Summary
CHIRP技术是一种新型快速映射约束力的长非编码RNA基因组网站（lncRNAs）。该方法采用特异性的反义平铺寡核苷酸允许枚举的lncRNA绑定基因组站点的优势。
Abstract
长非编码RNA的染色质状态的关键调节剂量补偿，压印和发育的基因表达1,2,3,4,5,6,7，如重要的生物过程。最近发现的成千上万的在特定的染色质修饰复合物，如多梳镇压复杂2（PRC2），的关联lncRNAs与介导的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3），建议在管理中的特定基因的染色质状态的众多lncRNAs广泛的角色时尚8,9。虽然一些lncRNAs被认为在邻近基因的顺，其他lncRNAs工作的反式调节基因的远亲位于。例如， 果蝇 lncRNAs roX1和roX2绑定的雄性细胞的X染色体上的许多地区，是至关重要的剂量补偿10,11。然而，他们的结合位点的确切位置，不知道在高分辨率。同样，人类的lncRNA热风可以影响对H PRC2占用基因的全基因组3,12,13，但特异性是如何实现的undreds目前还不清楚。 LncRNAs也可以作为模块化脚手架，聘请多蛋白质复合物的组装。经典反义RNA支架是TERC的RNA，由于复杂的14端粒酶模板和脚手架;热风也可以作为一个PRC2脚手架和H3K4的去甲基复杂的13。
此前的研究显示映射在染色的RNA占用大量的见解15,16，但只有一次一个单一的基因位点。占用网站的大多数lncRNAs的是不知道，和染色质调控lncRNAs的角色大多已推断的lncRNA扰动的间接影响。正如染色质免疫芯片或深度测序（芯片的芯片或芯片SEQ，分别）大大改善了我们的基因组规模的蛋白质-DNA相互作用的理解，在这里我们说明了recenTLY出版策略映射在高分辨率17长的RNA入住的全基因组。基于这种方法，通过RNA纯化（CHIRP）（ 图1），染色质隔离亲和力捕捉目标lncRNA：染色质复杂，由平铺反义寡核苷酸，然后生成基因组结合位点的地图，在几百基地的决议高灵敏度和低背景。 CHIRP是适用于许多lncRNAs因为亲和探针的设计是简单的RNA序列，并要求没有RNA的结构或功能域的知识。
Protocol
1。探针设计
CHIRP设计反义DNA瓦片目标RNA的选择性检索的探针。
- 设计反义寡核苷酸探针在网上探头设计师singlemoleculefish.com 18。
- 使用这些参数：探头= 1探针/ 100 bp的RNA的长度; 2）目标GC％= 45; 3）寡核苷酸长度= 20; 4）间隔长度= 60-80。如果太长的设计师闯入段的RNA。省略重复或广泛的同源性区域。
- 为了反义DNA探针在3总理结束BiotinTEG。
- 根据自己的位置沿RNA标记探针。他们分成两个游泳池，使“甚至”池包含所有探头的编号2，4，6，等“奇”池包含探针编号1，3，5，等到100微米的浓度和稀释的探针池储存于-20°C
- 所有的实验都进行两个游泳池，对方的内部控制。真正的RNA依赖的信号会从目前两个池，而探头的噪音会是唯一的每个池。这适用于CHIRP-qPCR和啁啾SEQ。
2。收获细胞
收集细胞CHIRP实验将使用。
- 生长在细胞组织培养板或汇合瓶。冲洗用磷酸盐缓冲液（PBS）和trypsinize。淬火胰蛋白酶与媒体的2倍量，吸起来，撞出细胞和悬浮成单细胞悬液。所有媒体和再悬浮细胞转移到50毫升猎鹰管。 20亿个细胞通常足够一CHIRP样品。
- 在800RCF 4分钟旋转细胞。抽吸媒体和40毫升的PBS重悬40万个细胞，如果有必要结合管。在800RCF 4分钟旋转细胞。倒出PBS，小心吸的角度上剩余的液体。 3。交联细胞，收集细胞沉淀
- 在室温下执行的所有步骤。
- 1％的戊二醛在室温PBS准备。准备10毫升，每10万细胞（0.4毫升25％戊二醛股票+ 9.6毫升PBS）。戊二醛必须使用新鲜。
- 点选底部猎鹰管撞出颗粒。重悬细胞沉淀在1％的戊二醛，具有体积小，以避免块开始，然后补足全量。反相混合。在室温下10分钟架桥月底到年底摇床或旋转。
- 快速为5分钟，在室温下甘氨酸1.25米的十分之一体积的交联反应。
- 在2000RCF离心5分钟。冷藏20毫升PBS一次，在2000RCF纺纱5分钟，吸上清和洗颗粒。
- 吸和悬浮在W灰化，交联颗粒与1毫升冷PBS每20万个细胞。每毫升转移到Eppendorf管和自旋为3分钟，4℃枪头删除尽可能多的PBS尽可能仔细2000RCF。
- 闪光冻结在-80在液氮和存储单元颗粒°C间下去。
- 在室温下解冻冷冻细胞颗粒。点击驱逐和混合细胞沉淀。自旋向下沉淀在2000RCF 3分，在4°C用锋利的10μL枪头，以消除任何剩余的PBS。
- 在电子天平（精确到1毫克）皮的空Eppendorf管的质量（我们管重1.060克，非常一致）。权衡每个颗粒，并记录其重量。交联的HeLa细胞整整15厘米的菜通常重100毫克。
- 补编裂解液（10X球团矿质量，如1毫升100毫克）与FRESĤ蛋白酶抑制剂PMSF和Superase中（见附件缓冲区列表）。拌匀。
- 10X量补充裂解液加入每管和悬浮颗粒。对于小颗粒<25毫克，250μL补充裂解液中悬浮。暂停应光滑。如果没有，分为500μL等分的悬挂和使用机动颗粒搅拌机打破团块。立即着手超声。
- 超声在15毫升猎鹰管细胞裂解Bioruptor。使用<1.5毫升裂解，每管和更快的超声，超声时间不超过两管。
- 超声在4℃最高设置30秒的水洗澡ON，OFF脉冲间隔45秒。检查裂解液每30分钟。继续超声分散，不再浑浊，直到细胞裂解。这可能要花费少则30分钟，多达4个小时。数量管，样本量，水浴温度，超声时间内将影响这个过程需要多久。超声管可能会在不同的利率，使他们凝聚在一起，每30分钟重新分配到原管，确保同质化。注：戊二醛交联细胞采取显着更长的时间比甲醛等值超声。
- 当裂解变为清晰，5μL的裂解转移到一个新的Eppendorf管中。加入90μL的DNA蛋白酶K（PK），缓冲区（缓冲区列表）和5μL的PK。旋涡混合后短暂离心。孵育45分钟，在50°C。
- Qiagen公司的PCR纯化试剂盒提取的DNA。洗脱在30μL的Qiagen公司的洗脱缓冲液（EB）的DNA和1％琼脂糖凝胶电泳检查DNA的大小。如果大量的DNA涂抹100-500基点，超声是完整的。如果没有，继续超声。
- 离心10分钟的超声波处理样品在16100RCF 4°C。结合上清，分装成1毫升样品和闪光冻结液体nitrogeN。储存在-80°C。
- 在室温解冻的染色质管。
- 准备杂交缓冲区（缓冲区列表，准备染色毫升，每2毫升）。涡旋混合。
- 对于一个典型的的CHIRP使用裂解液1毫升的样品，取出10μLRNA输入和10μL的Eppendorf管中的DNA INPUT和地方。保持在冰上，直到进一步利用。
- 1毫升染色质转移至15毫升的猎鹰管。杂交缓冲液中加入2毫升每管。总体积为<1.5毫升，使用Eppendorf管。
- 在室温下解冻探头。检查数量，如果你不使用它在很长一段时间（100微米探针的NanoDrop探头规格〜500-600 ng /μl的单链DNA的设置）。具体管（100 pmol探针染色每1毫升，1μL100 pmol /μL的每1毫升染色探头）探头适当的音量。拌匀。在37℃孵育4小时用颤抖。
- 随着杂交余下的20分钟，准备的C-1磁珠（储存在4°C）。使用100μL的探头，每100 pmol。 1毫升unsupplemented裂解缓冲液洗三次，使用从缓冲区的DynaMag-2磁铁带单独的珠子。
- 原体积的裂解液重悬珠;与新鲜PMSF，有价证券和Superase在补充。经过4小时的杂交反应完成后，每管加100μL珠。拌匀。在37°C孵育30分钟用颤抖。
- 准备洗净的缓冲区，每个样品（5毫升）。涡旋混合。预温至37°C。使用前加入PMSF。
- 用1毫升洗涤缓冲五倍珠。在第一次洗，使用-15 DynaMag磁条单独的珠子，倒出，并重新悬浮在洗涤缓冲液1毫升。传输量1.5 mL的Eppendorf管中。在37°C孵育5分钟摇晃。
- 在随后的洗涤，离心管上每一个minicentrifuge，设置的DynaMag-2 1分钟的磁条上的样本。倒出样品，在洗涤缓冲液1毫升悬浮1 Kimwipe的，任何水滴擦拭。在37°C孵育5分钟摇晃。重复5个总清洗。
- 在最后一次洗涤，悬浮珠。取出100μL和RNA分离作废。储备900μLDNA的分数。放在DynaMag-2磁条所有的管子和删除洗缓冲区。后短暂离心管放在磁铁带。用锋利的10μL枪头完全删除最后的洗涤缓冲位。
- 以100μL，珠样品和10μLRNA输入采样。加入85μL的RNA PK缓冲液pH 7.0的RNA输入。在95μL，RNA的PK缓冲液pH 7.0重悬珠。在50°C加入5μL，Proteinease K和孵育45分钟月底到年底晃动。
- 简单地降速所有的管子，煮沸10分钟的热块样品在95°C。
- 冷藏在冰样品，加入500μL的TRIzol试剂，涡旋大力，持续10秒。在室温下孵育10分钟。贮存于-80°C或继续执行步骤4。
- 加入100μL氯仿TRIZOL处理的样品。涡大力，持续10秒。在4°C为15分钟的台式离心机上旋转在16100RCF
- 删除〜400μL水上清液，避免有机和接口。
- 加入600μL（1.5卷）100％的乙醇，并拌匀。旋转样品通过MIRNeasy迷你列。与RWT的（MIRNeasy迷你包），每制造商的协议的视网膜色素上皮2X 1X洗。与30μL无核酸酶H 2 O（NFH 2）洗脱。
- 对待每制造商的协议无 DNA的RNA洗脱液。反应完成后，样本加热15分钟，在65°C至完全灭活任何剩余的DNA酶。
- 使用1μL，RNA的分离定量RT-PCR分析，每口井，以确认lncRNA检索。 GAPDH的经常被用来作为阴性对照。
- 准备DNA洗脱缓冲液（见缓冲区列表），每个样品150μL，包括DNA输入。
- 新增10μLRNA酶A（10毫克/毫升）和每毫升DNA洗脱缓冲液10μL，核糖核酸酶H（10 U /μL），涡旋混合。
- 悬浮每个样品150μL核糖核酸酶与DNA洗脱缓冲液珠。 （重悬在140μLDNA输入）在37℃孵育30分钟用颤抖。
- 单独的珠子和上清DynaMag-2磁条。除去上清液，加入标记的试管。
- 准备第二等份的DNA洗脱缓冲液10μL的RNA酶A（10毫克/毫升）和，RNaseH（10的U /μL）8.2完全一样做）。加入150μL，每个样品（包括DNA输入），孵育，弃上清。收集所有的上清液（建议立即进行删除D是〜300μL）。
- 加入15μLPK每个样品。在50°C孵育45分钟用颤抖。
- 前降速黄色锁相凝胶管（5PRIME）的。锁相凝胶管转移的DNA样本，并添加300μLPhOH：每个样品异戊：氯仿。大力摇晃10分钟，并在16100RCF 5分钟的台式离心机上旋转，在4°C采取水从顶部（约300μL）。新增3 GlycoBlue微升，30μL的醋酸钠，和900μL100％的乙醇。混合和储存在-20°C过夜。
- 旋转16100RCF样品在4°C. 30分钟
- 小心倒出上清液。加入1毫升70％乙醇，涡旋混合。在16100RCF离心5分钟。取出上清液，用吸管。空气干燥1分钟。悬浮在30μL的光大。
- DNA样本分析每Illumina的协议的高通量测序库的qPCR或准备就绪。
交联戊二醛保存RNA的染色质相互作用，并准备细胞沉淀收集细胞。
4。细胞裂解
裂解交联细胞准备细胞裂解。
5。超声
通过超声分散交联细胞裂解物的剪切DNA的。
6。 CHIRP
杂交生物素标记的DNA探针，RNA和隔离结合的染色质。
7。 RNA分离
QRT-PCR定量从CHIRP样本中提取的RNA部分。
8。 DNA提取
从啁啾样品中提取DNA的部分，经测序，以确定或由定量PCR定量。
10。代表结果
图1 图2显示了人类端粒酶RNA（TERC）从HeLa细胞中GAPDH的，丰富的，可作为阴性对照细胞RNA的富集。执行CHIRP拉低TERC的RNA（〜88％）在细胞中的大部分，而只有0.46％的GAPDH RNA检索，展示〜200倍的富集因子。针对LacZ基因的RNA，这是不是在哺乳动物细胞中表达（ 图2），探针，如非特异性探针，可以用来作为额外的阴性对照。
通常富集负地区的qPCR测量时，预计到绑定目标lncRNA的DNA区域。 图3显示四个热风的方向在小学人包皮成纤维细胞的网站，我们通过在同一细胞系的CHIRP SEQ中确定的定量PCR验证，而TERC和GAPDH的DNA位点本身RVE作为阴性对照地区。两个“甚至”和“奇”探头设置产生了负面的地区，真正的lncRNA结合位点的一个标志，预计热风绑定网站可比富集。
啁啾丰富的DNA高通量测序产生的全球地图lncRNA结合位点。 果蝇的lncRNA roX2是与X染色体交互方式在剂量补偿的要求。 图4显示了一个X染色体的部分roX2约束力的文件。两个“甚至”和“奇”的样品已测序和其独特的声音已被淘汰，产生重叠信号的轨道。每一个“高峰期”，在这里表示强烈的roX2约束力的网站。完整的跟踪和列表roX2靶基因已在楚等人2011 17。
图1。的CHIRP多项式的流程图dure。染色质交联lncRNA： 在体内生物素蛋白加合物平铺探测是杂交lncRNA目标，和染色质复合物使用磁链亲和素磁珠纯化，通过严格的清洗。我们洗脱lncRNA结合的DNA或蛋白质的核糖核酸酶A和H鸡尾酒lncRNA一个假定的结合序列，在橙系统化。 2011年以前在楚等出版。17
图2。CHIRP丰富，为人类TERC的RNA。 TERC asDNA探头撷取〜蜂窝TERC RNA不到GAPDH的88％。 LacZ基因的asDNA探针作为阴性对照和检索既不的RNA。平均值±SD所示。 2011年以前在楚等出版。17
图3。热风CHIRP-qPCR的首要人权埃斯金的成纤维细胞。NFKBIA，HOXD3-4，SERINC5和ABCA2的与热风进行交互的地区。TERC和GAPDH服务作为阴性对照。平均值±SD所示。 2011年以前在楚等出版。17
图4。CHIRP roX2的RNA-seq的数据在SL2 果蝇细胞。 “即使”和“奇”分别进行测序，他们的数据合并，以反映都只有普通的山峰。合并后的轨道。 2011年以前在楚等出版。17
Discussion
在这里，我们介绍了CHIRP-seq技术， 在体内 lncRNA的全基因组结合位点的映射方法。成功的关键参数是平铺的寡核苷酸探针和戊二醛交联的分裂池。亲和探针的设计是简单的RNA序列，无需事先的RNA的结构或功能域的知识。三个相当不同的两个物种的RNA - - 我们与roX2，TERC和热风的成功表明，啁啾seq是可能推广到许多lncRNAs。与所有的实验，护理和适当的控制是需要解释的结果。不同的的lncRNA可能需要滴定的条件，和明智变化的条件，如选择不同的亲和探针或交联剂，可突出RNA的染色质相互作用的不同方面。芯片-seq的一样，并不是所有的绑定事件是必然的功能，需要更多的研究来确定ØRNA的生物后果ccupancy的染色质。尽管如此，我们预计其他的染色相关lncRNAs的，目前在数以万计的数字8,9的研究人员的这项技术的许多有趣的应用程序。正如芯片SEQ打开门的全基因组DNA-蛋白质相互作用的探索，“RNA相互作用组”的CHIRP-SEQ研究的可能揭示生物的许多新的途径。
Disclosures
C.楚和HY张被命名为基于这种方法的专利申请的发明人。
Acknowledgments
我们感谢T.红，三菱商事。蔡O.庄园，E.西格尔，M.黑田东彦，T. Swigut，一讨论Shestopalov。新加坡（CC），国立卫生研究院以R01 CA118750和以R01-HG004361（HYC），加州再生医学研究所（HYC）科学，技术和研究机构的支持。 HYC是霍华德·休斯医学研究所的早期职业科学家。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer List: | |||
| Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 °C. | |||
| Lysis Buffer: | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 10 mM EDTA 1% SDS Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads |
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| Proteinase K Buffer (for DNA) | |||
| 100 mM NaCl 10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 1 mM EDTA 0.5% SDS Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use |
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| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl 1% SDS 50 mM Tris-Cl pH 7.0 1 mM EDTA 15% formamide (store in the dark at 4 °C) Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use |
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| Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 0.5% SDS Always add PMSF fresh before use |
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| DNA elution Buffer | |||
| 50 mM NaHCO3 1% SDS |
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| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma-Aldrich | G5882-10x10ml | |
| Motorized pellet mixer | VWR international | V8185-904 | |
| Protease inhibitor | Roche Group | 11873580001 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Superase-in | Ambion | AM2696 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 | |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-25G | |
| DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
| Rnase H | Epicentre Biotechnologies | R0601K | |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 | |
| Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Glycine | JT Baker | 4057-06 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 | |
| Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| 10% SDS | Invitrogen | 15553-027 | |
| DNA-free | Ambion | AM1906 | |
| Buffer kit | Ambion | AM9010 | |
| Formamide | Invitrogen | 15515-026 | |
References
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