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Biology

RNA纯化的染色质隔离(CHIRP)

doi: 10.3791/3912 Published: March 25, 2012

Summary

CHIRP技术是一种新型快速映射约束力的长非编码RNA基因组网站(lncRNAs)。该方法采用特异性的反义平铺寡核苷酸允许枚举的lncRNA绑定基因组站点的优势。

Abstract

长非编码RNA的染色质状态的关键调节剂量补偿,压印和发育的基因表达1,2,3,4,5,6,7,如重要的生物过程。最近发现的成千上万的在特定的染色质修饰复合物,如多梳镇压复杂2(PRC2),的关联lnc​​RNAs与介导的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3),建议在管理中的特定基因的染色质状态的众多lncRNAs广泛的角色时尚8,9。虽然一些lncRNAs被认为在邻近基因的顺,其他lncRNAs工作的反式调节基因的远亲位于。例如, 果蝇 lncRNAs roX1和roX2绑定的雄性细胞的X染色体上的许多地区,是至关重要的剂量补偿10,11。然而,他们的结合位​​点的确切位置,不知道在高分辨率。同样,人类的lncRNA热风可以影响对H PRC2占用基因的全基因组3,12,13,但特异性是如何实现的undreds目前还不清楚。 LncRNAs也可以作为模块化脚手架,聘请多蛋白质复合物的组装。经典反义RNA支架是TERC的RNA,由于复杂的14端粒酶模板和脚手架;热风也可以作为一个PRC2脚手架和H3K4的去甲基复杂的13。

此前的研究显示映射在染色的RNA占用大量的见解15,16,但只有一次一个单一的基因位点。占用网站的大多数lncRNAs的是不知道,和染色质调控lncRNAs的角色大多已推断的lncRNA扰动的间接影响。正如染色质免疫芯片或深度测序(芯片的芯片或芯片SEQ,分别)大大改善了我们的基因组规模的蛋白质-DNA相互作用的理解,在这里我们说明了recenTLY出版策略映射在高分辨率17长的RNA入住的全基因组。基于这种方法,通过RNA纯化(CHIRP)( 图1),染色质隔离亲和力捕捉目标lncRNA:染色质复杂,由平铺反义寡核苷酸,然后生成基因组结合位点的地图,在几百基地的决议高灵敏度和低背景。 CHIRP是适用于许多lncRNAs因为亲和探针的设计是简单的RNA序列,并要求没有RNA的结构或功能域的知识。

Protocol

1。探针设计

CHIRP设计反义DNA瓦片目标RNA的选择性检索的探针。

  1. 设计反义寡核苷酸探针在网上探头设计师singlemoleculefish.com 18。
  2. 使用这些参数:探头= 1探针/ 100 bp的RNA的长度; 2)目标GC%= 45; 3)寡核苷酸长度= 20; 4)间隔长度= 60-80。如果太长的设计师闯入段的RNA。省略重复或广泛的同源性区域。
  3. 为了反义DNA探针在3总理结束BiotinTEG。
  4. 根据自己的位置沿RNA标记探针。他们分成两个游泳池,使“甚至”池包含所有探头的编号2,4,6,等“奇”池包含探针编号1,3,5,等到100微米的浓度和稀释的探针池储存于-20°C
  5. 所有的实验都进行两个游泳池,对方的内部控制。真正的RNA依赖的信号会从目前两个池,而探头的噪音会是唯一的每个池。这适用于CHIRP-qPCR和啁啾SEQ。

2。收获细胞

收集细胞CHIRP实验将使用。

  1. 生长在细胞组织培养板或汇合瓶。冲洗用磷酸盐缓冲液(PBS)和t​​rypsinize。淬火胰蛋白酶与媒体的2倍量,吸起来,撞出细胞和悬浮成单细胞悬液。所有媒体和再悬浮细胞转移到50毫升猎鹰管。 20亿个细胞通常足够一CHIRP样品。
  2. 在800RCF 4分钟旋转细胞。抽吸媒体和40毫升的PBS重悬40万个细胞,如果有必要结合管。在800RCF 4分钟旋转细胞。倒出PBS,小心吸的角度上剩余的液体。
  3. 3。交联细胞,收集细胞沉淀

    交联戊二醛保存RNA的染色质相互作用,并准备细胞沉淀收集细胞。

    1. 在室温下执行的所有步骤。
    2. 1%的戊二醛在室温PBS准备。准备10毫升,每10万细胞(0.4毫升25%戊二醛股票+ 9.6毫升PBS)。戊二醛必须使用新鲜。
    3. 点选底部猎鹰管撞出颗粒。重悬细胞沉淀在1%的戊二醛,具有体积小,以避免块开始,然后补足全量。反相混合。在室温下10分钟架桥月底到年底摇床或旋转。
    4. 快速为5分钟,在室温下甘氨酸1.25米的十分之一体积的交联反应。
    5. 在2000RCF离心5分钟。冷藏20毫升PBS一次,在2000RCF纺纱5分钟,吸上清和洗颗粒。
    6. 吸和悬浮在W灰化,交联颗粒与1毫升冷PBS每20万个细胞。每毫升转移到Eppendorf管和自旋为3分钟,4℃枪头删除尽可能多的PBS尽可能仔细2000RCF。
    7. 闪光冻结在-80在液氮和存储单元颗粒°C间下去。

    4。细胞裂解

    裂解交联细胞准备细胞裂解。

    1. 在室温下解冻冷冻细胞颗粒。点击驱逐和混合细胞沉淀。自旋向下沉淀在2000RCF 3分,在4°C用锋利的10μL枪头,以消除任何剩余的PBS。
    2. 在电子天平(精确到1毫克)皮的空Eppendorf管的质量(我们管重1.060克,非常一致)。权衡每个颗粒,并记录其重量。交联的HeLa细胞整整15厘米的菜通常重100毫克。
    3. 补编裂解液(10X球团矿质量,如1毫升100毫克)与FRESĤ蛋白酶抑制剂PMSF和Superase中(见附件缓冲区列表)。拌匀。
    4. 10X量补充裂解液加入每管和悬浮颗粒。对于小颗粒<25毫克,250μL补充裂解液中悬浮。暂停应光滑。如果没有,分为500μL等分的悬挂和使用机动颗粒搅拌机打破团块。立即着手超声。

    5。超声

    通过超声分散交联细胞裂解物的剪切DNA的。

    1. 超声在15毫升猎鹰管细胞裂解Bioruptor。使用<1.5毫升裂解,每管和更快的超声,超声时间不超过两管。
    2. 超声在4℃最高设置30秒的水洗澡ON,OFF脉冲间隔4​​5秒。检查裂解液每30分钟。继续超声分散,不再浑浊,直到细胞裂解。这可能要花费少则30分钟,多达4个小时。数量管,样本量,水浴温度,超声时间内将影响这个过程需要多久。超声管可能会在不同的利率,使他们凝聚在一起,每30分钟重新分配到原管,确保同质化。注:戊二醛交联细胞采取显着更长的时间比甲醛等值超声。
    3. 当裂解变为清晰,5μL的裂解转移到一个新的Eppendorf管中。加入90μL的DNA蛋白酶K(PK),缓冲区(缓冲区列表)和5μL的PK。旋涡混合后短暂离心。孵育45分钟,在50°C。
    4. Qiagen公司的PCR纯化试剂盒提取的DNA。洗脱在30μL的Qiagen公司的洗脱缓冲液(EB)的DNA和1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA的大小。如果大量的DNA涂抹100-500基点,超声是完整的。如果没有,继续超声。
    5. 离心10分钟的超声波处理样品在16100RCF 4°C。结合上清,分装成1毫升样品和闪光冻结液体nitrogeN。储存在-80°C。

    6。 CHIRP

    杂交生物素标记的DNA探针,RNA和隔离结合的染色质。

    1. 在室温解冻的染色质管。
    2. 准备杂交缓冲区(缓冲区列表,准备染色毫升,每2毫升)。涡旋混合。
    3. 对于一个典型的的CHIRP使用裂解液1毫升的样品,取出10μLRNA输入和10μL的Eppendorf管中的DNA INPUT和地方。保持在冰上,直到进一步利用。
    4. 1毫升染色质转移至15毫升的猎鹰管。杂交缓冲液中加入2毫升每管。总体积为<1.5毫升,使用Eppendorf管。
    5. 在室温下解冻探头。检查数量,如果你不使用它在很长一段时间(100微米探针的NanoDrop探头规格〜500-600 ng /μl的单链DNA的设置)。具体管(100 pmol探针染色每1毫升,1μL100 pmol /μL的每1毫升染色探头)探头适当的音量。拌匀。在37℃孵育4小时用颤抖。
    6. 随着杂交余下的20分钟,准备的C-1磁珠(储存在4°C)。使用100μL的探头,每100 pmol。 1毫升unsupplemented裂解缓冲液洗三次,使用从缓冲区的DynaMag-2磁铁带单独的珠子。
    7. 原体积的裂解液重悬珠;与新鲜PMSF,有价证券和Superase在补充。经过4小时的杂交反应完成后,每管加100μL珠。拌匀。在37°C孵育30分钟用颤抖。
    8. 准备洗净的缓冲区,每个样品(5毫升)。涡旋混合。预温至37°C。使用前加入PMSF。
    9. 用1毫升洗涤缓冲五倍珠。在第一次洗,使用-15 DynaMag磁条单独的珠子,倒出,并重新悬浮在洗涤缓冲液1毫升。传输量1.5 mL的Eppendorf管中。在37°C孵育5分钟摇晃。
    10. 在随后的洗涤,离心管上每一个minicentrifuge,设置的DynaMag-2 1分钟的磁条上的样本。倒出样品,在洗涤缓冲液1毫升悬浮1 Kimwipe的,任何水滴擦拭。在37°C孵育5分钟摇晃。重复5个总清洗。
    11. 在最后一次洗涤,悬浮珠。取出100μL和RNA分离作废。储备900μLDNA的分数。放在DynaMag-2磁条所有的管子和删除洗缓冲区。后短暂离心管放在磁铁带。用锋利的10μL枪头完全删除最后的洗涤缓冲位。

    7。 RNA分离

    QRT-PCR定量从CHIRP样本中提取的RNA部分。

    1. 以100μL,珠样品和10μLRNA输入采样。加入85μL的RNA PK缓冲液pH 7.0的RNA输入。在95μL,RNA的PK缓冲液pH 7.0重悬珠。在50°C加入5μL,Proteine​​ase K和孵育45分钟月底到年底晃动。
    2. 简单地降速所有的管子,煮沸10分钟的热块样品在95°C。
    3. 冷藏在冰样品,加入500μL的TRIzol试剂,涡旋大力,持续10秒。在室温下孵育10分钟。贮存于-80°C或继续执行步骤4。
    4. 加入100μL氯仿TRIZOL处理的样品。涡大力,持续10秒。在4°C为15分钟的台式离心机上旋转在16100RCF
    5. 删除〜400μL水上清液,避免有机和接口。
    6. 加入600μL(1.5卷)100%的乙醇,并拌匀。旋转样品通过MIRNeasy迷你列。与RWT的(MIRNeasy迷你包),每制造商的协议的视网膜色素上皮2X 1X洗。与30μL无核酸酶H 2 O(NFH 2)洗脱。
    7. 对待每制造商的协议 DNA的RNA洗脱液。反应完成后,样本加热15分钟,在65°C至完全灭活任何剩余的DNA酶。
    8. 使用1μL,RNA的分离定量RT-PCR分析,每口井,以确认lncRNA检索。 GAPDH的经常被用来作为阴性对照。

    8。 DNA提取

    从啁啾样品中提取DNA的部分,经测序,以确定或由定量PCR定量。

    1. 准备DNA洗脱缓冲液(见缓冲区列表),每个样品150μL,包括DNA输入。
    2. 新增10μLRNA酶A(10毫克/毫升)和每毫升DNA洗脱缓冲液10μL,核糖核酸酶H(10 U /μL),涡旋混合。
    3. 悬浮每个样品150μL核糖核酸酶与DNA洗脱缓冲液珠。 (重悬在140μLDNA输入)在37℃孵育30分钟用颤抖。
    4. 单独的珠子和上清DynaMag-2磁条。除去上清液,加入标记的试管。
    5. 准备第二等份的DNA洗脱缓冲液10μL的RNA酶A(10毫克/毫升)和,RNaseH(10的U /μL)8.2完全一样做)。加入150μL,每个样品(包括DNA输入),孵育,弃上清。收集所有的上清液(建议立即进行删除D是〜300μL)。
    6. 加入15μLPK每个样品。在50°C孵育45分钟用颤抖。
    7. 前降速黄色锁相凝胶管(5PRIME)的。锁相凝胶管转移的DNA样本,并添加300μLPhOH:每个样品异戊:氯仿。大力摇晃10分钟,并在16100RCF 5分钟的台式离心机上旋转,在4°C采取水从顶部(约300μL)。新增3 GlycoBlue微升,30μL的醋酸钠,和900μL100%的乙醇。混合和储存在-20°C过夜。
    8. 旋转16100RCF样品在4°C. 30分钟
    9. 小心倒出上清液。加入1毫升70%乙醇,涡旋混合。在16100RCF离心5分钟。取出上清液,用吸管。空气干燥1分钟。悬浮在30μL的光大。
    10. DNA样本分析每Illumina的协议的高通量测序库的qPCR或准备就绪。

    10。代表结果

    图1 图2显示了人类端粒酶RNA(TERC)从HeLa细胞中GAPDH的,丰富的,可作为阴性对照细胞RNA的富集。执行CHIRP拉低TERC的RNA(〜88%)在细胞中的大部分,而只有0.46%的GAPDH RNA检索,展示〜200倍的富集因子。针对LacZ基因的RNA,这是不是在哺乳动物细胞中表达( 图2),探针,如非特异性探针,可以用来作为额外的阴性对照。

    通常富集负地区的qPCR测量时,预计到绑定目标lncRNA的DNA区域。 图3显示四个热风的方向在小学人包皮成纤维细胞的网站,我们通过在同一细胞系的CHIRP SEQ中确定的定量PCR验证,而TERC和GAPDH的DNA位点本身RVE作为阴性对照地区。两个“甚至”和“奇”探头设置产生了负面的地区,真正的lncRNA结合位点的一个标志,预计热风绑定网站可比富集。

    啁啾丰富的DNA高通量测序产生的全球地图lncRNA结合位点。 果蝇的lncRNA roX2是与X染色体交互方式在剂量补偿的要求。 图4显示了一个X染色体的部分roX2约束力的文件。两个“甚至”和“奇”的样品已测序和其独特的声音已被淘汰,产生重叠信号的轨道。每一个“高峰期”,在这里表示强烈的roX2约束力的网站。完整的跟踪和列表roX2靶基因已在楚等人2011 17。

    图1。
    图1。的CHIRP多项式的流程图dure。染色质交联lncRNA: 在体内生物素蛋白加合物平铺探测是杂交lncRNA目标,和染色质复合物使用磁链亲和素磁珠纯化,通过严格的清洗我们洗脱lncRNA结合的DNA或蛋白质的核糖核酸酶A和H鸡尾酒lncRNA一个假定的结合序列,在橙系统化。 2011年以前在楚出版。17

    图2。
    图2。CHIRP丰富,为人类TERC的RNA。 TERC asDNA探头撷取〜蜂窝TERC RNA不到GAPDH的88%。 LacZ基因的asDNA探针作为阴性对照和检索既不的RNA。平均值±SD所示。 2011年以前在楚出版。17

    图3。
    图3。热风CHIRP-qPCR的首要人权埃斯金的成纤维细胞。NFKBIA,HOXD3-4,SERINC5和ABCA2的与热风进行交互的地区。TERCGAPDH服务作为阴性对照。平均值±SD所示。 2011年以前在楚出版。17

    图4。
    图4。CHIRP roX2的RNA-seq的数据在SL2 果蝇细胞。 “即使”和“奇”分别进行测序,他们的数据合并,以反映都只有普通的山峰。合并后的轨道。 2011年以前在楚出版。17

Discussion

在这里,我们介绍了CHIRP-seq技术, 在体内 lncRNA的全基因组结合位点的映射方法。成功的关键参数是平铺的寡核苷酸探针和戊二醛交联的分裂池。亲和探针的设计是简单的RNA序列,无需事先的RNA的结构或功能域的知识。三个相当不同的两个物种的RNA - - 我们与roX2,TERC和热风的成功表明,啁啾seq是可能推广到许多lncRNAs。与所有的实验,护理和适当的控制是需要解释的结果。不同的的lncRNA可能需要滴定的条件,和明智变化的条件,如选择不同的亲和探针或交联剂,可突出RNA的染色质相互作用的不同方面。芯片-seq的一样,并不是所有的绑定事件是必然的功能,需要更多的研究来确定ØRNA的生物后果ccupancy的染色质。尽管如此,我们预计其他的染色相关lncRNAs的,目前在数以万计的数字8,9的研究人员的这项技术的许多有趣的应用程序。正如芯片SEQ打开门的全基因组DNA-蛋白质相互作用的探索,“RNA相互作用组”的CHIRP-SEQ研究的可能揭示生物的许多新的途径。

Disclosures

C.楚和HY张被命名为基于这种方法的专利申请的发明人。

Acknowledgments

我们感谢T.红,三菱商事。蔡O.庄园,E.西格尔,M.黑田东彦,T. Swigut,一讨论Shestopalov。新加坡(CC),国立卫生研究院以R01 CA118750和以R01-HG004361(HYC),加州再生医学研究所(HYC)科学,技术和研究机构的支持。 HYC是霍华德·休斯医学研究所的早期职业科学家。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 °C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Glutaraldehyde (EM grade) Sigma-Aldrich G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer VWR international V8185-904
Protease inhibitor Roche Group 11873580001
PMSF Sigma-Aldrich 78830
Superase-in Ambion AM2696
Bioruptor Diagenode UCD-200
Falcon tubes (for sonication) Corning 430790
Proteinase K Ambion AM2546
PCR purification kit Qiagen 28106
C-1 magnetic beads Invitrogen 65002
PMSF Sigma-Aldrich P7626-25G
DynaMag-15 magnet Invitrogen 123-01D
DynaMag-2 magnet Invitrogen 123-21D
MIRNeasy mini kit Qiagen 217004
Rnase H Epicentre Biotechnologies R0601K
Rnase A Sigma-Aldrich R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy 5 PRIME 2302810
Trizol Invitrogen 15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl Invitrogen 15593-031
Chloroform Ricca RSOC0020-1C
GlycoBlue Ambion AM9515
Glycine JT Baker 4057-06
PBS, pH 7.4 Invitrogen 10010-049
Elution Buffer (EB) Qiagen 19086
20x SSC Invitrogen 15557-036
10% SDS Invitrogen 15553-027
DNA-free Ambion AM1906
Buffer kit Ambion AM9010
Formamide Invitrogen 15515-026

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References

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Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). J. Vis. Exp. (61), e3912, doi:10.3791/3912 (2012).More

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