Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Summary

Nanodiscs fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine membran proteinleri dahil küçük diskoid parçacıklardır. Biz bir disk içine MalFGK2 taşıyıcı adım adım kuruluş gösteren görsel bir protokol sağlar.

Abstract

Nanodisc bir diskoidal parçacık (~ 10-12 nm büyük) o tuzağa membran proteinlerinin fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine. Olduğunu Nanodisc özellikle ligand-reseptör etkileşimlerinin bağlamında, zar proteinleri çalışmak için özellikle çekici bir seçenek. Yöntem Sligar tarafından ve arkadaşları, apolipoprotein A1 türetilen bir tasarlanmış çok a-sarmal iskele protein amfipatik özelliklerine dayanmaktadır. Kutup bölgeleri sulu ortamda karşı karşıya iken iskele proteinin hidrofobik yüzleri iki tabakalı lipid ve yağ açil yan zincirleri ile etkileşim. Partikülleri, küçük homojen değildir ve suda çözünebilir olduğu için nanodiscs içinde zar proteinlerinin analizi lipozom göre önemli avantajlara sahiptir. Buna ek olarak, normal olarak çözünür proteinler için ayrılmış biyokimyasal ve biyofiziksel uygulanan yöntemler, ve zarın her iki tarafında olabilir. Bu görsel protokol, biz iyi bir karakter bir adım-adım sulandırma sunmakkarekterize bakteriyel ABC taşıyıcı, erkek-MalFGK ₂ kompleksi. Diskin oluşum deterjan ilerleyen çıkarılması sırasında meydana gelen hidrofobik etkileşimler bağlı olarak bir öz montaj işlemdir. Biz gerekli adımları açıklamak ve agrega ve büyük polidispers lipozom benzeri partiküllerin oluşumunu sınırlamak için doğru protein-to-lipid oranı seçmenin önemini vurgulamak. Basit kalitesi tür diskler düzgün sulandırılmış oylandı emin jel filtrasyon kromatografisi, yerli jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılma spektroskopisi olarak denetler.

Protocol

Genel Sulandırma Süreci

Sulandırma işlemi deterjan çözülmüş fosfolipidlerin mevcudiyetinde saflaştırılmış MalFGK ₂ kompleks ile membran protein iskele (MSP) ve karıştırma başlatılır. Adım Bio-boncuk veya Amberlite (Şekil 1) olarak adlandırılan bir emici malzeme ile polistiren deterjan yavaş kaldırılması tarafından takip edilir. Otomatik montaj işlemi çünkü hidrofobik fosfolipidler, MalFGK ₂ karmaşık ve MSP amfipatik proteinin yüzeyi ile apolar etkileşim büyük olasılıkla oluşur. Nihai ürün MalFGK ₂ kompleks MSP sarma iki molekül yapılmış bir disk biçiminde bir parçacıktır. Partiküller ultra-santrifüj ile analitik boyut-dışlama kromatografisi ile adducts ve agregadan ayrılır. Partiküller doğal-jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılması spektroskopisi ile karakterize edilmiştir.

Membran başlığı "> 1. Hazırlama İskele Protein, MSP

1. His-etiketli MSP (versiyon MSP1D1 ¹⁾ E. plazmid pMSP1D1 üretilir coli, 37, 3 saat boyunca 0.5 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside ile OD ₆₀₀ ~ 0.5 indüklenen BL21 (DE3) ° C.
2. Hücreler 10 dakika 4 ° C'de 5.000 x g santrifüj ile toplanır ve 100 uM fenilmetansülfonil flor içeren TSG10 tampon içinde tekrar süspanse edilir.
3. Hücreler 8,000 psi ile bir Fransız pres (3x) ile lize edilir ve erimez madde 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika için 5000 x g'de santrifüj ile çıkarılır MSP içeren çözünür kesir 45 dakika süreyle 125,000 xg ultra santrifüj yoluyla izole edilir.
4. MSP nikel-şelat kromatografi TSG10 tampon içinde ~ 1.5 ml Ni Sepharose HP kullanılarak saflaştırılır. Kirletici maddelerin, 50 mM imidazol içeren tampon TSG10 ile yıkandıktan. MSP 600 mM TSG10 tampon ile elüt edilmiştirimidazol. Saflaştırılmış protein TSG10 tampon içinde diyaliz edildi ve ~ 10-15 mg / ml 'lik bir protein konsantrasyonu -70 ° C de saklanır.

2. MalFGK ₂ Kompleksi hazırlanması

1. MalFGK ₂ kompleksinin Malk, C-terminalinde His-etiketli E. plazmid pBAD22-FGK eksprese edilir coli BL21 (DE3) ve 37 de, 3 saat boyunca% 0.2 L-arabinoz ile OD ₆₀₀ ~ 0.5 indüklenen ° C.
2. Adım 1.3 'de olduğu gibi hücrelerinin lisisi ve santrifüj sonrasında, zar pelet 5 mg / ml' lik bir nihai konsantrasyonda TSG20 tampon içinde tekrar süspanse edilir. Malzeme hafif sallama ile 4, 3 saat boyunca% 1 w / v n-dodesil-β-maltopyranoside (DDİ) ° C ile çözündürülmüş edilir.
3. Çözünmeyen malzeme adım 1.3 'de olduğu gibi ultra-santrifüj ile çıkarıldı ve yüzey maddesi içeren bir çözünür MalFGK ₂ kompleksinin toplanan ve adım 1,4 olarak saflaştırılmış, ama diyalize olmadan edilir.
4. Further arıtma 0.5 ml / dak 'lık bir akış hızında, bir Superdex 200 HR 10/300 kolon üzerinde TSGD tampon içinde, jel filtrasyon kromatografisi ile elde edilir.

3. Fosfolipidler hazırlanması

1. Bir E. coli, toplam lipid kloroform içinde çözüldü özü vidalı kapaklı mikrofüj tüpler içinde 1.000 nmol alikotları ayrılır. Çözücü, bir azot akımı altında buharlaştırıldı yumuşak ve bir vakumlu desikatör içinde daha ileri gece boyunca kurutulur.
2. Lipid filmi 5 nM son konsantrasyonda TS tampon içinde çözülmüş ve kuvvetlice vortekslenmiş ve sonike edilmiştir. Çözünmüş lipidler nedeniyle sulu TS tampon genel çözülmezlik hafifçe opak görünecektir, ancak askı kalmalıdır. DDİ çözelti berrak hale geldiği% 0.5 (~ 10 mm), ve bir nihai konsantrasyon ilave edilir.
3. Lipit karışımı bir su banyosuna yerleştirilir ve nabız ~ 5 sn için 5 kez sonike edilir. Lipid karışımı 1 çiş bir süre için 4 ° C sıcaklıkta saklanırk.

4. Bio-Boncuk hazırlanması

1. Yaklaşık 10-15 ml (kuru cilt) Bio-Boncuk 50 ml'lik bir tüp yerleştirilir.
2. Boncuklar art arda% 100 metanol,% 95 etanol, milliQ _H2O, ve son olarak da TS tamponu (iki defa her biri), 50 ml ile yıkanır.
3. Yıkanmış boncuklar 4 saklanır ° C ~ 10 ml tampon içinde TS.

5. Nanodisc Sulandırma

1. MSP ~ 7 mg / ml (~ 0.3 mM) nihai konsantrasyonu TSGD tamponu içinde seyreltilir.
2. MSP: TSGD tampon içinde 1:3:60 veya 1:3:400 lipid oranının saflaştırılmış MalFGK ₂ kompleks ~ 2 nmol bir protein karıştırılmıştır. Nihai konsantrasyon 6 uM MalFGK _2, 18 uM, 360 uM MSP lipidler (1:3:60) ya da 2.4 mM lipidler (1:3:400) 'dir. Son hacim 300 ul olup. Nihai DDM konsantrasyonu% 0.08 (~ 1.6 mM) 'dir. Gliserol nihai konsantrasyon lipit miktarına bağlı olarak değişir, ancak ilave etrafında% 5-10 v / v kalır ~ Bio-boncuk süspansiyonu 50 ul tüpüne ilave edilir ve karışım, 4 ° C'de bir sallanan bir masa üzerinde bir gece inkübe edilir
3. Boncuklar yerçekimi ile sedimente edilir ve çözelti, mümkün olduğu kadar çok Biyo-Boncuk önlemek için dar bir ucu ile pipetle konulur.
4. Çökelek Büyük 20 dakika için 100,000 x g ultra-santrifüj ile çıkarılır. Diskler TSG10 tampon içinde adım 2.4 'de olduğu gibi, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılır. Diskleri ihtiva eden fraksiyonlar bir araya getirilmiştir ve bir kısım hazırlanması kararlılık test etmek için aynı jel süzme sütunu üzerine, yeniden enjekte edilmelidir.
5. Saflaştırılmış disklerin uzun bir süre -70 ° C'de saklanabilir. Buz üzerinde eritme sonra, diskler, potansiyel çökeltileri uzaklaştırmak için adım 5.5 gibi ultra-santrifüj tabi tutulmalıdır. Bir kısım önemli agregasyonu veya yağış çözdürme sırasında meydana vermedi sağlamak için jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilmelidirsüreç.

6. Yerli Jel Elektroforezi

1. Nanodiscs 1 uM (~ 0.2 mg / ml) ile sulandırma (Şekil 3A) kalitesini ölçmek için doğal PAGE ^{6, 7} (Tris-HCl, pH 8.8,% 4-12) ile analiz edilir.
2. _2-kompleks MalFGK için erkek bağlayıcı (1 uM) nanodiscs yılında yeniden yapılandırılmış, ayrıca yerel-PAGE (Şekil 3A) tarafından değerlendirilir.
3. Elektroforez sonra, jel 10 dakika için Coomassie mavisi ile boyandı, ve ~ 1 saat boyunca destained.

7. Dinamik ışık saçılımı (DLS)

1. Nanodiscs 0.1 ml / dak 'lık bir akış hızında, bir Superdex 200 HR 10/300 kolonu kullanılarak TSG10 tampon içinde adım 2.4' de olduğu gibi, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılır. Nanodiscs ihtiva eden fraksiyonlar toplanmış ve bir Amicon santrifüj filtre ile yaklaşık 10 mg / ml 'ye konsantre edilmiştir.
2. Örnek kullanarak DLS ile analizden önce (0.22 mikron filtre) iki kez filtre edilirBir 1 ul iç hacmi kuvars küvetine bir Dynapro nanostar enstrüman (Wyatt Technology). Veriler, çap ve parçacıkların moleküler ağırlığı tahmin etmek DİNAMİK yazılım (Wyatt Technology) ile monte edilir.

8. ATPaz Ölçümleri

1. MalFGK _{2-Sulandırılan} nanodiscs arasında ATPaz aktivitesi kolorimetrik ⁸ kullanılarak belirlenir.
2. Saflaştırıldı diskleri ve 1 mM ATP 1 uM, 20 dakika boyunca erkek ve 37 ° C de inkübe artan miktarları ile karıştırılır. Inorganik fosfat sürümü 660 nm'de ölçülür.
3. Serbest fosfat miktarı, bir fosfor Standart çözelti ile oluşturulan standart bir eğri ile karşılaştırılmıştır.

9. Temsilcisi Sonuçlar

Nanodiscs jel filtrasyon kromatografisi (Şekil 2A, sol) ile arıtılır. Kromatogramı göstermektedir ki sulandırılmış d çoğunluğuISCS (siyah iz) tek bir zirve olarak elute, oysa aşırı lipid (kırmızı iz) boşluk hacminde elute olan ve geniş zirveleri bir dizi olarak yapılmış diskler. Nanodiscs kalitesi daha fazla doğal jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılması spektroskopisi (DLS) ile analiz edilir. Lipidlerin aşırı varlığında Sulandırılan bu bir smear (Şekil 2A, sağ) olarak göç ise Düzgün Sulandırılan diskler jel üzerinde keskin bir bant olarak göç ederler. DLS disk ile analiz nüfus 11.4 nm (Şekil 2B), bir ortalama çapa sahip homojen olduğunu göstermektedir. Sulandırılan DLS disk yaklaşım esas 215 kDa bir görünür moleküler ağırlığa sahiptir. Aşırı lipid varlığında sulandırılmış Örnekler yaygın olarak homojen olmayan örnekler için tipik olan, 100 nm yarı çapları etrafında dağıtılmış ekranı.

MalFGK ₂ kompleksinin kalitesi ATPaz tarafından yerli jel elektroforezi ve faaliyet değerlendirilirölçümleri (Şekil 3). Maltoz bağlayıcı protein Erkek MalFGK ₂ taşıyıcı ^{9, 10} yüksek afinite ile bağlanır. Kullanılması olmayan denatüre edici jel elektroforezi, erkek ve MalFGK ₂ (Şekil 3A) arasında bir kompleks tespit etmek mümkündür. Erkek Malk ₂ ATPaz aktivitesinin uyarılması Şekil 3B 'de gösterilmiştir.

Şekil 1. Sulandırma protokolü için tipik akış şeması.

Şekil 2. Nanodisc hazırlanması. A. Kalite Kontrol Veya yüksek yağ oranı (1/3/400; kırmızı iz); nanodiscs Jel filtrasyon analizi (Superdex 200 HR 10/300 sütun) düşük yağ oranı (siyah iz 1/3/60) de sulandırılır. Aynı diskin hazırlık Native jel elektroforezi. MolkDa yılında ecular ağırlığı işaretleri gösterilir. Aynı diskin hazırlanması B. Dinamik ışık saçılımı analiz. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. MalFGK _2-nanodisc parçacıklar analizi. C. Male jel kayma analizi MalFGK _2-nanodisc parçacıkların artan miktarlarda ile inkübe edildi. MalFGK B. ATPaz aktivitesi _2-nanodisc Erkek konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak parçacıklar.

Discussion

Biz nanodiscs içine maltoz taşıyıcı sulandırılması için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taşıyıcı ATPaz aktif ve çözünen bağlayıcı ortağı erkek ile etkileşim (Şekil 3) yeniden olabilir. Nanodiscs içine taşıyıcı başarılı rekonstitüsyon ek biyofiziksel ve biyokimyasal analiz için yolu açın. Özellikle ilgi Of Malk ATPaz ve deterjan maltoz taşımacılık faaliyeti, lipozom ve nanodiscs sistematik analiz olacaktır. ABC taşıyıcıları taşıma döngüsü sırasında konformasyonlar değiştirebilirsiniz ancak bu konformasyonel değişikliklere lipidlerin katkısı keşfedilmeyi beklemektedir.

Nanodisc bölgesinin yapımı oldukça basit, ancak optimum koşullar küçük sapmalar protein agregasyonu geri dönüşü olmayan yol olabilir. Lipidlerin aşırı miktarda productio yol açacaktır, çünkü yağ oranı: Bu yazıda, doğru bir proteinin seçmenin önemini vurgulamakn büyük polidispers lipozom benzeri parçacıkların nanodisc biyofiziksel yeterlilik yanıt vermez ki. Maltoz taşıyıcı (1/120 bizim analizimizde 1/20 ile karşılaştırıldığında) ve sulandırma için lipidler oranı ancak oluşan parçacıklar ^11'i karakterize değildi: Bir önceki analizde çok yüksek MSP istihdam. Herhangi bir durumda, dikkatli bir şekilde bu gibi ışık saçılması spektroskopisi, analitik ultra-santrifüj ya da daha basit, doğal jel elektroforezi gibi jel filtrasyon, başka teknikler kullanılarak sulandırılmış malzeme kalitesi analizi için çok önemlidir. Bu kalite kontrolünün önemi bacteriorhodopsin ve P-glikoprotein ¹² sulandırılması sırasında vurgulandı. Diğer iki parametre büyük ölçüde sulandırma başarısını etkileyebilir: 1) hedef membran proteinin saflık ve agrega ve membran proteini ve iskele protein arasındaki 2) doğru oranda olmaması. Buna ek olarak, fosfolipid tip I birleşmişnto disk, aynı zamanda zar proteini iskele uzunluğu, rekonstitüsyon verimini katkıda bulunabilir. Bu tür deterjan çözeltisi, tampon sistemi, ısı ile sulandırılması, zaman uzunluğu zar protein çözünürlük ve stabilite gibi diğer parametreler de sulandırıldıktan protokol optimize etmek için ayarlanması gerekebilir. Örneğin, farklı uzunluklarda zar iskele daha büyük bir zar proteinleri ya da protein kompleksleri zar protein oligomerleri sulandırılması yardımcı olabilir farklı boyutlarda ^1, nanodiscs üretirler.

Nanodisc başarıyla biyofiziksel yöntemler, SPR, ITC ve kantitatif metodoloji ile mücadele membran araştırma yardımcı olmak için floresans spektroskopisi ^12-16 ile kombine edilmiştir. Son zamanlarda, nanodisc iyi kapsama ve doğruluk ile membran proteini interactomes tanımlamak için yardım etmek kantitatif kütle spektrometresi ile kombine edilmiştir17. Aslında olmasına rağmen ilaç sanayi, membran proteinleri okuyan akademi veba aynı zorlukları ile sınırlı olduğunu, en sık reçete edilen ilaçlar hedef membran proteinleri (reseptörler, kanallar, nakil, sensörler). Bu nanodisc membran gömülü proteinler ile çalışmak ilaç tarama stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacağı tahmin edilebilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.