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Biology

Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

Published: August 31, 2012 doi: 10.3791/3910
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

Summary

Nanodiscs são pequenas partículas discóides que incorporam proteínas de membrana em um pequeno pedaço de bicamada de fosfolipídios. Nós fornecemos um protocolo visual que mostra a incorporação passo-a-passo do transportador MalFGK2 em um disco.

Abstract

O nanodisc é uma partícula discoidal (~ 10-12 nm grande) que as proteínas de membrana armadilha em um pequeno pedaço de bicamada de fosfolipídios. O nanodisc é uma opção particularmente atraente para o estudo de proteínas de membrana, especialmente no contexto de interacção ligando-receptor. O método pioneiro Sligar e colegas baseia-se nas propriedades anfipáticas de uma engenharia altamente helicoidal uma proteína derivada do andaime apolipoproteína A1. As faces hidrofóbicas da proteína andaime interagir com os acilo gordos de cadeias laterais na bicamada lipídica que as regiões polares enfrentam o meio ambiente aquoso. As análises de proteínas de membrana em nanodiscs têm vantagens significativas sobre os lipossomas porque as partículas são pequenas, homogénea e solúvel em água. Além disso, os métodos bioquímicos e biofísicos normalmente reservadas para proteínas solúveis pode ser aplicada, e a partir de ambos os lados da membrana. Neste protocolo visual, apresenta-se uma reconstituição passo-a-passo de uma caracte bemterizada transportador ABC bacteriana, o macho-MalFGK complexo 2. A formação do disco é um processo de auto-montagem, que depende de interacções hidrofóbicas que têm lugar durante a remoção progressiva do detergente. Descrevem-se os passos essenciais e destaca-se a importância de escolher a proporção entre proteína e lípido-correcta, a fim de limitar a formação de agregados maiores e polidispersos lipossoma partículas semelhantes. Qualidade simples controles, tais como cromatografia de filtração em gel, electroforese em gel nativa e espectroscopia de dispersão de luz dinâmica garantir que os discos foram correctamente reconstituído.

Protocol

Processo geral de reconstituição

O processo de reconstituição é iniciado por mistura da proteína de membrana de andaime (MSP) purificado com o MalFGK complexo 2, na presença de detergente solubilizados fosfolípidos. O passo é seguido pela remoção lenta do detergente por um material adsorvente chamado poliestireno Bio-Beads ou Amberlite (Figura 1). O processo de auto-montagem ocorre provavelmente devido às interacções entre os fosfolípidos apolares hidrofóbicas, o MalFGK dois complexos e a superfície da proteína MSP anfipática. O produto final é uma partícula discóide feito de duas moléculas de invólucro em torno do MSP 2 MalFGK complexo. As partículas são separadas a partir dos aductos e agregados por ultracentrifugação e cromatografia de exclusão de tamanho analítica. As partículas são caracterizadas por electroforese em gel nativa e espectroscopia de espalhamento dinâmico da luz.

título "> Preparação 1. Andaime da Membrana Proteínas, MSP

  1. A sua marcada com MSP (versão MSP1D1 1) é produzido a partir do plasmídeo em E. pMSP1D1 coli BL21 (DE3), induzida em OD 600 ~ 0,5 com 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37 ° C.
  2. As células são colhidas por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspensas em tampão contendo 100 TSG10 fluoreto de fenilmetano uM.
  3. As células são lisadas com uma prensa francesa (3x) a 8000 psi e o material insolúvel é removido por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. A fracção solúvel contendo o MSP é isolado por ultra-centrifugação a 125.000 xg durante 45 min.
  4. A MSP é purificado por cromatografia de níquel-quelante usando ~ 1,5 ml de Ni Sepharose HP em TSG10 buffer. Os contaminantes são removidos por lavagem com TSG10 tampão contendo 50 mM de imidazole. A MSP é eluída com TSG10 tampão contendo 600 mMimidazole. A proteína purificada é dialisada em TSG10 tampão e armazenado em -70 ° C a uma concentração de proteína de ~ 10-15 mg / ml.

2. Preparação do Complexo 2 MalFGK

  1. O MalFGK complexo 2, his-etiquetadas no terminal C de Malk, é expressa a partir do plasmídeo pBAD22-FGK em E. coli BL21 (DE3) e induzido a OD 600 ~ 0,5 com 0,2% de L-arabinose, durante 3 horas a 37 ° C.
  2. Seguindo a lise das células e centrifugação, tal como no passo 1.3, o sedimento de membrana foi ressuspenso em TSG20 tampão a uma concentração final de 5 mg / ml. O material é solubilizado com 1% w / v de n-dodecil-β-maltopyranoside (DDM), durante 3 horas a 4 ° C com agitação suave.
  3. O material insolúvel é removido por ultra-centrifugação como descrito no passo 1.3 e o sobrenadante contendo o solubilizado MalFGK complexa 2 é recolhido e purificado como descrito no passo 1.4, mas sem diálise.
  4. Further purificação é alcançada por cromatografia de filtração em gel em tampão TSGD num Superdex 200 HR 10/300 coluna a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min.

3. Preparação de Fosfolípidos

  1. Uma E. coli total de lípidos extrair dissolvido em clorofórmio é separada em alíquotas de 1000 nmol em tubos de microcentrífuga de tampa roscada. O solvente é evaporado sob uma corrente suave de azoto e secou-se ainda mais durante a noite num exsicador de vácuo.
  2. A película de lípido é dissolvido em tampão TS a 5 nM de concentração final e agitadas vigorosamente e sonicada. Os lípidos dissolvidos aparece ligeiramente opaca, devido à sua insolubilidade em geral em tampão TS aquosa, mas deve permanecer em suspensão. DDM é adicionado a uma concentração final de 0,5% (~ 10 mM), em que a solução se torne clara.
  3. A mistura lipídica é colocada num banho de água e de impulsos ultra-sons durante 5 vezes para ~ 5 seg. A mistura lipídica é armazenado a 4 ° C por um período máximo de 1 week.

4. Preparação de Bio-Beads

  1. Aproximadamente 10-15 ml (volume seco) Bio-Beads é colocado dentro de um tubo de 50 ml.
  2. As esferas são lavadas, sucessivamente, com 50 ml de metanol a 100%, etanol a 95%, H 2 O milliQ, e finalmente tampão TS (duas vezes cada).
  3. As pérolas lavadas são armazenadas a 4 ° C em tampão TS ~ 10 ml.

5. Reconstituição Nanodisc

  1. A MSP é diluída em tampão TSGD na concentração final de ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
  2. ~ Nmol 2 de purificado MalFGK complexo 2 são misturados numa relação proteína: lípido de 1:3:60 ou 1:3:400 em tampão TSGD: MSP. A concentração final é de 6 uM MalFGK 2, 18 | iM de MSP e lípidos uM 360 (1:3:60) ou 2,4 mM de lípidos (1:3:400). O volume final é de 300 uL. A concentração final de DDM é de 0,08% (~ 1,6 mM). A concentração final de glicerol depende da quantidade de lípido adicionado, mas permanece em torno de 5-10% v / v ~ 50 ul de Bio-Bead suspensão é adicionado ao tubo, e a mistura é incubada durante a noite numa mesa oscilante, a 4 ° C.
  3. As esferas são sedimentadas por gravidade e a solução é pipetada através de uma ponta estreita para evitar tanto Bio-Beads possível.
  4. Grande precipitados são removidos por ultra-centrifugação a 100.000 xg durante 20 min. Os discos são purificados por cromatografia de filtração em gel como descrito no passo 2.4 em TSG10 buffer. As fracções contendo os discos são reunidas e uma parte alíquota deve ser re-injectada na mesma coluna de filtração em gel para testar a estabilidade da preparação.
  5. Os discos purificados podem armazenado a -70 ° C por um período de tempo prolongado. Seguindo o descongelamento em gelo, os discos devem ser submetidas a ultra-centrifugação como descrito no passo 5.5 para remover precipitados potencial. Uma alíquota deve ser analisada por cromatografia de filtração em gel para assegurar que a agregação ou precipitação significativa não ocorreu durante o descongelamentoprocesso.

6. Eletroforese em gel nativo

  1. 1 uM de nanodiscs (~ 0,2 mg / ml) são analisadas por PAGE nativa 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) para avaliar a qualidade da reconstituição (Figura 3A).
  2. A ligação de MalE (1 uM) para o complexo de 2-MalFGK reconstituída em nanodiscs é também avaliada por PAGE-nativo (Figura 3A).
  3. Após a electroforese, o gel é corado com azul de Coomassie durante 10 min, e descorados durante ~ 1 hora.

7. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)

  1. Nanodiscs são purificados por cromatografia de filtração em gel como descrito no passo 2.4 em TSG10 tampão utilizando uma coluna Superdex 200 HR 10/300 coluna com um caudal de 0,1 ml / min. As fracções contendo nanodiscs são reunidas e concentradas até ~ 10 mg / ml com um filtro Amicon centrífuga.
  2. A amostra é filtrada duas vezes (filtro de 0,22 nm) antes da análise por DLS usandoum Dynapro nanostar instrumento (Wyatt Technology), em um volume de 1 ul interior da cuvete de quartzo. Os dados são ajustados usando o software DINÂMICA (Wyatt Technology) para estimar o diâmetro e peso molecular das partículas.

8. Medidas ATPase

  1. A actividade de ATPase de MalFGK 2-reconstituídos nanodiscs é determinada utilizando um ensaio colorimétrico 8.
  2. 1 uM de discos purificadas e 1 mM de ATP são misturados com quantidades crescentes de MalE C e incubado a 37 ° C durante 20 min. A libertação de fosfato inorgânico é medida a 660 nm.
  3. A quantidade de fosfato libertado é comparada com uma curva padrão gerada com uma solução padrão de fósforo.

9. Resultados representativos

Os nanodiscs são purificados por cromatografia de filtração em gel (Figura 2A, à esquerda). O cromatograma mostra que a maioria do d reconstituídoISCs eluir (preto traço) como um único pico, enquanto que os discos feitos com lípidos em excesso (vermelho traço) eluem no volume vazio e como uma série de picos largos. A qualidade dos nanodiscs é ainda analisada por electroforese em gel nativa e espectroscopia de espalhamento dinâmico da luz (DLS). Discos adequadamente reconstituídas migrar como uma banda acentuada no gel enquanto aquelas reconstituída, na presença de um excesso de lípidos migrar como uma mancha (Figura 2A, à direita). A análise por DLS mostra que a população seja homogénea disco com um diâmetro médio de 11,4 nm (Figura 2B). Os discos reconstituídos têm um peso molecular aparente de 215 kDa com base na aproximação DLS. As amostras reconstituídas, na presença de excesso de lipídeos exibem largamente distribuído raios em torno de 100 nm, o que é típico para as amostras não homogéneos.

A qualidade da 2 MalFGK complexo é avaliada por electroforese em gel nativa e a sua actividade ATPase pelamedições (Figura 3). A proteína de ligação à maltose MalE liga com uma afinidade maior para o transportador 2 MalFGK 9, 10. Usando a electroforese não desnaturante em gel, é possível detectar um complexo entre o macho ea MalFGK 2 (Figura 3A). A estimulação da actividade de ATPase Malk 2 por MalE é mostrado na Figura 3B.

Figura 1
Figura 1. Fluxograma típico para o protocolo de reconstituição.

Figura 2
Figura 2. O controle de qualidade da preparação nanodisc. A. A análise de filtração em gel (Superdex 200 HR 10/300 coluna) das nanodiscs reconstituídos em relação lípido baixa (1/3/60; traço negro) ou a razão de lípidos elevados (1/3/400; traço vermelho). Electroforese em gel nativo de preparação do mesmo disco. MolOs marcadores de peso ecular em kDa é indicado. B. análise dinâmica de espalhamento de luz da preparação mesmo disco. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3
Figura 3. Análise da MalFGK 2 nanodisc-partículas. A. Análise de gel mudança do sexo masculino incubadas com quantidades crescentes de MalFGK 2-nanodisc partículas. B. A actividade ATPase da MalFGK 2-nanodisc partículas em função da concentração de MalE.

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Discussion

Descreve-se um procedimento simples para a reconstituição do transportador de maltose em nanodiscs. O transportador é ATPase ativa e da interação com o macho parceiro solúvel ligação pode ser recriado (Figura 3). A reconstituição bem sucedida do transportador em nanodiscs abrir o caminho para análise biofísica e bioquímica suplementar. De interesse particular será a análise sistemática da ATPase Malk e maltose a actividade de transporte de detergente, lipossomas e nanodiscs. Transportadores ABC alterar conformações durante o ciclo de transporte, mas a contribuição dos lipídios a essas mudanças conformacionais ainda precisam ser exploradas.

A fabricação do nanodisc é relativamente simples, mas pequenos desvios condições óptimas podem levar à perda irreversível da agregação de proteínas. Neste relatório, salientamos a importância de escolher uma proteína correta: a relação lipídico porque uma quantidade excessiva de lipídios levará à production de grandes lipossomas polidispersos partículas semelhantes que não reagem com a qualificação de um biofísico nanodisc. A análise anterior empregue MSP muito alta relação lípidos para a reconstituição do transportador de maltose (1/120 em comparação com 1/20 em nossa análise), mas as partículas formadas não foram ainda caracterizados 11. Em qualquer caso, é essencial analisar cuidadosamente a qualidade do material reconstituído usando outras técnicas de filtração em gel, tais como espectroscopia de dispersão de luz, ultracentrifugação analítica ou de forma mais simples, electroforese em gel nativo. A importância desse controle de qualidade foi destaque durante a reconstituição do bacteriorhodopsin e glicoproteína P-12. Dois outros parâmetros podem afectar grandemente o sucesso da reconstituição: 1) a pureza da proteína de membrana-alvo e a ausência de agregados e 2) a relação correcta entre a proteína de membrana e de proteína do andaime. Além disso, o tipo de fosfolípido incorporado into do disco, assim como o comprimento do andaime proteína de membrana, pode contribuir para a eficiência da reconstituição. Outros parâmetros, tais como a solubilidade e estabilidade da proteína de membrana em solução de detergente, o sistema de solução tampão, a temperatura eo tempo de duração da reconstituição pode também necessitar de ser ajustados ao optimizar o protocolo de reconstituição. Por exemplo, as proteínas da membrana de andaime com diferentes comprimentos produzir nanodiscs de tamanhos diferentes 1, o que pode ajudar a reconstituição de complexos maiores de proteínas de membrana ou oligómeros de proteínas de membrana.

O nanodisc foi sucesso combinado com métodos biofísicos SPR tal, ITC, e espectroscopia de fluorescência 12-16 a ajudar a investigação membrana que está lutando com a metodologia quantitativa. Recentemente, o nanodisc foi combinada com espectrometria de massa quantitativo para ajudar a identificar interactomes proteína de membrana com uma melhor cobertura e precisão17. A indústria farmacêutica tem sido limitado pelas mesmas dificuldades que afligem a academia em estudar as proteínas de membrana, embora seja verdade que os medicamentos mais prescritos alvo proteínas da membrana (receptores, canais, transportadores, sensores). Pode-se prever que o nanodisc vai ajudar o desenvolvimento de estratégias de rastreio de drogas, que trabalham com as proteínas da membrana incorporados.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde. CSC foi financiado por uma bolsa de pós-doutorado de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá. FD é um Tier II Cátedra de Pesquisa do Canadá.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter Millipore UFC805008 Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent Bio-Rad 152-3920
E. coli total lipids Avanti Polar Lipids 100500C Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin GE Healthcare 17-5268-01
Phosphorous standard solution Sigma-Aldrich P3869
pMSP1D1 Addgene 20061
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare 17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments
DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C
MalFGK2 stock 1-2 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at -70 °C after purification
MSP stock 10-15 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles
Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids
0.5% w/v (10 mM) DDM
50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C for 1 week
TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C
TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8
100 mM NaCl
20% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at 4 °C and add DDM just before use

Table II. Solution recipes.

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References

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