की विशेष व्यवस्थित विश्लेषण Malk ATPase और maltose डिटर्जेंट में परिवहन गतिविधि, liposome और nanodiscs. एबीसी ट्रांसपोर्टरों परिवहन चक्र के दौरान रचना बदल लेकिन lipids की इन गठनात्मक परिवर्तन के लिए योगदान करने के लिए पता लगाया जा रह है.

nanodisc के निर्माण के अपेक्षाकृत आसान है, अभी तक इष्टतम स्थितियों से छोटे विचलन प्रोटीन एकत्रीकरण अपरिवर्तनीय नेतृत्व कर सकते हैं. इस रिपोर्ट में, हम एक सही प्रोटीन चुनने के महत्व पर बल दिया: लिपिड अनुपात क्योंकि lipids की एक अतिरिक्त राशि productio के लिए नेतृत्व करेंगेn बड़े polydisperse liposome कणों की तरह के कि एक nanodisc की biophysical योग्यता का जवाब नहीं है. Maltose ट्रांसपोर्टर (1 / हमारे विश्लेषण में 120/1 20 की तुलना में) के पुनर्गठन के लिए lipids अनुपात लेकिन गठित कणों आगे 11 विशेषता नहीं थे: पिछले एक विश्लेषण बहुत उच्च न्यूनतम समर्थन मूल्य कार्यरत हैं. किसी भी मामले में, यह महत्वपूर्ण है ध्यान पुनर्गठन प्रकाश बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी, विश्लेषणात्मक ultracentrifugation या अधिक बस, देशी जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में जेल निस्पंदन, के अलावा अन्य तकनीकों का उपयोग कर सामग्री की गुणवत्ता का विश्लेषण. bacteriorhodopsin और 12 पी ग्लाइकोप्रोटीन के पुनर्गठन के दौरान इस गुणवत्ता नियंत्रण के महत्व पर प्रकाश डाला गया. दो अन्य मानकों बहुत पुनर्गठन की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं: 1) लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन की शुद्धता और समुच्चय और) 2 झिल्ली प्रोटीन और पाड़ प्रोटीन के बीच सही अनुपात के अभाव के. इसके अलावा, फॉस्फोलिपिड के प्रकार मैं शामिलNto डिस्क, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से झिल्ली पाड़ प्रोटीन की लंबाई, पुनर्गठन की दक्षता के लिए योगदान कर सकते हैं. और डिटर्जेंट समाधान, बफर प्रणाली, तापमान और पुनर्गठन के समय लंबाई में झिल्ली प्रोटीन की विलेयता स्थिरता जैसे अन्य मानकों को भी जब पुनर्गठन प्रोटोकॉल का अनुकूलन समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, अलग अलग लंबाई की झिल्ली पाड़ प्रोटीन अलग 1 आकार, जो बड़ा झिल्ली प्रोटीन परिसरों या झिल्ली प्रोटीन oligomers के पुनर्गठन में मदद कर सकते हैं nanodiscs उत्पादन.

nanodisc सफलतापूर्वक किया गया है biophysical जैसे SPR, आईटीसी, और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी 12-16 झिल्ली अनुसंधान है कि मात्रात्मक पद्धति के साथ संघर्ष कर रही है मदद के तरीकों के साथ संयुक्त है. हाल ही में, nanodisc मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त है बेहतर कवरेज और शुद्धता के साथ झिल्ली प्रोटीन interactomes की पहचान में मदद17. दवा उद्योग ही कठिनाइयों है कि झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन में शिक्षा प्लेग से सीमित कर दिया गया है, हालांकि यह तथ्य यह है कि सबसे अक्सर निर्धारित दवाओं लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन (रिसेप्टर्स, चैनलों, ट्रांसपोर्टरों, सेंसर). यह भविष्यवाणी की कि nanodisc दवा स्क्रीनिंग रणनीति कि झिल्ली एम्बेडेड प्रोटीन के साथ काम करते हैं के विकास में मदद मिलेगी.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम की कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. सीएससी प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एफडी एक द्वितीय श्रेणी कनाडा अनुसंधान चेयर है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter Millipore UFC805008 Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent Bio-Rad 152-3920
E. coli total lipids Avanti Polar Lipids 100500C Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin GE Healthcare 17-5268-01
Phosphorous standard solution Sigma-Aldrich P3869
pMSP1D1 Addgene 20061
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare 17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments
DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C
MalFGK2 stock 1-2 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at -70 °C after purification
MSP stock 10-15 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles
Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids
0.5% w/v (10 mM) DDM
50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C for 1 week
TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C
TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8
100 mM NaCl
20% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at 4 °C and add DDM just before use

Table II. Solution recipes.

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References

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66 अंक Nanodiscs झिल्ली प्रोटीन lipids एबीसी ट्रांसपोर्टर maltose ट्रांसपोर्टर MalFGK
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Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A… More

Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. J. Vis. Exp. (66), e3910, doi:10.3791/3910 (2012).

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